小鼠肌源性干細(xì)胞高表達(dá)CD34、Sca-1、Bcl-2和desmin*

韋 喆, 張金明, 安 庚, 冀晨陽, 潘淑娟

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院整形外科, 廣東 廣州 510120)

小鼠肌源性干細(xì)胞高表達(dá)CD34、Sca-1、Bcl-2和desmin*

韋 喆, 張金明△, 安 庚, 冀晨陽, 潘淑娟

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院整形外科, 廣東 廣州 510120)

目的探討小鼠肌源性干細(xì)胞(MDSCs)的生物學(xué)特性和表型。方法取小鼠骨骼肌,用酶分步消化，應(yīng)用差速貼壁法進(jìn)行純化獲取MDSCs，觀察細(xì)胞的形態(tài)，對(duì)MDSCs分別進(jìn)行增殖能力、克隆形成率和融合情況等鑒定；通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光法及免疫印跡法(Western blotting)等檢測(cè)初步確定細(xì)胞表型。結(jié)果經(jīng)差速貼壁法獲取的MDSCs為圓形或短梭形細(xì)胞,聚集成簇，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；細(xì)胞倍增時(shí)間(9.69±2.08)h,克隆形成率(13.35±2.54)%；細(xì)胞在高匯合度(>50%)或低血清(2%FBS)培養(yǎng)時(shí)，極易融合成肌管或肌細(xì)胞鏈；流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光技術(shù)鑒定：CD34、Sca-1、Bcl-2和desmin在原代MDSCs中的表達(dá)均>90%；Western blotting檢測(cè)顯示隨著細(xì)胞的純化, desmin表達(dá)越來越強(qiáng)，α-SMA表達(dá)越來越弱。結(jié)論MDSCs通過差速貼壁法獲取時(shí)純度較高，它具有高水平表達(dá)CD34、Sca-1、Bcl一2和desmin的生物學(xué)特性，這4種蛋白可作為鑒定MDSCs的標(biāo)志物。MDSCs增殖旺盛，可在體外大量擴(kuò)增，是組織工程研究的一種新型種子細(xì)胞。

肌源性干細(xì)胞; Preplate技術(shù); 細(xì)胞表型; CD34; 干細(xì)胞抗原1; 蛋白質(zhì)Bcl-2; 結(jié)蛋白

肌源性干細(xì)胞(muscle-derived stem cells, MDSCs)作為一種成體干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的增殖能力和多項(xiàng)分化潛能，并具有免疫赦免性[1],現(xiàn)已成為研究熱點(diǎn)。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[2]相比，MDSCs取材方便，來源廣泛，對(duì)再生障礙性貧血或骨髓源性腫瘤等疾病的應(yīng)用不受限制，在Duchenne肌營(yíng)養(yǎng)不良、心肌缺血和肌肉缺損修復(fù)上取得了明顯的效果[3,4]，是組織工程研究的一種新型種子細(xì)胞。但是，由于缺少特異性細(xì)胞標(biāo)記，使得MDSCs的鑒定存在爭(zhēng)議。本研究旨在對(duì)小鼠MDSCs的生物學(xué)特性及表型進(jìn)行研究，完善MDSCs的表型鑒定體系。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動(dòng)物 C57BL/6小鼠，雌性，2-3周齡，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2試劑 DMEM-LG(Gibco)，馬血清(horse serum,HS，Hyclone)，胎牛血清(fetat bovine serum,FBS,Gibco)，Ⅺ型膠原酶(Sigma)，dispase蛋白酶(Roche)，0.25%胰酶-0.01%EDTA(Hyclone),1%青/鏈抗生素(1∶100,Hyclone)，Hoechst33342(碧云天)，MTT(Sigma), DMSO(Sigma),兔抗CD34(博士德),兔抗干細(xì)胞抗原1(stem cell antigen 1,Sca-1, Sigma),兔抗結(jié)蛋白(desmin, Sigma),兔抗凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2,博士德)，兔抗α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA, Sigma) ，F(xiàn)ITC-羊抗兔IgG(Sigma)、Cy3-羊抗兔IgG(Sigma)，羊抗兔甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,上?？党?; 過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(博士德)，BCA-100蛋白定量測(cè)定試劑盒(博士德)，Ⅱ抗曝光試劑盒(博士德)。

