原發(fā)性高血壓人群中抗AT1受體自身抗體與AGTR1基因多態(tài)性及單倍型分析①

孫艷香 朱 峰 廖玉華 陶 軍 袁 勇 王 敏

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院高血壓血管病科，廣州510080)

高血壓是一種具有多因素參與的臨床病理過程，其中包括心肌收縮功能、循環(huán)血容量、水鹽調(diào)節(jié)、外周血管彈性及血管內(nèi)皮功能等。近年來，炎癥和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制在高血壓的發(fā)生中也顯示出越來越重要的作用，尤其是對抗AT1受體自身抗體(AT1-AAs)在難治性高血壓、原發(fā)性高血壓(Essential hypertension，EH)及妊高癥中病理生理機(jī)制的研究[1-4]。AT1-AAs與AT1受體結(jié)合后激動其胞內(nèi)信號分子，具有類似血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)樣作用[5，6]。而該自身抗體的產(chǎn)生可能存在多方面的原因，可能與血壓增高血管應(yīng)切力增加致血管內(nèi)皮損害自身抗原暴露;同時也有研究報道，AT1-AAs的產(chǎn)生可能伴有AT1受體的上調(diào)有關(guān)，而AT1受體的表達(dá)則受其受體基因等的控制[3]。因此本文在此基礎(chǔ)上假設(shè)AT1受體基因(AGTR1)的突變或多態(tài)性與AT1-AAs產(chǎn)生相關(guān)，對AGTR1中單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(Single-nucleotide polymorphisms，SNPs)進(jìn)行選取并分析，并進(jìn)一步闡明EH中AT1-AAs產(chǎn)生及存在個體差異的原因。

1 資料與方法

1.1 研究對象 隨機(jī)收取我院心內(nèi)科住院登記EH患者394例，經(jīng)抗體陰性和陽性分組，并收集患者一般臨床資料。高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1999年WHO/ISH高血壓防治指南[7]。所有患者經(jīng)病史、體檢、超聲心動圖及實驗室檢查，排除各種心肌病、心臟瓣膜病及繼發(fā)性高血壓病和伴有嚴(yán)重威脅生命疾病的病例。

1.2 研究方法

1.2.1 多肽抗原的制備及血清抗體檢測 采用固相多肽合成法，用PSSM-8型多肽自動合成儀(日本SHIMADZU公司)，合成具有抗原決定簇的AT1受體胞外第二環(huán)肽段[8]。AT1受體肽段氨基酸序列為His-Trp-Ile-His-Arg-Asn-Val-Phe-Phe-Ile-Glu-Asn-Ile-Thr-Val-Cys-Ala-Phe-His-Tyr-Glu-Ser-Gln-Asn-Ser-Thr-Leu。同時利用本實驗室建立的ELISA方法檢測血清中 AT1-AAs滴度[8]。

1.2.2 基因組DNA的抽提 EH患者血液經(jīng)離心后取600 μl血細(xì)胞，利用 TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒，按其步驟提取細(xì)胞基因組DNA。

1.2.3 AGTR1多態(tài)性位點(diǎn)選取 選取5個SNPs位點(diǎn):rs1492078、rs12721226、rs1064533、rs5186 和rs380400。Hapmap數(shù)據(jù)庫中顯示 rs12721226與rs1064533是為位于AGTR1基因3號外顯子上的非同義SNP;另外，有報道在高加索人群和非裔美國人群中rs5186和 rs380400是標(biāo)簽性 SNP，即Tag-SNP位點(diǎn)，且與高血壓的發(fā)生有一定的聯(lián)系[9]。而rs1492078則位于AT1受體基因AGTR1啟動子區(qū)域[10]。上述位點(diǎn)的突變或這其多態(tài)性可能影響AT1受體的表達(dá)。所選人群中每個SNP位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡。

