北蟲草體外抗氧化和PC12氧化損傷修復作用的有效部位的篩選

杜秀菊，張秀省，張勁松，賈 薇，劉艷芳，楊 焱，唐慶九，周 帥

1聊城大學生命科學學院，聊城252059;2國家食用菌工程技術研究中心國家食用菌加工技術分中心上海市農業(yè)科學院食用菌研究所，上海201106;3聊城大學農學院，聊城252059

北蟲草體外抗氧化和PC12氧化損傷修復作用的有效部位的篩選

杜秀菊1，2，張秀省3，張勁松2*，賈 薇2，劉艷芳2，楊 焱2，唐慶九2，周 帥2

1聊城大學生命科學學院，聊城252059;2國家食用菌工程技術研究中心國家食用菌加工技術分中心上海市農業(yè)科學院食用菌研究所，上海201106;3聊城大學農學院，聊城252059

采用系統溶劑法對北蟲草子實體進行依次提取，制備得氯仿相、乙酸乙酯相和乙醇相三部位，利用化學發(fā)光法和H2O2誘導PC12氧化損傷修復模型，對三部位進行體外抗氧化活性和PC12氧化損傷修復作用測定。結果表明，乙酸乙酯相具有較強的抗氧化活性，是清除H2O2自由基和超氧自由基活性最強的部位，IC50值分別為88.5 μg/mL和190 μg/mL;乙酸乙酯相對由H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷的修復作用較強，且呈現明顯的濃度依賴性。無論從抗氧化活性，還是從對H2O2氧化損傷的修復作用，乙酸乙酯相均表現出了較強的作用，乙酸乙酯相是抗氧化活性和保護PC12細胞氧化損傷的主要有效部位。

北蟲草;抗氧化;PC12細胞;氧化損傷;系統溶劑法

傳統野生的冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)的生長不僅需要特殊的生境，還具有嚴格的寄生性，所以自然資源極度匱乏，被列為一級保護物種，價格堪比黃金，無法滿足社會需求。和C.sinensis同屬異種的北蟲草(C.militaris)，是蟲草屬的模式種，又稱北冬蟲夏草，蛹蟲草等，是寄生在鱗翅目和鞘翅目等昆蟲蛹體上的真菌，研究表明，兩者的化學成分、營養(yǎng)成分和藥理功能均非常相似，因而可以作為冬蟲夏草的最佳替代品［1］。研究表明，北蟲草具有抗腫瘤［2］、增強免疫功能［3］、抗氧化［4］、抗疲勞［3］、抗菌抗病毒［5］等多種生理功能，開發(fā)北蟲草及其活性成分具有很高的經濟價值和社會效益，已引起諸多國內外同行的廣泛關注。

本研究利用化學發(fā)光法和H2O2誘導的PC12氧化損傷修復模型，對系統溶劑法提取制備得到的氯仿相、乙酸乙酯相、乙醇相等三個部位進行了抗氧化活性和氧化損傷修復活性的系統篩選，本試驗結果將對科學開發(fā)利用北蟲草資源奠定一定的理論基礎。

1 材料和試劑

北蟲草子實體，由上海農業(yè)科學院食用菌研究所提供。

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清、DMSO (二甲亞砜)購自GIBCO公司;魯米諾、鄰苯三酚和NGF購自Sigma公司;鏈霉素、青霉素購自Amersco公司;Alamar Blue購自Biosource公司;其它均為國產分析純。

2 方法

2.1 北蟲草子實體的提取

稱取北蟲草子實體干品100 g，粉碎機粉碎，60目過篩，氯仿68℃回流2 h，收集上清濃縮干燥得氯仿相(CHCl3相，命名為CMCl);沉淀揮干氯仿后，加乙酸乙酯78℃回流2 h，上清濃縮干燥得乙酸乙酯相(EtOAc相，命名為CMEtOAc);沉淀揮干乙酸乙酯后，加95%的食用酒精90℃回流2 h，上清濃縮干燥得乙醇相(EtOH相，命名為CMEtOH)。

2.2 抗氧化試驗

2.2.1 樣品制備

精確稱取5 mg樣品，置于滅過菌的eppendorf管中，用1mL PBS緩沖液使之充分溶解。10000 r/ min離心30 min，無菌條件下收集上清，再將樣品分別稀釋成濃度分別為10、20、40、60、80、100、1.0 mg/ mL和2.0 mg/mL等備用。

