4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸脂三肽的合成

周 亭，姚建忠 ，張東煒，劉紅明，盛春泉，繆震元，張萬年

(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸脂三肽的合成

周 亭，姚建忠 ，張東煒，劉紅明，盛春泉，繆震元，張萬年

(第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433)

目的制備用于全合成新型卡泊芬類環(huán)六脂肽抗真菌劑的關(guān)鍵脂三肽中間體4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸脂三肽。方法以L-脯氨酸叔丁酯為原料，依次經(jīng)與N-(9-芴甲氧羰基)-L-蘇氨酸叔丁醚(a)或N-(9-芴甲氧羰基)-L-絲氨酸叔丁醚(b)縮合、脫N-保護基后與Nα-(9-芴甲氧羰基)-Nδ-芐氧羰基-L-鳥氨酸縮合、再脫Nα-保護基后與4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑“活潑酯”(Ie～If)縮合5步反應(yīng)制備目標(biāo)脂三肽1。結(jié)果以67.4%～80.0%的總收率合成了8個脂三肽1ae～1ah和1be～1bh，其結(jié)構(gòu)經(jīng)電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和元素分析確證。結(jié)論該合成路線具有反應(yīng)條件溫和、操作簡便、總收率高的優(yōu)點。

藥物化學(xué)；合成；脂三肽；卡泊芬凈；環(huán)六脂肽；抗真菌劑

棘白菌素(echinocandin) 是天然環(huán)六脂肽類真菌細胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶抑制劑，對念珠菌和曲霉菌等深部真菌具有獨特的“殺菌”活性，但也存在抗菌譜窄、水溶性差及溶血毒性[1]。其中，上市的卡泊芬凈(caspofungin)、米卡芬凈(micafungin)和阿尼芬凈(anidulafungin)3個新藥[2]是其半合成衍生物，臨床用于治療侵入性念珠菌病和曲霉菌病。

為了進一步探討此類藥物的構(gòu)效關(guān)系，尋找高效、低毒、廣譜的抗深部真菌新藥，作者開展了新型卡泊芬凈類似物的優(yōu)化設(shè)計與全合成和活性研究；其中，4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸脂三肽(1)是“液相三肽片段對接法”全合成卡泊芬凈類環(huán)六脂肽胺型抗真菌劑的關(guān)鍵脂三肽中間體(圖1)。

本合成以市售L-脯氨酸叔丁酯(4)為起始原料，首先在縮合劑[N-(3-二甲氨基)丙基-N′-乙基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC HCl)及N-羥基苯并三氮唑(HOBt)作用下，與N-(9-芴甲氧羰基)-L-蘇氨酸叔丁醚(a)或N-(9-芴甲氧羰基)-L-絲氨酸叔丁醚(b)反應(yīng)制得二肽3a和3b；然后，二肽3a或3b經(jīng)二乙胺脫N-9-芴甲氧羰基(N-Fmoc)后按二肽相同制備方法與Nα-(9-芴甲氧羰基)-Nδ-芐氧羰基(CBz)-L-鳥氨酸縮合制得三肽2a或2b；最后，三肽2a或2b經(jīng)二乙胺脫N-Fmoc后與4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑“活潑酯”(I,R2CO2Bt)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中反應(yīng)制得8個目標(biāo)脂三肽1ae～1ah和1be～1bh，合成路線如圖2 所示。

其中，4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑“活潑酯”(I,R2CO2Bt)的制備是以4′-羥基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(Ⅴ)為原料，經(jīng)酸催化乙酯化、Williamson酚羥基烴化、堿水解制得4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(Ⅲ)后，再在二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)作用下與N-羥基苯并三氮唑(HOBt)縮合制得，合成路線如圖3 所示。

圖1卡泊芬凈類環(huán)六脂肽抗真菌劑的反合成分析

圖2 4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸脂三肽(1)的合成

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圖3 4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑“活潑酯”(I, R2CO2Bt)的合成

1 儀器與試劑

核磁氫譜(1H NMR)用Bruker DMX-500型核磁共振儀測定，TMS為內(nèi)標(biāo)；電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)采用Micromass Qtof-Micro LC/MS/MS質(zhì)譜儀測定；元素分析用Carlo Erba-1106型元素分析儀測定。 N -9-芴甲氧羰基-N-芐氧羰基-L-鳥氨酸購自上海源聚生物科技有限公司；其他保護氨基酸和縮合劑均購自吉爾生化(上海)有限公司。實驗所用其它試劑和溶劑均為市售化學(xué)純商品。

2 方法與結(jié)果

2.14′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑酯(I, R2CO2Bt)的合成

2.1.14′-羥基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸乙酯(Ⅳ)的制備 4′-羥基-1,1′-聯(lián)苯4-羧酸(Ⅴ)20.0 g(93.46 mmol)溶于220 ml乙醇，加入10 ml濃硫酸回流2 h。將反應(yīng)液倒入400 ml冰水中，冷卻，過濾，濾餅水洗至中性，得黃色固體粗品，干燥，硅膠H柱純化(二氯甲烷為洗脫劑)得白色固體Ⅳ 19.3 g，產(chǎn)率為85.3%。MS(ESI-)m/z：241(M-1，100%)。

