茶多酚對(duì)稻瘟病菌的抑制作用及抑菌機(jī)理

汪金蓮，邱業(yè)先，扶教龍，韓 俊，馮 穩(wěn)

蘇州科技學(xué)院化生學(xué)院，蘇州215009

茶多酚對(duì)稻瘟病菌的抑制作用及抑菌機(jī)理

汪金蓮，邱業(yè)先*，扶教龍，韓 俊，馮 穩(wěn)

蘇州科技學(xué)院化生學(xué)院，蘇州215009

用不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌進(jìn)行抑菌和抑菌機(jī)理研究。結(jié)果表明，不同濃度的茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)具有很強(qiáng)的抑制作用。隨著茶多酚濃度的增加，其抑制作用增強(qiáng)，其中5.00 mg/mL和10.00 mg/mL抑制效果最好，其抑制率高達(dá)100%，且分生孢子畸形，細(xì)胞破裂，原生質(zhì)外溢。其作用機(jī)理主要是破壞菌體的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，抑制CAT、POD酶活，使其喪失細(xì)胞膜的屏障和酶系的保護(hù)功能，最終導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)受到抑制或死亡。

茶多酚;稻瘟菌;抑制作用;抑菌機(jī)理

稻瘟病是全世界稻區(qū)危害最嚴(yán)重的水稻病害，也是我國(guó)水稻三大病害之一，病害流行地區(qū)，一般減產(chǎn)10%～20%，重的可達(dá)40%～50%，特別嚴(yán)重的田塊造成絕收［1］。目前，水稻抗瘟性品種的利用和化學(xué)農(nóng)藥的使用仍是防治稻瘟病行之有效的措施，但因抗瘟品種的單一化、稻瘟病菌生理小種遺傳的復(fù)雜性和致病性的多樣性以及化學(xué)農(nóng)藥的毒性和病原菌的抗藥性，水稻抗瘟性品種和化學(xué)農(nóng)藥使用在生產(chǎn)上都受到一定的限制［2］。為此，稻瘟病生物農(nóng)藥的研究與開發(fā)是水稻生產(chǎn)中亟待解決的問題。而植物源農(nóng)藥最能體現(xiàn)生物防治的特點(diǎn)，它不僅不會(huì)造成環(huán)境污染，不易使病菌產(chǎn)生抗藥性，為人們提供更安全更高效的生防途徑，而且植物源農(nóng)藥還具有種植廣泛，取材容易，成本較低等特點(diǎn)，近年來日益受到人們的重視。茶多酚(tea-polyphenols)是茶葉中提取的酚類化合物，屬植物源農(nóng)藥，具有以上特點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于茶多酚的研究主要以茶多酚的藥理、病理、毒理學(xué)以及茶多酚的保顏、保鮮、及除臭作用為主［3］，經(jīng)查閱大量文獻(xiàn)證明，茶多酚對(duì)病原細(xì)菌尤其對(duì)醫(yī)學(xué)和食品致病細(xì)菌研究較多，證明茶多酚對(duì)病原細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用［3-6］，而茶多酚對(duì)植物病原真菌抑制作用尤其是不同濃度的茶多酚對(duì)植物病原真菌抑制作用及機(jī)理的研究報(bào)道甚少。我們?cè)谥参镫迕敢种苿┑暮Y選工作中，發(fā)現(xiàn)茶多酚具有較強(qiáng)的抑制土壤脲酶和土壤真菌的作用［7-9］。本研究旨用不同濃度茶多酚對(duì)植物病原真菌稻瘟病菌進(jìn)行抑菌和抑菌機(jī)理實(shí)驗(yàn)，其目的是探究茶多酚對(duì)植物病原真菌稻瘟菌抑制作用及作用機(jī)理，以期篩選出最佳抑菌濃度和揭示其作用機(jī)理，為稻瘟病的生物防治和新型的植物源農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)方面開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茶多酚(Tea-polyphenols TP)為市售金龍公司產(chǎn)品，含量為50%。EDTA、PVPP、PBS、KH2PO4、愈創(chuàng)木酚、H2O2等。

1.1.2 供試菌種和培養(yǎng)基

稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav)，由江蘇農(nóng)科院提供。用時(shí)在PSA平板上預(yù)培養(yǎng)6 d。培養(yǎng)基為PSA固體培養(yǎng)基和PS液體培養(yǎng)基［10］