2.2.2 超氧陰離子(O-·2)清除試驗［6］

先于96孔板注入2 μL不同濃度的樣品溶液［空白對照和陽性對照分別以等量 0.05 mol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液和超氧化物歧化酶(SOD)］，然后加入8 μL 6.25×10-4mol/L鄰苯三酚，由外部泵入150 μL魯米諾和碳酸鈉緩沖液混合液，每孔每0.6 s收集一次光信號，連續(xù)收集30 s，記錄相對發(fā)光強度。每個樣品設3次重復。超氧自由基清除率按下面的公式計算。

A0為空白的發(fā)光峰值，A1為加入樣品反應后的發(fā)光峰值。

2.2.3 過氧化氫(H2O2)清除試驗［6］

用Clarity化學發(fā)光儀(BIO-TEK公司)進行測定。96孔板中每孔先注入10 μL H2O2溶液，再注入40 μL不同濃度的樣品溶液［空白對照和陽性對照分別以等量K2HPO4-KH2PO4緩沖液和Vc(Vitamin C)代替樣品］，再注入150 μL魯米諾和碳酸鈉緩沖溶液混合液。每孔每0.6 s收集一次光信號，連續(xù)收集30 s，記錄相對發(fā)光強度。每個樣品設3次重復。H2O2自由基清除率計算公式同超氧自由基清除率計算公式。

2.3 對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷的修復試驗［6］

2.3.1 樣品制備

精確稱取1 mg樣品，充分溶解于1mL DMSO緩沖液中。10000 r/min離心30 min，無菌條件下收集上清，再用DMSO分別將樣品稀釋成10、50 μg/mL和200 μg/mL備用。

2.3.2 DMEM培養(yǎng)液的配制

在高糖DMEM培養(yǎng)基中加入15%胎牛血清、2.5%馬血清、1×10 U/L青霉素和1×10 U/L鏈霉素，搖勻后備用。

2.3.3 氧化損傷修復試驗

PC12細胞(由中國科學院上海藥物研究所丁侃研究員惠贈)接種于DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數生長期，取出，離心(1000 r/min，3 min)，底部細胞用培養(yǎng)液稀釋為2× 104 cell/mL，于96孔板中每孔接種190 μL，加入10 μL H2O2處理液(陰性對照不加)，處理4 h后，吸去96孔板中所有培養(yǎng)基，每孔加入 199 μL新鮮DMEM培養(yǎng)液，然后每孔加入待測樣品。試驗分為四組，具體方案如下:

(1)樣品組:199 μL DEME+PC12細胞 +1 μL樣品(經H2O2處理);

(2)陰性對照組:199 μL DEME+PC12細胞+1 μL DMSO(未經H2O2處理);

(3)陽性對照組:199 μL DEME+PC12細胞+1 μL NGF(經H2O2處理)，NGF濃度為100 μg/mL;

(4)損傷對照(H2O2作用組M):199μL DEME +PC12細胞+1μL DMSO(經H2O2處理)。

加好樣品的96孔板繼續(xù)放入37℃，含5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，觀察細胞形態(tài)，并用AlamarBlue Assay檢測細胞存活率［12］。該試驗重復三次，只采用H2O2作用組損傷程度在40%～60%的試驗數據。存活率根據如下公式計算:

存活率(%)=［117216×Aλ570(sample)-80856 ×Aλ600(sample)］/［117216×Aλ570(control)-80856 ×Aλ600(control)］×100%

2.4 統計學分析

使用STST統計軟件包進行方差統計分析，n=3。

3 結果與分析

3.1 北蟲草子實體各部位的提取得率

北蟲草子實體三部位提取物經干燥至恒重后稱重，計算后得知:CMCl、CMEtOA和CMEtOH的得率分別為0.83%、1.19%和4.22%，結果表明，EtOH相得率最高，EtOA相次之，CHCl3相最低。

3.2 子實體不同提取部位的抗氧化活性

北蟲草子實體不同提取部位對O-·2的清除結果如圖2所示。圖2表明，北蟲草子實體的三個部位對超氧自由基都有清除能力，其中CMEtOA的清除能力較強，CMEtOH次之，CMCl較差。

表1列出了北蟲草子實體不同提取部位的抗氧化活性的IC50值。由表1可以看出:CMEtOA、CME-tOH和CMCl的IC50分別為190、258 μg/mL和3.88 ×103μg/mL，表明CMEtOA和CMEtOH對超氧自由基都有較高的清除能力，CMEtOA的清除活性略高于CMEtOH，CMCl清除超氧自由基的能力最差，與CMEtOA相比較，呈現極顯著差異(P＜0.01)。

