橄欖葉提取物對大鼠急性炎癥和痛覺過敏的研究

耿成燕，宮德正，姜麗平，曹 軍，Hiroyuki Yoshimura，仲來福*

1大連醫(yī)科大學(xué)中日合作醫(yī)藥科學(xué)研究所，大連116044，2日本衛(wèi)材株式會社食品與化學(xué)部，東京103-0027

橄欖葉提取物對大鼠急性炎癥和痛覺過敏的研究

耿成燕1，宮德正1，姜麗平1，曹 軍1，Hiroyuki Yoshimura2，仲來福1*

1大連醫(yī)科大學(xué)中日合作醫(yī)藥科學(xué)研究所，大連116044，2日本衛(wèi)材株式會社食品與化學(xué)部，東京103-0027

本文采用鹿角菜膠誘導(dǎo)的大鼠急性炎癥模型觀察橄欖葉提取物(OLE)的抗炎與鎮(zhèn)痛作用及對致炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達。用鹿角菜膠注射到大鼠右后足內(nèi)，分別于鹿角菜膠注射前30 min和注射后120 min灌胃給予OLE 100、250和500 mg/kg體重。鹿角菜膠處理后測量足跖腫脹度及痛域。用RT-PCR檢測足跖墊內(nèi)組織TNF-α、IL-1β和IL-10的mRNA表達。結(jié)果顯示，經(jīng)灌胃給予OLE100、250和500 mg/kg體重，均能明顯降低大鼠后足腫脹度，增加痛域，并明顯降低致炎因子TNF-α和IL-1β的mRNA表達。本研究提示OLE具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，其作用機制可能與抑制TNF-α和IL-1β的mRNA表達有關(guān)。

橄欖葉提取物、痛域、腫脹度、鹿角菜膠、炎癥、大鼠

橄欖屬木樨科，常綠闊葉喬木，又名洋橄欖、齊新果。歐洲原產(chǎn)，我國引種，多栽培于長江以南。橄欖葉提取物(olive leaves extract，OLE)是從橄欖葉中提取的天然酚類物質(zhì)，它不僅有非常強的抗氧化作用［1］，而且能抗動脈粥樣硬化及預(yù)防癌癥［2］，也有學(xué)者報道，它具有降血壓、抗微生物等作用［3］。

最近研究表明，橄欖植物水提物能明顯降低脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)處理的人單核細胞系(THP-1)和細胞腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的產(chǎn)量［4］。但迄今為止，OLE對鹿角菜膠處理大鼠急性炎癥和痛覺過敏的作用，還未見文獻報道。本研究的目的在于觀察OLE對急性炎癥和痛覺過敏的防治作用及其可能機制。

1 實驗材料

1.1 藥品及試劑

受試物OLE由日本國Eisai食品與化學(xué)有限公司(日本國東京市)提供，其組分及含量為糖類占67%、羥基酪醇22%、其他多酚2%、脂質(zhì)2%、灼燒殘渣4%和水1%。鹿角菜膠為Sigma公司產(chǎn)品。試劑盒購自日本TakaRa公司。

1.2 實驗動物

清潔級4周齡雄性Sprague Dawley大鼠(由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證號:遼實動質(zhì)字［2000］028號)，其初始體重為148～163 g，控制室溫(22±2)℃，相對濕度40%～60%，室內(nèi)12 h光亮，12 h黑暗。動物自由攝食與飲水7 d，使其適應(yīng)環(huán)境并檢疫。

1.3 實驗儀器

YLS-3E電子壓痛儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站)、RT-PCR儀(Thermo Electron Co，美國)。

2 實驗方法

2.1 動物分組

按體重將大鼠隨機分為5組，模型對照組、陽性對照組、OLE 100，250，500 mg/kg體重組，每組10只動物。OLE組分別于鹿角菜膠處理前30 min和處理后120 min灌胃給予相應(yīng)劑量的OLE。模型對照組灌胃給予相同容量的蒸餾水，陽性對照組腹腔注射給予嗎啡12.5 mg/kg體重

2.2 大鼠急性炎癥模型建立

給藥后30 min，采用注射λ-鹿角菜膠誘發(fā)大鼠急性炎癥，其方法如下:動物經(jīng)戊巴比妥鈉(30 mg/ kg體重)腹腔注射麻醉后，常規(guī)消毒右后足足墊部位，然后用7號注射針向大鼠的右后足足墊部位注入2.0%(W/V)鹿角菜膠0.1 mL，按摩5 min。