1.2 方法

1.2.1 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

抑制菌絲生長(zhǎng)速率法［11］:用無菌水配成100.00、50.00、33.30、25.00、20.00 mg/mL茶多酚母液。設(shè)茶多酚平板濃度為10.00、5.00、3.33、2.5、2.00 mg/mL共5種濃度梯度，無菌水為對(duì)照(CK)，共6個(gè)處理。在滅菌培養(yǎng)皿中分別加入5種對(duì)應(yīng)濃度的茶多酚母液1 mL，對(duì)照(CK)加等量無菌水，將冷卻至45℃左右的PSA培養(yǎng)基9 mL倒入各培養(yǎng)皿中，立即輕輕搖勻后，待凝固成平板，即為設(shè)定的10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL濃度。用打孔器打取稻瘟病菌菌落邊緣生長(zhǎng)旺盛的菌圓片(φ9 mm)，各挑取一塊移入對(duì)應(yīng)平板中間，每處理3個(gè)重復(fù)。置25℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d，觀察、測(cè)量各處理的菌落直徑并攝影，計(jì)算菌落平均直徑和平均抑菌率。并用鄧肯法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)［12］。

1.2.2 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)抑制的形態(tài)變化

方：除了您對(duì)圖書館學(xué)碩士學(xué)位點(diǎn)建設(shè)作出了積極貢獻(xiàn)以外，您對(duì)學(xué)生也是真情付出、關(guān)愛有加。為此，學(xué)生們都心存感激，在他們心中，您是一名非常值得敬重的研究生導(dǎo)師。能談?wù)勀谥笇?dǎo)研究生方面的心得體會(huì)嗎？

懸滴法［11］:設(shè)茶多酚濃度為10.00、5.00、3.33、2.00 mg/mL共4種濃度梯度，無菌水為對(duì)照(CK)，共5個(gè)處理。將稻瘟病菌培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子后，分別配成以上不同濃度的茶多酚孢子懸浮液，對(duì)照(CK)用無菌水配制，每視野15～20個(gè)孢子，每處理3個(gè)重復(fù)，置25℃恒溫箱內(nèi)懸滴培養(yǎng)12 h，顯微觀察各處理的孢子萌發(fā)形態(tài)變化并顯微攝影。

1.2.3 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌膜透性的影響

電導(dǎo)法［11，13］:用滅好菌的打孔器在生長(zhǎng)旺盛的菌落邊緣以同心圓方式打菌圓片(φ9 mm)，各取1片菌圓片放入10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL的不同濃度茶多酚PS液體培養(yǎng)基(50 mL錐形瓶裝20 mL培養(yǎng)基)中，25℃ 130 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，以培養(yǎng)基(PS)內(nèi)不加茶多酚為對(duì)照，每天取各處理發(fā)酵培養(yǎng)液10 mL直接讀取電導(dǎo)率值，每處理重復(fù)3次。計(jì)算各處理2 d之間電導(dǎo)率的變化值并繪制曲線。

1.2.4 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌CAT、POD酶的影響［11］

在250 mL錐形瓶?jī)?nèi)加入80 mL液體培養(yǎng)基PS和8.89 mL不同濃度的茶多酚母液，配成濃度為10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL的茶多酚PS液體培養(yǎng)基。對(duì)照CK(80 mL液體培養(yǎng)基加8.89 mL無菌水)。用滅好菌的打孔器在生長(zhǎng)旺盛的菌落邊緣以同心圓方式打菌圓片(φ9 mm)，取1片菌圓片放入不同處理的PS液體培養(yǎng)基內(nèi)，25℃130 r/min恒搖床培養(yǎng)7 d。每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4.1 過氧化氫酶(CAT)酶活測(cè)定

紫外吸收法［11，14］:設(shè)茶多酚為 10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL共5個(gè)濃度梯度。每濃度各取2 mL培養(yǎng)液加6 mL樣品提取液冰鎮(zhèn)研磨成勻漿，3000 r/min離心20 min后取4 mL上清液，加1 mL反應(yīng)液稀釋10倍于常溫25℃反應(yīng)10 min后馬上于240 nm處測(cè)紫外吸光值。對(duì)照(CK)中加入1 mL反應(yīng)液、4 mL 150 mmol/L PBS(pH7.5)。每處理3個(gè)重復(fù)。設(shè)每min減少0.001 A240為一個(gè)CAT活力單位(U)。

1.2.4.2 過氧化物酶(POD)酶活測(cè)定

可見光吸收法［11，14］:設(shè)茶多酚為10.00、5.00、3.33、2.50、2.00 mg/mL共5個(gè)濃度梯度。每濃度各取2 mL培養(yǎng)液加4 mL樣品提取液冰鎮(zhèn)研磨成勻漿，4000 r/min離心15 min后取1 mL上清液，加3 mL反應(yīng)液于常溫25℃反應(yīng)5 min后馬上于470 nm處測(cè)可見吸光值。對(duì)照(CK)中加入3 mL反應(yīng)液、1 mL 100 mmol/L PBS(pH 6.0)。每處理3個(gè)重復(fù)。設(shè)每min減少0.002 A470為一個(gè) POD活力單位(U)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