圖1 北蟲草子實體不同提取物對超氧自由基的清除率Fig.1 The scavenging rate of Oof the three extracts from C.militaris fruiting bodies

北蟲草子實體三部位對H2O2自由基的清除結果如圖3和表1所示。圖3表明，三部位對H2O2自由基都有清除能力，其中CMEtOA較強，CMCl次之，CMEtOH較差。它們的IC50值(見表1)表明: CMEtOA的最低，為88.5 μg/mL，其次為CMCl(227 μg/mL)，CMEtOH的最高(544.7 μg/mL)。因此，清除H2O2自由基的活性為:CMEtOA＞CMCl＞CMEtOH，三者清除H2O2自由基的活性呈現極顯著差異(P＜0.01)。

圖2 北蟲草子實體不同提取物對H2O2自由基的清除率Fig.2 The scavenging rate of H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

表1 北蟲草子實體不同提取物對超氧自由基和H2O2自由基的清除效果(IC50值)Table 1 Antioxidant effect(IC50)of Oand H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

表1 北蟲草子實體不同提取物對超氧自由基和H2O2自由基的清除效果(IC50值)Table 1 Antioxidant effect(IC50)of Oand H2O2of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

1Vc在清除H2O2試驗中用于陽性對照;2SOD(超氧化物歧化酶)在清除超氧陰離子試驗中用于陽性對照。1Vc(Vitamin C)was used as positive control in H2assay;2SOD(Superoxide Dismutase)was used as positive control in Oassay.

IC50(μg/mL)樣品Sample 227 CMEtOA 190 88.5 CMEtOH 258 544.7維生素C(Vc)1 - 22.3超氧化物歧化酶(SOD)2 3.7×10-2 assay CMCl 3.88×103 O-· 2 assay H2O2 -

3.3 北蟲草子實體不同提取物對 H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷的修復作用

北蟲草不同部位的提取物對PC12細胞的氧化損傷的修復作用結果見表2。PC12細胞經過氧化劑H2O2處理后，H2O2作用組的細胞存活率下降到了(43.56±2.5)%，陽性對照NGF在0.1 μg/mL時的修復率為(98.03±1.3)%，陽性對照NGF和樣品組的細胞存活率均高于H2O2作用組的細胞存活率，表明了樣品對H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷都有不同程度的修復作用。CMEtOA和CMCl呈現濃度-效應正相關，表明對H2O2誘導的氧化損傷的修復作用隨著濃度升高而增強;CMEtOH當濃度為10 μg/mL增至50 μg/mL時，PC12細胞的存活率由(61.98±0.8)%上升到(65.44±2.1)%，呈現明顯的劑量-效應正相關，但當濃度增至200 μg/mL時，細胞存活率反而下降到了(58.76±1.7)%，表明CMEtOH組分內有可能含有抑制氧化損傷修復作用的組分，需要對其進一步分離純化研究后確定。三部位相比較，CMEtOA的細胞存活率最高，在10 μg/mL、50 μg/mL和200 μg/mL時的細胞存活率分別為(70.02±1.2)%、(80.57±2.5)%和(85.37± 3.0)%，呈現明顯的濃度依賴性。在200 μg/mL時，CMEtOA的細胞存活率與CMCl相當，二者與CMEtOH相比，呈現極顯著差異(P＜0.01)。綜上所述，CMEtOA對由H2O2誘導的PC12細胞損傷具有明顯的修復作用，CMCl稍次之，CMEtOH最差。

表2 北蟲草不同提取物對PC12細胞的氧化損傷修復作用Table 2 Rehabilitation effect of PC12 cell of the three extracts from C.militaris fruiting bodies

4 討論與結論

4.1 食、藥用真菌是產生天然活性化合物的天然寶庫。天然的抗氧化劑是一類重要的生物活性物質，可以清除人體代謝過程中產生的自由基，具有延緩機體衰老之功效。不但可以作為食品添加劑，也可以用于化妝品行業(yè)，無論在國內還是在國外受到越來越多的青睞。本研究利用化學發(fā)光法，對北蟲草子實體的三個不同提取部位進行了抗氧化活性的篩選，試驗結果表明，三個部位(CHCl3相、EtOAc相和EtOH相)均有抗氧化活性，其中EtOAc相是清除H2O2自由基的最主要的活性部位(IC50值為88.5 μg/mL)，也是清除超氧自由基的最主要的活性部位(IC50值為190 μg/mL)，在同一試驗濃度下，EtOAc相對H2O2自由基的清除率高于對超氧自由基的清除率。EtOAc相抗氧化的有效成分還有待于進一步分離純化后確定。