2.1.24′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸乙酯(Ⅲ)的制備 化合物Ⅳ 2.0 g(8.26 mmol)溶于30 ml乙腈，加叔丁醇鉀0.93 g(8.30 mmol)及碘甲烷 0.55 ml(1.23 g，8.67 mmol)，回流24 h。反應(yīng)完畢，回收溶劑，殘留物用乙醚溶解，乙醚液先后用0.2% NaOH水液和水洗滌，無水硫酸鎂干燥，過濾，回收溶劑得黃色固體，硅膠H柱層析純化得白色固體4′-甲氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸乙酯(Ⅲe)1.4 g，收率為66.2%。MS(ESI-)m/z：255(M-1，100%)。

按Ⅲe相同的制備操作，化合物Ⅳ 2.0 g(8.26 mmol)在等摩爾量的叔丁醇鉀存在下，于30 ml乙腈中分別與1.05倍摩爾量的1-溴正丙烷、1-溴正戊烷和1-溴正辛烷反應(yīng)制得化合物4′-正丙氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸乙酯(Ⅲf)1.2 g，收率為51.1%，MS(ESI-)m/z：283(M-1，100%)、4′-正戊氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸乙酯(Ⅲg)1.2 g，收率為46.5%，MS(ESI-)m/z：311(M-1，100%)、4′-正辛氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸乙酯(Ⅲh)1.3 g，收率為44.4%，MS(ESI-)m/z：353(M-1，100%)。

2.1.34′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(Ⅱ)的制備 化合物Ⅲe 1.40 g(5.47 mmol)溶于18 ml四氫呋喃(THF)溶液中，加入1 mol/L NaOH水液11 ml，于80 ℃反應(yīng)10 h。反應(yīng)完畢，回收THF，殘液用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH5～6，過濾，干燥，得白色固體4′-甲氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(Ⅱe)1.22 g，產(chǎn)率為97.8%。

按IIe相同的制備方法，化合物Ⅲf 0.30 g(1.06 mmol)、Ⅲg 1.20 g(3.85 mmol)、Ⅲh 1.3 g(3.67 mmol)各自經(jīng)2倍摩爾量的1 mol/L NaOH水液于2倍體積的THF中分別水解制得4′-正丙氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(Ⅱf)0.26 g、4′-正戊氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(IIg)1.07 g、4′-正辛氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(Ⅱh)1.17 g；所有4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(Ⅱe～Ⅱh)的收率及理化數(shù)據(jù)見表1。

2.1.44′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑酯(I, R2CO2Bt)的制備 化合物Ⅱf 0.5 g(1.76 mmol)溶于20 ml二氯甲烷，依次加HOBt 0.25 g(1.85 mmol)及DCC 0.4 g(1.94 mmol)，室溫攪拌48 h。反應(yīng)完畢，過濾，回收溶劑得粗品。粗品經(jīng)硅膠H柱色譜分離制得白色絮狀物4′-正戊氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑酯(Ⅰg)0.45 g，收率為63.7%。MS(ESI-)m/z：400(M-1，100%)。

按化合物Ⅰg相同制備操作，化合物Ⅱe 1.0 g(4.39 mmol)、Ⅱf 1.0 g(3.91 mmol)和Ⅱh 1.5 g(4.60 mmol)各自與1.05倍摩爾量的HOBt在1.10倍摩爾量的DCC作用下分別反應(yīng)制得4′-甲氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑酯(Ⅰe)0.91 g，收率為60.1%，MS(ESI-)m/z：344(M-1，100%)、4′-正丙氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑酯(Ⅰf)0.95 g，收率為65.2%，MS(ESI-)m/z：396(M+Na，100%)、4′-正辛氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑酯(Ⅰh)0.87 g，收率為64.0%，MS(ESI-)m/z：442(M-1，100%)。

表1 4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸(Ⅱe～Ⅱh)的結(jié)構(gòu)和光譜數(shù)據(jù)

2.24′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酸脂三肽(1)的合成

2.2.1脯-蘇二肽(3a)和脯-絲二肽(3b)的制備 L-脯氨酸叔丁酯(4)3.0 g(17.54 mmol)溶于80 ml無水二氯甲烷，于0 ℃下加入N-Fmoc-L-蘇氨酸叔丁醚(a)7.3 g(18.39 mmol)、HOBt 3.1 g(22.96 mmol)及EDC HCl 4.4 g(23.0 mmol)，攪拌反應(yīng)24 h，回收溶劑，油狀殘液加入50 ml乙酸乙酯和 50 ml 10%(w/v)檸檬酸水液，充分振搖，分取乙酸乙酯層，并依次用飽和碳酸鈉水液、水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，回收溶劑得粗品。粗品經(jīng)硅膠H柱色譜分離得白色固體3a 9.1 g,收率為94.3%。MS(ESI+)m/z：573(M+Na，100%)。

