系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞中微小RNA-146a的表達

王海燕，李 揚，陳梅紅，張 烜

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科，北京 1007302中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎醫(yī)學研究所生物化學系， 北京 100005

·論著·

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血單個核細胞中微小RNA-146a的表達

王海燕1，李 揚1，陳梅紅2，張 烜1

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院風濕免疫科，北京 100730
2中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎醫(yī)學研究所生物化學系， 北京 100005

目的采用生物信息學和分子生物學技術相結合，尋找在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)中特異性表達的微小RNA，為進一步研究微小RNA在SLE發(fā)病機制中的作用打下基礎。方法查找與SLE發(fā)病相關的基因，采用微小RNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫預測SLE相關基因上的可能微小RNA靶位點，選擇其相對應的微小RNA-146a,即hsa-miR-146a，采用實時熒光定量PCR方法檢測SLE患者與正常人外周血單個核細胞(PBMCs)中微小RNA的表達差異。結果SLE患者外周血PBMCs中hsa-miR-146a的循環(huán)閾值的差值高于正常對照組(4.52±1.18 比2.76±1.38，P=0.02)，hsa-miR-146a的表達量顯著低于正常對照組。結論SLE患者PBMCs中hsa-miR-146a的表達水平降低，表明hsa-miR-146a在SLE發(fā)病機制中可能發(fā)揮一定的作用。

微小RNA；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；外周血單個核細胞

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)發(fā)病機制復雜，被認為是自身免疫病的原型。大量研究證實，基因水平的免疫調節(jié)障礙及細胞因子代謝紊亂在SLE 中表現(xiàn)突出，直接或間接地參與了疾病的形成和發(fā)生發(fā)展過程。微小RNA在轉錄后水平調控基因的表達，在如凋亡[1]、分化[2]和細胞周期[3]中均發(fā)揮重要的作用并調節(jié)多種生物學信號通路。本研究利用生物信息學方法，借助于哺乳動物微小RNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫miRBase和TargetScan，預測出SLE相關基因上的可能微小RNA靶位點，選擇其相對應的微小RNA，采用TaqMan探針實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技術檢測其在SLE患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的表達，為進一步研究微小RNA在SLE發(fā)病機制中的作用打下基礎。

對象和方法

對象收集我院風濕免疫科門診8例女性系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，年齡15～42歲，病情較為一致。所有患者的診斷均符合美國風濕病學會1997年修訂的SLE診斷標準。入組的SLE患者按SLE疾病活動指數(shù)評分≥10，臨床表現(xiàn)均具有血尿、蛋白尿、低補體、抗雙鏈DNA增高。8例正常對照皆來自年齡25～30歲的北京協(xié)和醫(yī)院健康志愿獻血者，年齡和性別匹配。

試劑和儀器淋巴細胞分離液購自國藥集團化學試劑有限公司；Trizol購自美國Invitrogen公司； hsa-miR-146a TaqMan?MicroRNA Assays和RUN6 TaqMan?MicroRNA Assays及TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit 及 TaqMan 2× Universal PCR Master Mix購自ABI公司，ABI PRISM7500 Real-Time PCR 擴增儀(美國應用生物技術系統(tǒng)公司)，熒光定量 96 孔板(美國應用生物技術系統(tǒng)公司)。

采用微小RNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫預測SLE相關基因上的可能微小RNA靶位點結合目前的文獻報道，查找并總結出與SLE發(fā)病相關的基因。在miRBase 13.0(http://microrna.sanger.ac.uk)和TargetScan 5.2(http://www.targetscan.org)數(shù)據(jù)庫中分別查找這些基因上的可能微小RNA靶位點。分別統(tǒng)計每個微小RNA靶位點的出現(xiàn)頻率、每個微小RNA靶位點在不同的SLE相關基因上的出現(xiàn)頻率(作用靶基因數(shù))。在靶位點出現(xiàn)頻率較高的微小RNA、靶位點在不同的SLE相關基因上出現(xiàn)頻率較高的微小RNA、以及miRBase 13.0和TargetScan 5.2兩大數(shù)據(jù)庫預測結果較一致的微小RNA中隨機選擇hsa-miR-146a，對其在SLE患者PBMCs中的表達量做進一步實驗驗證。

外周血單個核細胞的提取抽取SLE患者及正常對照人群外周靜脈血4 ml，抗凝。用常規(guī)淋巴細胞分離液密度梯度離心法分離PBMCs。分離出的乳白色PBMCs層用1倍體積的PBS洗滌兩次。洗滌后用PBS定容至1 ml，吹打混勻；用細胞計數(shù)板計數(shù)。