4.2 據報道［7］，本研究用作陽性對照的神經生長類物質(NGF，神經生長因子)對損傷神經具有較強的修復作用，但這類營養(yǎng)因子往往取自動物機體，數量極少所以價格昂貴。目前已發(fā)現猴頭［8］、雞樅［9］和靈芝［10］等食藥用菌中，均含有神經營養(yǎng)成分的有效成分。北蟲草子實體對神經保護作用的研究較少有報道。本研究利用本實驗室成功建立的體外模擬自由基損傷誘導細胞凋亡的模型，以北蟲草子實體不同部位的提取物為研究材料，評價了受試樣品對H2O2誘導的PC12氧化損傷修復作用，試驗結果表明，EtOAc相能明顯促進H2O2誘導損傷后的PC12增殖，且呈現明顯的劑量-效應關系，200 μg/mL時的細胞存活率為(85.37±3.0)%，明顯高于H2O2作用組，且與EtOH相比呈現極顯著差異(P＜0.01)，因此，EtOAc相對H2O2誘導的PC12細胞的氧化損傷具有明顯的修復作用，是具有氧化損傷修復作用的有效部位。

4.3 綜上所述，無論是從抗氧化活性，還是從氧化損傷修復活性的角度，EtOAc相均表現出了較強的作用。龐小博［7］(2009)提到氧化損傷修復的有效成分不一定是抗氧化物質，本研究試驗結果表明，北蟲草的抗氧化活性部位和氧化修復活性部位均為EtOAc相，二者達到了統一，當然它們的有效成分未必是同一種物質，因為本試驗中，EtOAc相是指溶解于乙酸乙酯的所有物質的混合物。所以接下來的工作重點將是:以生物活性作為跟蹤指標對其進一步分離純化，以期得到活性最強的有效成分的單體。

至于EtOAc相中的有效成分究竟通過何種途徑促進氧化損傷的PC12神經細胞的增殖作用，亦將有必要做進一步的探討。

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7 Pang XB(龐小博)，Zhang JS(張勁松)，Tang QJ(唐慶久)，et al.Protective effects of lipophilic extracts of medicinal fungi against oxidative-stress damage in PC12 cells.Acta Agric Shanghai(上海農業(yè)學報)，2009，25:9-13.

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Antioxidant Activity and Oxidative Injury Protection for PC12 of Three Extracts from Cordyceps militaris Fruiting Bodies in vitro

DU Xiu-ju1，2，ZHANG Xiu-sheng3，ZHANG Jing-song2*，JIA Wei2，LIU Yan-fang2，
YANG Yan2，TANG Qing-jiu2，ZHOU Shuai21College of Life Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China;2National Engineering Research Center of Edible Fungi;National R＆D center for edible fungi processing;Edible Fungi Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201106，China;3College of Agricultural Science，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China

Cordyceps militaris fruiting bodies were extracted by using the method of systematic solvent extraction，and three different extracts were prepared named chloroform extract，acetic ether extract and ethanol extract，respectively.In vitro，the antioxidant activities of different extracts were investigated by using chemiluminescence measurements，and the activities of oxidative injury protection were assessed by using PC12 oxidative injury model induced with H2O2.The superoxide free radical(O－·2)system and H2O2system assays showed that the acetic ether extract had notable antioxidant activity，their scavenging rate for both H2O2and O－·2were highest among the three extracts，whose IC50were 88.5 μg/ mL and 190 μg/mL，respectively.Moreover，the oxidative injury protection for PC12 assay showed that the acetic ether extract had significant rehabilitation effect in comparison with chloroform extract and ethanol extract，and it rehabilitated PC12 cell treated with H2O2in a dose-dependent manner.Therefore，it was concluded that the acetic ether extract was the principal extract of both antioxidant and the activity of oxidative injury rehabilitation among three extracts from C.militaris fruiting bodies.

Cordyceps militaris;antioxidant activity;PC12 cell;oxidative injury;systematic solvent extraction

1001-6880(2011)05-0905-05

2010-12-29 接受日期:2011-05-11

國家科技部支撐基金項目(2006BAD06B08)

*通訊作者 E-mail:zhangjs8888@yahoo.com.cn

R284.2

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