2.3 足跖腫脹度測量

誘發(fā)急性炎癥后210、240、270 min，用容積測量法測定每組大鼠的左右后肢足跖體積(mL)，計算足跖腫脹度(%)。

2.4 痛域的測定

痛域的檢測是按照Randall and Selifto’s的方法，使用YLS-3E電子壓痛儀儀進行痛域測定。為防止機械損傷，機械壓力控制在400 g以內(nèi)，并在痛域測定前2 d對各組大鼠進行訓(xùn)練。試驗時，在給予受試物前，對每組動物進行基礎(chǔ)痛域測定。每組動物在鹿角菜膠處理后210、240、270 min，測定其痛域。

2.5 致炎組織細胞因子mRNA表達的分析

隨機選取空白對照組、模型對照組和OLE 500 mg/kg體重組各5只動物，在鹿角菜膠處理后270 min處死動物，無菌條件下取大鼠右后足跖墊內(nèi)組織，采用Trizol法制備總RNA，制備的RNA樣品用核酸定量分析儀檢測OD260、OD260/OD280的值，并計算RNA產(chǎn)量。采用RT-PCR試劑盒(TaKaRa產(chǎn)品)合成cDNA，使用20 μl體系進行PCR擴增反應(yīng)，β-actin作為內(nèi)參，TNF-α、IL-1β和IL-10的引物序列見表1。反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性1 min，反應(yīng)30個循環(huán)，每循環(huán)包括97℃變性20 s、TNF-α和IL-1β 60℃退火20 s，IL-10和β-actin 58℃退火20 s、72℃延伸20 s，最后一個循環(huán)72℃保溫10 min。擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml EB)電泳，紫外燈下觀察結(jié)果并照相。采用BioImaging systems凝膠成像系統(tǒng)(UVP，labworksTM，ver 4.6)計算其灰度值，結(jié)果用與β-actin的灰度值的比值表示。

表1 用于實時PCR分析的引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR analysis

3 統(tǒng)計方法

4 實驗結(jié)果

4.1 OLE對大鼠右后足跖腫脹度的影響

各組大鼠足跖腫脹度:結(jié)果如表2所示。給予各組大鼠不同藥物后，嗎啡組大鼠右后足跖腫脹度明顯小于模型對照組，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜ 0.01)。OLE 100、250 mg/kg和500 mg/kg體重組大鼠右后足跖腫脹度明顯小于模型對照組，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 OLE對鹿角菜膠誘發(fā)急性炎癥模型大鼠右后爪腫脹程度的影響Table 2 Effects of OLE on degree of right hind paw swelling in carrageenan-induced acute inflammation model in rats

4.2 OLE對鹿角菜膠誘導(dǎo)的大鼠痛覺過敏的影響

結(jié)果如表3所示。嗎啡組痛域均超過400 g，表明嗎啡具有明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。OLE 100、250 mg/kg和500 mg/kg體重組在鹿角菜膠處理后210、240、 270 min的痛域明顯高于模型對照組，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)。表明OLE能明顯抑制鹿角菜膠誘導(dǎo)的痛覺過敏。

表3 OLE對鹿角菜膠引起的大鼠痛覺過敏的影響Table 3 Effects of OLE on carrageenan-induced hyperalgesia in rats

圖1 鹿角菜膠誘發(fā)炎癥的大鼠右后爪組織細胞因子mRNA表達(OLE處理與未處理組)Fig.1 mRNA expression of cytokines in carrageenaninduced inflamed right paw tissue of rats with or without OLE pretreatment

4.3 OLE對致炎組織細胞因子mRNA表達的影響

結(jié)果如圖1和圖2所示。鹿角菜膠能促進致炎因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達，與正常對照組比較，其差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。OLE能明顯降低由鹿角菜膠誘導(dǎo)的細胞因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達，與模型對照組的差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，但抗炎因子IL-10 mRNA的表達，與模型對照組之間未見具有統(tǒng)計學(xué)意義的差別(P﹥0.05)。

5 討論

本研究結(jié)果顯示灌胃給予大鼠OLE能明顯減輕鹿角菜膠誘導(dǎo)的大鼠右后足跖腫脹度，并首次發(fā)現(xiàn)OLE能抑制鹿角菜膠引起的痛覺過敏。