1.2.4 SNP的檢測及分析 利用連接酶檢測反應(yīng)(Ligase detection reaction，LDR)的原理即高溫連接酶一旦檢測到DNA與互補(bǔ)的兩條寡聚核苷酸接頭對應(yīng)處存在著基因點(diǎn)突變類型的堿基錯配[11]，則連接反應(yīng)就不能進(jìn)行這個優(yōu)點(diǎn)，我們進(jìn)行多重PCR獲得含有待檢測突變位點(diǎn)的基因片段，然后進(jìn)行多重LDR(每個SNPs檢測體系中均含有帶熒光的通用探針，位于其位點(diǎn)下游，可與未發(fā)生錯配的產(chǎn)物連接)，最后通過測序儀電泳讀取檢測結(jié)果。其具體實驗步驟及反應(yīng)體系可參照本課題以往實驗內(nèi)容[12]，各多態(tài)性位點(diǎn)對應(yīng)的PCR引物及LDR探針見表1～2。所檢測的5個SNPs位點(diǎn)分別先兩兩進(jìn)行連鎖分析，兩兩間連鎖不平衡程度以連鎖不平衡系數(shù)D'表示，如果高度連鎖(即D'＞0.8)，那么就只選擇其中一個作為單倍型標(biāo)簽SNP(htSNP)[13]。

表1 含多態(tài)位點(diǎn)PCR所對應(yīng)的引物序列Tab．1 Primer sequence of PCR with SNPs

表2 多態(tài)位點(diǎn)對應(yīng)的探針序列Tab.2 Probe sequence of DNA fragment with SNPs

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 基因表型頻率采用基因計數(shù)法計算，用SHEsis在線分析軟件進(jìn)行單倍型分析及連鎖不平衡分析[14]，分析其與AT1-AAs產(chǎn)生關(guān)聯(lián)時通過logistic回歸校正協(xié)同變量。EH抗體陽性組和抗體陰性組的比較采用χ2檢驗，計量資料的統(tǒng)計用t檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 按AT1-AAs陰性和陽性分組后，兩組間患者性別、年齡及高血壓常見合并癥、吸煙史等差異無統(tǒng)計學(xué)意義;而高血壓家族史及病程在兩組間具有統(tǒng)計差異(P＜0.05)，在分析AGTR1基因多態(tài)性與自身抗體產(chǎn)生關(guān)系時即將兩者作為協(xié)同變量進(jìn)行校正。同時，抗體陽性組患者入院時平均收縮壓較陰性組高，且P值為0.053接近統(tǒng)計學(xué)差異。其余相關(guān)資料統(tǒng)計見表3。

2.2 多重PCR及LDR產(chǎn)物測序結(jié)果 圖1中是16份基因組DNA多重PCR后跑膠圖，每個孔可見多條目的條帶，其中包含本基因AGTR1中5個SNP位點(diǎn)分別為 rs12721226、rs380400、rs5186、rs1064533以及rs1492078所對應(yīng)引物的PCR產(chǎn)物。圖2則是包含上述5個SNPs經(jīng)LDR后測序代表圖，其中紅色為測序標(biāo)準(zhǔn)樣品，藍(lán)色代表所檢測樣本，峰值處對應(yīng)的即為多態(tài)位點(diǎn)。

表3 EH患者AT1-AAs陽性組與陰性組臨床資料Tab.3 Clinical data in EH according to AT1-AAS

2.3 AT1-AAs與 AGTR1基因型及單倍型的關(guān)系 按抗體陰陽性分組，所選的5個SNP位點(diǎn)單點(diǎn)等位基因型頻率兩組間無統(tǒng)計學(xué)差異。進(jìn)行單倍型分析并進(jìn)行協(xié)同變量校正后，發(fā)現(xiàn)單倍型[A-G-T-AT]與AT1-AAs的產(chǎn)生呈正性關(guān)聯(lián)(P=0.027，OR=1.432);而單倍型[G-G-T-C-T]與 AT1-AAs的產(chǎn)生則呈負(fù)相關(guān)(P=0.014，OR=0.244)，見表4。

2.4 各SNPs連鎖及htSNP分析 5個SNPs位點(diǎn)分別先兩兩進(jìn)行連鎖分析表明，s12721226及rs1064533與除自身以外的各SNPs均呈高度連鎖。而rs1492078、rs5186及rs380400間連鎖程度低，即選取連鎖程度低的3個SNPs作為htSNPs而代表基因AGTR1的一組遺傳標(biāo)記并進(jìn)行單倍型分析，其中單倍型[A-A-T]、[G-C-T]與 AT1-AAs的產(chǎn)生分別呈正性和負(fù)性關(guān)聯(lián) (P＜0.05)，見表5。

圖1 7份DNA樣本多重PCR后產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The SDS-PAGE of 7 DNA samples by multiple PCR Ntoe:The PCR products of else SNPs are included.