PBMCs中總RNA的提取及質量檢測將患者及健康對照者PBMCs懸液轉移至1.5 ml 無RNA酶的EP管中，Trizol法提取總RNA，提取的總RNA加入35 μl 無RNA酶的水，于55～60℃水浴5～10 min,使RNA充分溶解。用核酸紫外分析儀檢測RNA濃度，保證OD260/280位于1.8～2.0，并電泳檢測RNA質量，剩余的RNA凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

反轉錄反應將SLE患者及正常人PBMCs中提取的總RNA用RNase-free水稀釋成濃度為2 ng/μl。應用ABI公司的TaqMan?微RNA反轉錄試劑盒，反應體系為15 μl。每個0.2 ml RNase-free的EP管中分別加入10×RT酶(50 U/μl)1.00 μl，10×RT緩沖液1.5 μl，RNA酶抑制劑(20 U/μl)0.19 μl，無RNA酶水 4.16 μl，dNTP (10 mmol/L)0.15 μl,Total RNA 5 μl，5×RT引物3 μl。均于冰上加樣。反應參數(shù)為：16℃ 30 min；42℃ 30 min；85℃ 5 min；4℃無限延伸。選用RUN6為內參。

實時定量PCR反應采用ABI公司的TaqMan?2×通用PCR混合液，20 μl PCR反應體系(μl)：Taqman 探針1.00 μl；cDNA 3.00 μl；PCR 混合液10.00 μl；ddH2O 6.00 μl。PCR循環(huán)條件：95℃ 10 min(95℃ 15 s→60℃ 60 s)40個循環(huán)。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 16.0 軟件包。用循環(huán)閾值的差值(△Ct)(目標基因的Ct 值減去內參基因的Ct 值)對實時定量PCR 的結果進行相對定量分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，均值的比較采用t檢驗進行分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

與SLE發(fā)病相關的基因與SLE發(fā)病相關基因可分為細胞凋亡相關因子、細胞因子相關、轉錄活化因子及信號相關因子、干擾素相關因子等幾類(表1)。

與SLE發(fā)病相關基因在微小RNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫中的查詢結果在兩大微小RNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫miRBase 13.0和TargetScan 5.2中查找出與SLE發(fā)病相關基因上的可能微小RNA靶位點(表2)。

qRT-PCR方法檢測hsa-miR-146a在SLE患者及正常人PBMCs中的表達SLE患者外周血PBMCs中hsa-miR-146a的△Ct值高于正常對照組(4.52±1.18 比2.76±1.38，P=0.02)。

討 論

繼小干擾RNA后，人們發(fā)現(xiàn)微小RNA也是一種對基因表達調控發(fā)揮重要作用的非編碼小RNA。人的微小RNA-146家族有兩個成員：146a和146b，分別位于5和10號染色體上。有報道hsa-miR-146a與免疫性疾病及免疫反應相關[4-5]。Hsa-miR-146a還可在人類肺泡上皮細胞中調節(jié)急性炎癥反應，其表達的快速增高為固有免疫反應提供了一個新的負向調節(jié)機制[6]。

表 1 與SLE發(fā)病相關的基因

SLE：系統(tǒng)性紅斑狼瘡；TNF：腫瘤壞死因子；TFAR：TF-1細胞凋亡相關基因；IL：白細胞介素；IFN：干擾素；TGF：轉化生長因子；MMP：基質金屬蛋白酶；CIS：細胞因子信號傳導抑制蛋白；TNFSF：腫瘤壞死因子配體超家族成員；TRAF：腫瘤壞死因子受體相關因子；ATG：自噬相關基因； TRAIL：腫瘤壞死因子凋亡相關配體； GATA：結合蛋白；STAT：信號轉導及活化轉錄因子；SOCS：細胞因子信號轉導抑制因子；BLK： B淋巴細胞激酶；SLAMF：淋巴細胞信號激活分子；IRF：干擾素調節(jié)因子；IFIT：應激相關蛋白；GIMAP5：免疫相關蛋白5核苷酸結合GTP酶；CD40LG： CD40配體基因；PDCD：程序性凋亡細胞；MERTK：突變受體酪氨酸激酶基因；KIR：殺傷細胞免疫球蛋白樣受體；TLR：toll 樣受體；MECP：甲基結合蛋白；PRF：穿孔素；ITGAL：增殖誘導配體(TNF家族)；CTLA：細胞毒性T淋巴細胞抗原；CRP：C反應蛋白