2方法

2.1MDSCs的獲取及傳代 根據(jù)Gharaibeh等[5]的方法加以調(diào)整，頸椎脫臼處死C57BL/6小鼠，無菌條件下切取四肢肌肉約5 g，轉(zhuǎn)移入超凈臺(tái)剪成肉泥狀置入離心管中；依次加入與組織等量體積的0.2%Ⅺ型膠原酶消化1 h，0.2% dispase消化30 min，0.25%胰酶-0.01%EDTA消化30 min。消化期間將離心管置于37℃恒溫振蕩搖床中(200 r/min),每次消化之間需離心(1 000 r/min離心5 min)并取沉淀進(jìn)行下一步消化。消化完成后取沉淀加入DMEM-LG+10%FBS +10%HS+1%青/鏈抗生素的培養(yǎng)基吹打混勻，接種于25 cm2透氣培養(yǎng)瓶中。放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，24 h后將含有未貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至離心管中離心(1 000 r/min離心5 min)后用新鮮培養(yǎng)基重懸，接種另一培養(yǎng)瓶中，記為第1次貼壁細(xì)胞(preplate 1,PP1)。依此類推，每次間隔24 h轉(zhuǎn)瓶換液，分別記為第2次貼壁細(xì)胞(preplate 2,PP2)到第6次貼壁細(xì)胞(preplate 6,PP6)。PP6的貼壁細(xì)胞即為原代MDSCs。培養(yǎng)約7 d左右，細(xì)胞生長(zhǎng)到50%，用胰酶進(jìn)行消化，以1∶2的比例進(jìn)行傳代，每2d換液1次。

2.2MDSCs的增殖活性 取第1代MDSCs，以3 000cells/well接種于96孔板內(nèi)，每孔液體量為200 μL，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2 d換液。隔天行MTT法在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定波長(zhǎng)492 nm下5個(gè)副孔的吸光度(A) 值，以時(shí)間(d)為橫軸，A值為縱軸繪制生長(zhǎng)曲線。并計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間(Patterson 公式):Td= Tlg2/ lg(Nt/ N0),Td：倍增時(shí)間(h)； T：培養(yǎng)時(shí)間；N0: 起始細(xì)胞數(shù)；Nt: 第t天的細(xì)胞數(shù)。

2.3MDSCs的克隆形成率 取達(dá)80%匯合的PP6細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液, 以200 cells/well接種于6孔板內(nèi),培養(yǎng)7d后,純甲醇固定30 min,Giemsa染色15 min,晾干。隨機(jī)挑選10個(gè)孔，顯微鏡下計(jì)算每孔細(xì)胞數(shù)>50的克隆數(shù)，克隆形成率即為：克隆數(shù)/ 接種細(xì)胞數(shù)×100%。另選取1個(gè)孔,用CD34抗體進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。

2.4MDSCs的融合能力 收集原代MDSCs接種于6孔板內(nèi)，將其分為3組(n=3)。第1組用生長(zhǎng)培養(yǎng)基(DMEM - LG + 10% FBS + 10%HS)，保持細(xì)胞生長(zhǎng)大于50%；第2組用分化培養(yǎng)基(DMEM - LG + 2% FBS)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)將近50%時(shí)進(jìn)行傳代；第3組(對(duì)照組)用生長(zhǎng)培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至30%-50%時(shí)進(jìn)行傳代。倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化。

2.5流式細(xì)胞儀鑒定MDSCs 收集PP1-PP6細(xì)胞，胰酶消化離心取沉淀，PBS吹打重懸調(diào)整細(xì)胞濃度為1010cells/L以上，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、Sca-1、Bcl-2和desmin的陽性率。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次(n=3)。