圖2 多重LDR后測序圖Fig.2 Sequencing of DNA fragment with SNPs by LDR

表4 抗AT1-AAs陽性組和陰性組間基因單倍型分析結(jié)果Tab.4 The analysis of haplotypes according to AT1-AAS

表5 含htSNP單倍型與AT1-AAs的關(guān)系Tab.5 The correlation between the haplotypes with htSNP and AT1-AAs

3 討論

原發(fā)性高血壓患者血清中AT1-AAs檢出率明顯高于正常人，且AT1-AAs作用于AT1受體后有類似于AngII的激動性效應(yīng)，因此它可能是高血壓免疫病理機(jī)制中不容忽視的一種分子。而該自身抗體的產(chǎn)生可能存在多方面的原因[5，6，8，15]。近年來，免疫機(jī)制在原發(fā)性高血壓發(fā)病中的研究越來越多，其中關(guān)于自身抗體的產(chǎn)生也有相關(guān)的報道[16，17]，如病毒損傷或高血壓血管應(yīng)切力增加加之血管彈性下降后致自身抗原暴露，通過分子模擬機(jī)制導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的發(fā)生等，然而這些都不足以解釋自身抗體產(chǎn)生具有個體性差異的特性，且正常血壓人群中也存在一定的比例的AT1-AAs。另外，已有報道表明AGTR1的表達(dá)上調(diào)參與心臟移植后免疫調(diào)節(jié)及移植排斥反應(yīng)[18];同時AT1-AAs的產(chǎn)生可能與 AT1受體上調(diào)相關(guān)[3]。因此本研究則從AT1受體基因即AGTR1方面來研究其與AT1-AAs產(chǎn)生的關(guān)系，而進(jìn)一步從基因遺傳的角度來探討AT1-AAs產(chǎn)生個體差異的機(jī)制。

單倍型即指一條染色體區(qū)域中所有相關(guān)聯(lián)的SNP等位基因的集合，且單倍型更能敏感地反應(yīng)某一人群中該基因與某種疾病或某一因子間的關(guān)系，而htSNPs即指構(gòu)建樣本單體型或進(jìn)行與相關(guān)分析所必需的一組遺傳標(biāo)記(SNP)[19]。本研究結(jié)果顯示基因AGTR1中所篩選的5個SNPs中所有單點(diǎn)基因型頻率與AT1-AAs的表達(dá)間無相關(guān)性;而單倍型[A-G-T-A-T]、[G-G-T-C-T]分別與 AT1-AAs的產(chǎn)生呈正性和負(fù)性關(guān)聯(lián)。分析上述單倍型后發(fā)現(xiàn)第2、3位置兩個SNPs均以[G-T]表型參與單倍型構(gòu)成，進(jìn)一步進(jìn)行兩兩 SNPs間連鎖分析后表明，上述兩SNPs與除自身以外的各SNPs均呈高度連鎖，因此加以剔除后篩取htSNPs。從而為我們分析該基因與AT1-AAs關(guān)系時，簡化了對單倍型或SNPs的檢測。同時結(jié)果也表明，含 htSNPs的單倍型[A-AT]、[G-C-T]與AT1-AAs的產(chǎn)生分別呈正性和負(fù)性關(guān)聯(lián)。因此表明AGTR1與AT1-AAs的產(chǎn)生間存在關(guān)聯(lián)性，從而從基因易感的角度來解釋和闡明了AT1-AAs產(chǎn)生具有個體差異的原因。而上述單倍型是否增加或抑制AT1受體的上調(diào)或使受體結(jié)構(gòu)的改變、自身免疫抗原表達(dá)而誘導(dǎo)或抑制自身抗體的產(chǎn)生等，則有待于進(jìn)一步研究證實。

另外，入院基礎(chǔ)收縮壓比較，AT1-AAs陽性組高于陰性組但兩者并無顯著統(tǒng)計學(xué)差異，說明AT1-AAs不一定致血壓升高或高血壓發(fā)生，但可能是血壓維持的重要因素之一，因此在難治性高血壓中具有較高的檢出率。

原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜而自身抗體并不是高血壓形成和發(fā)展的唯一原因，而血壓的增高可能是抗體產(chǎn)生的重要環(huán)境因素之一。同時，本文首次闡述了AT1-AAs產(chǎn)生與其受體基因AGTR1間的關(guān)聯(lián)性，從而從基因多態(tài)性的角度闡述了EH患者中AT1-AAs產(chǎn)生的流行病學(xué)機(jī)制，更好地解釋AT1-AAs表達(dá)出現(xiàn)個體差異的原因。

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