SLE: systemic lupus erythematosus; TNF: tumor necrosis factor；TFAR: TF-1 cell apoptosis-related gene；IL: interleukin；IFN: interferon；TGF: transforming growth factor；MMP: matrix metallopeptidase；CIS: cytokine-inducible SH2 protein；TNFSF: tumor necrosis factor superfamily；TRAF: TNF receptor-associated factor；ATG: autophagy gene；TRAIL: tumor necrosis factor-related apoptosis-including ligand；GATA: binding protein；STAT: signal transducer and activator of transcription；SOCS: suppressor of cytokine signaling；BLK: B lymphocyte kinase；SLAMF: signaling lymphocyte activation molecule F；IRF: interferon regulatory factor；IFIT: interferon-induced with tetratricopetide；GIMAP: GTPase of immunity-associated nucleotide binding protein；CD40LG: CD40 ligand gene；PDCD: programmed cell death； MERTK: MER receptor tyrosine kinase gene；KIR: killer cell immunoglobulin-like receptor；TLR: toll-like receptor；MECP: methyl-CpG-binding protein；PRF: perforin；ITGAL: proliferation-inducing ligand (TNF family)；CTLA: cytotoxic T lymphocyte antigen；CRP: C-reactive protein

表 2 兩個微小RNA靶基因預測數(shù)據(jù)庫檢索結果

研究表明，長度為20～25個核苷酸的微小RNA通過與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)不完全互補結合，引起相應靶mRNA的降解或翻譯抑制效應從而下調靶基因表達[7-8]。本研究顯示SLE患者外周血PBMCs中hsa-miR-146a的表達量顯著低于正常人，因而可以初步推測hsa-miR-146a的表達異常在SLE發(fā)病中可能發(fā)揮一定的作用。兩大數(shù)據(jù)庫預測的hsa-miR-146a可能作用的與SLE相關的靶基因有CD40LG、IRF5、PRF1。

綜上，本研究探討了微小RNA在SLE患者外周血PBMCs中的特征性表達，發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血PBMCs中hsa-miR-146a的表達量顯著低于正常人，為進一步研究微小RNA在SLE發(fā)病機制中的作用提供了有益的線索。

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ExpressionofMicroRNA-146ainPeripheralBloodMononuclearCellsin
PatientswithSystemicLupusErythematosus

WANG Hai-yan1, LI Yang1, CHEN Mei-hong2，ZHANG Xuan1

1Department of Rheumatology, PUMC Hospital, CAMS and PUMC, Beijing 100730, China
2Department of Biochemistry,Institute of Basic Medical Sciences, CAMS and PUMC, Beijing 100005, China

ZHANG Xuan Tel:010-88068177, E-mail:zxpumch2003@yahoo.com.cn;

ObjectiveTo explore the expression pattern of microRNAs in the peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of patients with systemic lupus erythematosus (SLE), with an attempt to identify the role of microRNA in the pathogenesis of SLE.MethodsSLE-related genes were searched from the published literatures. Using the microRNA target gene prediction databases, we predicted the putative microRNA targets in these SLE-related genes. For some of the corresponding microRNAs (hsa-miR-146a), quantitative real-time polymerase chain reaction was performed to determine the expression levels of these microRNAs in PBMCs of SLE patients (SLE group) and healthy controls (control group).ResultThe discrepancy of cycle threshold of hsa-miR-146a in PBMCs was significantly higher in SLE group (4.52±1.18) than in control group (2.76±1.38) (P=0.02), and the expression level of hsa-miR-146a was significantly lower in SLE group.ConclusionThe expression of hsa-miR-146a decreases in SLE patients, indicating that hsa-miR-146a may play a role in the pathogenesis of SLE.

microRNA;systemic lupus erythematosus; peripheral blood mononuclear cells

ActaAcadMedSin，2011,33(2)：185-188

張 烜 電話：010-88068177，電子郵件：zxpumch2003@yahoo.com.cn；
陳梅紅 電話：010-67884240，電子郵件：chenmhxc@gmail.com

R593.24+1

A

1000-503X(2011)02-0185-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2011.02.017

教育部新世紀優(yōu)秀人才計劃(NCET-04-0191)，國家自然科學基金(30400410)，北京自然科學基金(7052052)和國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目子課題(2007CB512405)Supported by the Ministry of Education’s New Century Excellent Talents Scheme (NCET-04-0191), the National Natural Sciences Foundation of China(30400410), the Natural Sciences Foundation of Beijing(7052052), and the National Basic Research Program Sub-topics of China(2007CB512405)

CHEN Mei-hong Tel: 010-67884240,E-mail: chenmhxc@gmail.com

2010-05-04)