2.6細(xì)胞免疫熒光鑒定MDSCs 將PP1-PP6細(xì)胞接種到24孔板內(nèi)，24 h后進(jìn)行處理。4%多聚甲醛固定30 min；PBS沖洗，0.2%Triton X-100破膜20 min，PBS沖洗,10%山羊血清封閉30 min。PBS沖洗后，各孔分別滴加CD34、Sca-1、Bcl-2和desmin覆蓋細(xì)胞表面，濃度均為1∶100。4 ℃濕盒過夜。PBS沖洗，避光滴加Cy3-羊抗兔Ⅱ抗(1∶50)及FITC-羊抗兔Ⅱ抗(1∶50)在37 ℃下避光孵育30 min。大量PBS沖洗，避光滴加Hoechst 33342，37 ℃下避光孵育15 min，PBS沖洗后立即置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.7Westernblotting提取PP1-PP6細(xì)胞的蛋白，BCA法測(cè)定各代的總蛋白濃度后調(diào)整上樣體積,使得電泳時(shí)各泳道總蛋白量相等,在12%的SDS凝膠中進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜封閉后分別使用兔抗α-SMA(1∶500)，兔抗desmin(1∶600)4 ℃孵育過夜，過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔Ⅱ抗(1∶5 000)37 ℃下孵育1 h后進(jìn)行顯色并曝光。并以GAPDH作為內(nèi)參照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件測(cè)定各條帶的吸光度值并進(jìn)行分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往有肩部慢性疼痛史；（2）身體狀況差，不能耐受手術(shù)；（3）既往有神經(jīng)系統(tǒng)疾病引起的肩關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙。

結(jié) 果

1MDSCs形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果

PP1和PP2的細(xì)胞貼壁快(約2-3 h)，數(shù)量多，形態(tài)以長(zhǎng)梭形的成纖維樣細(xì)胞居多，并混雜有其它形態(tài)的細(xì)胞如星形和不規(guī)則形。PP3和PP4細(xì)胞開始出現(xiàn)短梭形，圓形或多邊形的貼壁細(xì)胞(約占10%-20%)，同時(shí)還有成纖維樣細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。隨著時(shí)間的增加，短梭形細(xì)胞逐漸增多，PP6中剛分離出來的細(xì)胞呈球形，折光性強(qiáng)。培養(yǎng)12 h后開始貼壁，大部分仍為圓形，48 h后完全貼壁并開始增殖，大部分細(xì)胞逐漸延展成短梭形或紡錘形，有兩極，體積小(約占細(xì)胞總數(shù)的80%)，7 d細(xì)胞增長(zhǎng)達(dá)50%，培養(yǎng)10 d左右，細(xì)胞生長(zhǎng)密集，并表現(xiàn)出一定的方向性，見圖1。

Figure 1. Preplate 1(PP1),preplate 4(PP4) and preplate 6(PP6)cells under microscope(A-G:×200;H:×100). With the isolating process, cells becomed increasingly small and spindly in shape.A:PP1; B:PP4;C:the inoculated cells of PP6 were round;D:PP6 cells began to adhere at 12 h; E:all cells were adherent at 48 h,and showed short shuttle and spindle shape;F:cells were shuttle shape or long spindle shape at 72 h;G:cells grew to 50% at 7 d;H: arrangement of PP6 cells were circinate, reticulate or radial at 10 d.

2MDSCs的生長(zhǎng)曲線

以不同時(shí)點(diǎn)所測(cè)得A值, 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，組與組之間差異顯著(Bonferroni法,P<0.01)。細(xì)胞接種后即開始進(jìn)入增殖期，呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，至第7 d后增殖逐漸減慢，進(jìn)入平臺(tái)期，見圖2。細(xì)胞的倍增時(shí)間為(9.69±2.08)h。

Figure 2. Proliferation capacity of MDSCs by MTT methods. The absorbance of 1 d,3 d,5 d,7 d,9 d were 0.25±0.01, 0.43±0.08, 0.56±0.03, 0.62±0.02 and 0.63±0.03.s. n=5. *P<0.05 vs 1 d.

3MDSCs克隆形成率

PP6細(xì)胞的平板克隆形成率為(13.35±2.54)%，差異顯著(n=10,P<0.05)。免疫熒光顯示這些克隆表達(dá)CD34，見圖3。

4MDSCs融合情況

5流式細(xì)胞儀檢測(cè)

在Qu-Petersen等[6]的基礎(chǔ)上，利用差速貼壁法，將PP1-PP6的細(xì)胞分為4個(gè)標(biāo)本，PP1主要為成纖維樣細(xì)胞, PP2-PP3為早貼壁細(xì)胞群(early preplate cells，EPCs), PP4-PP5為晚貼壁細(xì)胞群(late preplate cells, LPCs),PP6即MDSCs。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果示：從PP1-PP6細(xì)胞，CD34、Sca-1、Bcl-2和desmin的陽性率逐漸增高，呈上升趨勢(shì)；desmin在PP1細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)低，但在PP2-PP6表達(dá)均較高，4種蛋白在PP6細(xì)胞中的表達(dá)均>90%，表明MDSCs純度高，見表1。

Figure 3. The colony forming of MDSCs(A,×100) and positive expression of CD34 in the colony cells(B,×100).