表1圖1結(jié)果顯示，5種濃度的茶多酚對(duì)稻瘟病菌都有很強(qiáng)的抑制作用，與對(duì)照比較差異均達(dá)極顯著水平(P＜0.01)。且隨著濃度增加，抑制作用增強(qiáng)。尤其10.00 mg/mL和5.00 mg/mL的抑制效果最好，其抑制率高達(dá)100%(兩者差異不顯著)。即使最低濃度為2.00 mg/mL其抑制率也達(dá)68.45%，由此可見，茶多酚對(duì)稻瘟病菌的抑制效果在本設(shè)置最低濃度為2.00 mg/mL時(shí)已經(jīng)非常明顯。

表1 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用Table 1 Inhibition of tea-polyphenol of different concentration on the growth of P.oryzae

圖1 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制Fig.1 Inhibition of TP of different concentration on the mycelia growthof P.oryzae

從圖2可以看出，幾種濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)都具有強(qiáng)烈的抑制作用，其分生孢子周圍和頂端聚集大量顆粒狀物質(zhì)即原生質(zhì)均大量外溢，尤其5.00 mg/mL和10.00 mg/mL處理的分生孢子不僅不能萌發(fā)產(chǎn)生芽管，而且孢子嚴(yán)重畸形、破裂，崩潰;由此可見，茶多酚對(duì)稻瘟菌不僅有很強(qiáng)的抑菌作用，而且有強(qiáng)烈的殺菌作用。3.33 mg/mL和2.00 mg/mL茶多酚處理的孢子雖然能產(chǎn)生芽管，但是芽管又短又細(xì)，伸長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制。而CK的分生孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管長(zhǎng)而粗壯，孢子形態(tài)正常，雅梨形且二個(gè)隔膜清晰可見。另外菌絲萌發(fā)結(jié)果顯示，經(jīng)茶多酚處理的菌絲，盡管是低濃度為2.00 mg/mL時(shí)，菌絲仍畸形(見圖3)。由此可以得出，茶多酚抑制孢子的萌發(fā)主要體現(xiàn)兩方面作用，低濃度主要抑制孢子芽管的伸長(zhǎng)與萌發(fā)，表現(xiàn)為抑菌作用;而高濃度主要為細(xì)胞崩潰死亡，表現(xiàn)為殺菌作用。

2.2 不同濃度的茶多酚對(duì)稻瘟病菌細(xì)胞膜透性的影響

圖4結(jié)果顯示，不同濃度茶多酚處理的稻瘟病菌絲電導(dǎo)率值均急劇變化，其變化大小趨勢(shì)與濃度成正比，即濃度越大，電導(dǎo)率值變化越大。尤其在第2 d與第5 d之間變化最大;而CK電導(dǎo)率值一直較平穩(wěn)，沒有明顯的變化，基本在0值上下波動(dòng)。電導(dǎo)率值的改變可以間接反映細(xì)胞膜透性的改變，說明經(jīng)茶多酚處理后稻瘟病菌絲膜系統(tǒng)通透性發(fā)生了變化，因細(xì)胞膜的主要成分是脂質(zhì)雙分子層，其中含有親水端和疏水端，茶多酚可直接進(jìn)入脂質(zhì)雙分子層，以多酚羥基和脂質(zhì)的親水端結(jié)合，使脂質(zhì)凝集，從而破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子結(jié)構(gòu)，使膜系統(tǒng)通透性驟然加大，有的甚至完全破裂，菌體內(nèi)大量細(xì)胞質(zhì)外溢，最終導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡，從而引起電導(dǎo)率值急劇變化。而CK沒有茶多酚的作用，其膜透性幾乎沒有改變，當(dāng)然也沒有細(xì)胞質(zhì)的滲漏。圖2和圖3分生孢子和菌絲的細(xì)胞質(zhì)外溢現(xiàn)象也充分證明了這一點(diǎn)?？梢姡瓒喾訉?duì)細(xì)胞膜的影響是抑制或殺滅真菌的重要機(jī)理。

圖4 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲細(xì)胞膜透性的影響Fig.4 Effect of different concentration TP on membrane permeability of P.oryzae