圖2 OLE對鹿角菜膠誘發(fā)炎癥的大鼠右后爪組織細胞因子mRNA表達的影響Fig.2 Effect of OLE on mRNA expression of cytokines in carrageenan-induced inflamed right paw tissue of rats

OLE作為藥用已經(jīng)持續(xù)了幾個世紀(jì)，具有殺菌和對抗真菌的作用［5］，還具有增加巨噬細胞功能和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用［6］。OLE是一個混合成分，包括多酚、油橄欖苦素和羥基酪醇等，OLE的活性成分主要來自這些酚類化合物［7］。

有研究證實細胞因子調(diào)節(jié)中性粒細胞遷移到炎癥發(fā)生的部位，抗炎細胞因子IL-10可下調(diào)這一過程［8］。在動物試驗和人的炎癥中觀察到TNF-α、IL-1β能調(diào)節(jié)中性粒細胞參與炎癥發(fā)生，IL-10能抑制炎癥刺激誘導(dǎo)的中性粒細胞的遷移［9］。為了證實OLE是否具有抑制致炎細胞因子的產(chǎn)生或增加抗炎因子的作用，我們觀察OLE對致炎組織細胞因子mRNA表達的效應(yīng)。試驗結(jié)果顯示，OLE不僅抗炎和鎮(zhèn)痛效應(yīng)，而且能抑制TNF-α、IL-1β的表達，但IL-10的表達無作用，抗炎細胞因子IL-10的增加有平衡致炎因子的作用，事實上，對由鹿角菜膠引起的炎癥，IL-10的作用非常有限［10］。OLE對其他細胞因子是否有作用，有待于進一步的研究證實。

鹿角菜膠不僅誘導(dǎo)局部組織炎癥，而且能使系統(tǒng)血細胞產(chǎn)生反應(yīng)。鹿角菜膠預(yù)處理可使LPS誘導(dǎo)白細胞生成TNF-α的作用更明顯［11］。在這個模型中OLE能明顯減少TNF-α，后者是可活化巨噬細胞和促進炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子［12］。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制TNF-α的產(chǎn)生或用TNF-α的抗體處理，對炎癥性疾病的治療都是有效的［13］。

目前研究已經(jīng)證實OLE具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，它可能對人類的炎癥疾病有預(yù)防和治療作用，也可能作為炎癥疾病治療的補充，減少致炎細胞因子促進炎癥的作用。本研究結(jié)果提示，OLE具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用，其作用機制可能與抑制 TNF-α、IL-1β mRNA的表達有關(guān)。

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Effects of OLE on Carrageenan-induced Acute Inflammation and Hyperalgesia in Rats

GENG Cheng-yan1，GONG De-zheng2，JIANG Li-ping1，CAO Jun1，Yoshimura Hiroyuki2，ZHONG Lai-fu1*1China-Japanese Joint Institute for Medical and Pharmaceutical Science，Dalian Medical University.No.9，West Segment of South Lvshun Road，Dalian 116044，China;2Eisai Food＆Chemical Co.，Ltd，Nihonbashi，chuo-ku，Tokyo 103-0027，Japan

The aim of this study was to assess the inhibitory role of olive leaves extract(OLE)on carrageenan-induced swelling and hyperalgesia of rat paw.Paw inflammation was assessed by the increase in paw volume and hyperalgesia.The levels of the tumor necrosis factor alpha(TNF-α)，interleukin 1β(IL-1β)and interleukin 10(IL-10)mRNA in the tissue of right paw were estimated by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).The results showed that the paw pressure thresholds of rats orally administered OLE significantly increased the degree swelling of right hind paw showed a statistically significant reduction，compared with rats in model control.OLE decreased expression of pro-inflammatory cytokines IL-1β and TNF-α.mRNA The results of the study suggest that OLE could have anti-inflammatory and anti-hyperalgesic effects and the mechanisms of these effects may be involved in inhibition of TNF-α and IL-1β mRNA expression.

Olive leaves extract(OLE);hyperalgesia;swelling;carrageenan;inflammation;rat

1001-6880(2011)05-0931-04

2010-09-02 接受日期:2011-04-14

*通訊作者 Tel:86-411-86110286;E-mail:zhong@dlmedu.edu.cn

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