Figure 4. Cells fusion in preplate 6 cells(PP6). Numerous cell chains could be seen in PP6 when cultured under high confluence or low serum concentration.A,×100; B,×200.

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

6細(xì)胞免疫熒光

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果與流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果大致相同，從PP1-PP6表達(dá)Sca-1的細(xì)胞得到富集，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，PP5和PP6中以短梭形細(xì)胞居多，有聚團(tuán)生長(zhǎng)的傾向；CD34、Bcl-2和desmin在MDSCs中也均有表達(dá)，見圖5。

7Westernblotting結(jié)果

通過各組與其內(nèi)參照吸光度的比值，得到desmin和α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)水平。組與組之間差異顯著(P<0.05)。隨著細(xì)胞的純化，PP1-PP6細(xì)胞的desmin表達(dá)越來越強(qiáng)，在PP6細(xì)胞中desmin蛋白含量達(dá)到最大；α-SMA表達(dá)越來越弱，PP6細(xì)胞中α- SMA的表達(dá)量很少，見圖6。

討 論

在骨骼肌中存在著肌衛(wèi)星細(xì)胞[7]，其功能是使受損肌纖維得到一定程度的再生和修復(fù)。Qu-Petersen等[6]利用差速貼壁法(preplating technique)[8]從肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)分離出早貼壁細(xì)胞群(early preplate cells，EPCs)和晚貼壁細(xì)胞群(late preplate cells, LPCs)，而LPCs內(nèi)又分離出一小群慢貼壁細(xì)胞即肌源性干細(xì)胞。MDSCs具有干細(xì)胞的特征，但由于沒有公認(rèn)的鑒定金標(biāo)準(zhǔn),現(xiàn)今僅能通過細(xì)胞形態(tài)和分子表型等方面初步確定。

通過Preplate技術(shù)獲取的MDSCs具有特征性的形態(tài)，未貼壁的MDSCs是小而圓的球體，貼壁后逐漸變化為短梭形，聚集生長(zhǎng)和對(duì)數(shù)增殖，并表現(xiàn)出一定的方向性。它具有強(qiáng)大的增殖能力，平板克隆形成率為(13.35±2.54)%，但在高匯合度(>50%)或低血清(2%FBS)培養(yǎng)時(shí)，極易融合成肌管或肌細(xì)胞鏈。經(jīng)流式檢測(cè)可初步認(rèn)為得到的PP6為較純的MDSCs。

目前尚無MDSCs表達(dá)的特異性標(biāo)記物，使MDSCs的鑒定存在爭(zhēng)議。研究[1,6]表明它表達(dá)CD34、Sca-1、desmin、MyoD和c-kit等細(xì)胞表型，但這些標(biāo)志在成纖維細(xì)胞、EPCs、LPCs和肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)也呈陽性反應(yīng),這使得鑒別較為困難，而各文獻(xiàn)選取檢測(cè)的蛋白標(biāo)志也不盡相同[6,8,9]。本實(shí)驗(yàn)采用4種抗體進(jìn)行鑒定及區(qū)別。Sca-1和CD34[10]是髓系干細(xì)胞的標(biāo)志,它們?cè)贛DSCs中高表達(dá)，既能反映其干細(xì)胞的特性，同時(shí)也能區(qū)別LPCs[6]。因?yàn)樵讷@取MDSCs的過程中很易與LPCs混淆，雖然LPCs也表達(dá)Sca-1和CD34，但表達(dá)率低于MDSCs。本研究證實(shí)CD34和Sca-1在MDSCs的陽性率高達(dá)90%以上，而在LPCs的表達(dá)率只有70%-80%。然而，有研究認(rèn)為干細(xì)胞中CD34的表達(dá)是可逆的[11],因而用它作為標(biāo)記物應(yīng)該謹(jǐn)慎。另一潛在的標(biāo)記蛋白是Bcl-2，它是成肌分化通路上的一種早期表達(dá)蛋白，該蛋白可作為間接反映原始成肌化細(xì)胞的指標(biāo)[12]。肌衛(wèi)星細(xì)胞表達(dá)Bcl-2只有10%-30%[12]，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)在MDSCs的表達(dá)高達(dá)90%以上。結(jié)蛋白desmin是中間絲蛋白的一種，是目前公認(rèn)的成肌化早期的特異性標(biāo)志，流式檢測(cè)它在MDSCs中的陽性率達(dá)到95%，表明了其肌源性的特征。雖然成纖維細(xì)胞與血管平滑肌細(xì)胞也產(chǎn)生結(jié)蛋白，但desmin含量低約10%左右，與抗體產(chǎn)生弱陽性反應(yīng)[13]。α- SMA是平滑肌細(xì)胞的特異性標(biāo)記,在成纖維細(xì)胞中亦為陽性,而在肌源性細(xì)胞則為陰性。因此，desmin和α- SMA組成的鑒定體系可用于排除成纖維細(xì)胞的污染。