2.3 不同濃度茶多酚對(duì)稻瘟病菌絲細(xì)胞內(nèi)CAT、POD酶活性的影響

圖5和圖6結(jié)果顯示，茶多酚對(duì)稻瘟病菌CAT、POD酶活性有明顯抑制作用，隨著茶多酚濃度增加，酶活性遞減。尤其10.00 mg/mL和5.0 mg/mL CAT和POD酶活在7 d內(nèi)始終為最低;而CK酶活在7 d內(nèi)均為最高。CAT、POD酶存在于需氧生物內(nèi)，屬于細(xì)胞保護(hù)酶系統(tǒng)，可以清除活性氧自由基，對(duì)于抵御多種理化因子脅迫、減少活性氧積累、維護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整都起到重要作用。CAT、POD酶活受到抑制，使菌絲膜系統(tǒng)、菌體蛋白質(zhì)更易受到內(nèi)外環(huán)境影響，從而影響微生物的代謝。

3 討論

國(guó)內(nèi)外許多研究證明，茶多酚對(duì)許多病原細(xì)菌具有很強(qiáng)的抑制作用，Kodamo和Yeo的研究結(jié)果分別證實(shí)了茶多酚對(duì)植物病原細(xì)菌和食物病原細(xì)菌均有較好的抑制效果［15，16］;陶榮達(dá)指出:按Bergey細(xì)菌分類系統(tǒng)，對(duì)于自然界中19類群的近百種細(xì)菌均有優(yōu)異的抗菌活性，顯示出茶多酚抗菌的廣譜性的強(qiáng)抑制力［17］;王岳飛研究發(fā)現(xiàn)TP具有抗菌廣譜性并具強(qiáng)的抑制能力，它對(duì)自然界中幾乎所有動(dòng)植物病原細(xì)菌都有抑制能力［3］;董金莆研究表明茶多酚對(duì)細(xì)菌有廣泛的抑制作用［18］。綜上所述，茶多酚對(duì)病原細(xì)菌抑制作用已完全得到證實(shí)，但對(duì)病原真菌尤其植物病原真菌研究甚少。因此，為了使茶多酚能盡快在農(nóng)業(yè)方面得到開發(fā)應(yīng)用，建立茶多酚對(duì)植物病原真菌的抗菌譜是非常必要的。

本研究結(jié)果表明，不同濃度的茶多酚對(duì)稻瘟病菌均具有顯著的抑制效果(P＜0.01)，且隨茶多酚濃度增加抑制作用增強(qiáng)，可見，茶多酚對(duì)植物病原真菌的抑菌能力與濃度呈正相關(guān)，這點(diǎn)和王岳飛研究的茶多酚對(duì)細(xì)菌的抑菌能力與其濃度呈正效應(yīng)一致［4］。另外，茶多酚對(duì)稻瘟菌菌絲和分生孢子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)均已證明，5.00 mg/mL和10.00 mg/mL為最佳的抑菌濃度，其抑制率均高達(dá)100%，且分生孢子不能萌發(fā)，孢子畸形，細(xì)胞破裂崩潰，原生質(zhì)外溢，說明茶多酚對(duì)稻瘟菌不僅有很強(qiáng)的抑菌作用，而且有強(qiáng)烈的殺菌作用。茶葉在我國(guó)種植廣泛，具有豐富的資源，茶多酚的提取工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，作為一種新型植物源農(nóng)藥在植物病原真菌方面開發(fā)應(yīng)用將具有廣闊的前景。

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Inhibitive Effect of Tea-polyphenols on Pyricularia oryzae and Its Mechanism

WANG Jin-lian，QIU Ye-xian*，F(xiàn)U Jiao-long，HAN Jun，F(xiàn)ENG Wen
College of chemical and biology of university of science and technology of Suzhou，Suzhou 215009，China

The inhibitive effect of tea-polyphenols(TP)on Pyricularia oryzae at different concentrations and the inhibitive mechanism were studied.The results showed that TP had strong inhibition on hytha growth and conidia germination.With the increasing of TP concentration，the inhibition was increased.The inhibitive efficiency at the concentrations of 5.00 mg/mL and 10.00 mg/mL was the highest，and the inhibitive ratio achieved 100%.The conidia distorted，the cell burst，and the protoplasm overflowed in this condition.The action mechanism of TP was:TP destroyed the structure of cell membrane，strongly inhibited the enzyme activity of CAT，POD，made the cell lose the protection of cell membrane barrier and enzyme system，and finally lead the growth of fungi to be inhibited or die.

tea-polyphenols;Pyricularia oryzae;inhibition;inhibitory mechanism

1001-6880(2011)05-0918-05

2009-12-25 接受日期:2010-07-06

國(guó)家自然科學(xué)基金(［2003］30260050)

*通訊作者 E-mail:qyx542@126.com

R285;Q946.91;S432.4

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