Figure 5. Results of immunofluorescence assay.A: Immunofluorescence staining showed that Sca-1+ cells from preplate 1 cells(PP1) to preplate 6 cells(PP6)(×200);B:expression of Bcl-2，desmin and CD34 was also positive in PP6 cells(×200).

Figure 6. Results of Western blotting.With the purification of the cells,increased desmin expression(A) and decreased α-SMA expression(B) from preplate 1 cells(PP1) to preplate 6 cells(PP6) were shown. ±s. n=3. *P<0.05 vs PP1.

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了小鼠肌源性干細(xì)胞高表達(dá)CD34、Sca-1、Bcl-2和desmin。將這4種蛋白可作為鑒定肌源性干細(xì)胞表型的一個(gè)鑒定體系，既表明其干細(xì)胞及肌源性的特性，又在表型上與其它細(xì)胞區(qū)分。但值得注意的是，分子表型只是確認(rèn)這種細(xì)胞的輔助手段之一,還須結(jié)合細(xì)胞的來源位置、長(zhǎng)期增殖能力及多向分化能力等確定。

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HighexpressionofCD34,Sca-1,Bcl-2anddesminproteinsinmousemuscle-derivedstemcells

WEI Zhe, ZHANG Jin-ming, AN Geng, JI Chen-yang, PANG Shu-juan

(DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:zxmrwk@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the characteristics and phenotype of the muscle-derived stem cells(MDSCs) of mouse.METHODSSkeletal muscle specimens were harvested from C57BL/6 mice of 2 weeks old. Preplate technique was applied to isolate MDSCs. The cellular growth status and morphology of the primary MDSCs were observed. The sphere-forming, proliferation and differentiation assays were performed and flow cytometry(FCM), immunocytochemistry and Western blotting were used to characterize MDSCs.RESULTSThe isolating process contained 6 consecutive days of differentiated attachment. MDSCs were round or short spindle-shaped cells. The growth curve of MDSCs showed logarithmic growth, and the doubling time of MDSCs was(9.69±2.08) h. Cloning efficiency of MDSCs was(13.35±2.54)%. When the cells at high confluence(>50%) or cultured with low concentration of serum(2% FBS), they tended to fuse to form myotubes. The observations of FCM and immunofluorescence showed that the phenotypic characteristics of MDSCs were antibody-positive for CD34, Sca-1, Bcl-2 and desmin(>90%). With increasing the level of cell purification, the upregulation of desmin expression and the downregulation of α-SMA expression from preplate 1 cells(PP1) to preplate 6 cells(PP6) were observed by Western blotting.CONCLUSIONThe preplate technique can effectively isolate MDSCs. MDSCs express the antigens of CD34, Sca-1, Bcl-2 and desmin at high levels, and the 4 proteins can be used to identify MDSCs. With a high proliferating abilityinvitro, MDSCs are ideal seed cells for tissue engineering.

Muscle-derived stem Cells; Preplate technique; Cell phenotype; CD34; Stem cell antigen 1; Protein Bcl-2; Desmin

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.02-023

1000-4718(2011)02-0332-06

2010-08-30

2010-10-09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30672183)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.0711220600357)

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