按二肽3a相同的制備操作， L-脯氨酸叔丁酯(4)2.0 g(11.70 mmol)與N-Fmoc-L-絲氨酸叔丁醚(b)4.7 g(12.27 mmol)、HOBt 2.1 g(15.56 mmol)及EDC HCl 2.9 g(15.14 mmol)反應(yīng)制得白色固體二肽3b 6.0 g，收率為95.7%。MS(ESI+)m/z：559(M+Na，100%)。

2.2.2脯-蘇-鳥三肽(2a)和脯-絲-鳥三肽(2b)的制備 二肽3a 9.1 g(16.55 mmol)溶于60 ml乙腈，于0 ℃下加入二乙胺17.3 ml(165.9 mmol)，攪拌反應(yīng)2.5 h，回收溶劑及二乙胺，P2O5真空干燥，所得膠狀固體按二肽3a相同的合成操作，與Nα-Fmoc-Nδ-Cbz-L-鳥氨酸8.5 g(17.42 mmol)、EDC HC l4.1 g(21.41 mmol)及HOBt 2.9 g(21.48 mmol)，反應(yīng)制得白色固體2a 12.3 g，收率為93.2%。MS(ESI+)m/z：821(M+Na，100%)。

按三肽2a相同的制備操作，二肽3b 6.0 g(11.19 mmol)經(jīng)10倍摩爾量的二乙胺脫Fmoc保護基后，與Nα-Fmoc-Nδ-Cbz -L-鳥氨酸5.5 g(11.27 mmol)、EDC 2.8 g(14.62 mmol)及HOBt 2.0 g(14.81 mmol)反應(yīng)制得白色固體三肽2b 8.1 g，收率92.3%。MS(ESI+)m/z：807(M+Na，100%)。

2.2.3目標(biāo)脂三肽(1ae～1ah)的制備 2a 1.0 g(1.25 mmol)經(jīng)10倍摩爾量的二乙胺脫Fmoc保護基后，與Ie 0.5 g(1.45 mmol)在30 ml無水DMF中室溫攪拌反應(yīng)24 h。反應(yīng)完畢，加2倍量水稀釋，二氯甲烷萃取3次(50 ml×3)，二氯甲烷液用水洗2次，無水硫酸鈉干燥，過濾，回收溶劑所得粗品經(jīng)硅膠H柱分離得淡黃色固體脯-蘇-(Nα-4′-甲氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酰)-鳥三肽(1ae)0.84 g。收率85.3%。MS(ESI-)m/z：786(M，100%)。Anal. Calcd for C44H58N4O9: C 67.18, H 7.38, N 7.12; found C 66.98, H 7.41, N 7.15。

按脂三肽1ae相同的制備操作，三肽2a 1.0 g(1.25 mmol)經(jīng)二乙胺脫Fmoc保護基后分別與1.1倍摩爾量的化合物Ⅰf、Ⅰg和Ih反應(yīng)制得脯-蘇-(Nα-4′-正丙氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酰)-鳥三肽(1af)0.90 g，收率88.2%，MS(ESI+)m/z：837(M+Na，100%)；Anal. Calcd for C46H62N4O9: C 67.81, H 7.62, N 6.88; found C 67.60, H 7.65, N 6.92、脯-蘇-(Nα-4′-正戊氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酰)-鳥三肽(1ag)0.96 g，收率91.0%，MS(ESI+)m/z：865(M+Na，100%)；Anal. Calcd for C48H66N4O9: C 68.41, H 7.84, N 6.65; found C 68.20, H 7.89, N 6.60和脯-蘇-(Nα-4′-正辛氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酰)-鳥三肽(1ah)0.85 g，收率76.7%。MS(ESI+)m/z：1 792(2M+Na，100%)；Anal. Calcd for C51H72N4O9: C 69.23, H 8.14, N 6.33; found C 69.01, H 8.10, N 6.29。

2.2.4目標(biāo)脂三肽(1be～1bh)的制備 按脂三肽1ae相同的制備操作，三肽2b 1.0 g(1.28 mmol)經(jīng)二乙胺脫Fmoc保護基后分別與1.1倍摩爾量的化合物Ie、If、Ig和Ih反應(yīng)制得脯-絲-(Nα-4′-甲氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酰)-鳥三肽(1be)0.89 g，收率90.4%，MS(ESI+)m/z：795(M+Na，100%)；Anal. Calcd for C43H56N4O9: C 66.84, H 7.25, N 7.25; found C 66.65, H 7.28, N 7.27、脯-絲-(Nα-4′-正丙氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酰)-鳥三肽(1bf)0.85 g，收率83.3%，MS(ESI+)m/z：823(M+Na，100%)；Anal. Calcd for C45H60N4O9: C 67.50, H 7.50, N 7.00; found C 67.29, H 7.53, N 7.02、脯-絲-(Nα-4′-正戊氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酰)-鳥三肽(1bg)0.92 g，收率87.1%，MS(ESI+)m/z：851(M+Na，100%)；Anal. Calcd for C47H64N4O9: C 68.12, H 7.73, N 6.76; found C 67.91, H 7.76, N 6.78和脯-絲-(Nα-4′-正辛氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-甲酰)-鳥三肽(1bh)0.99 g，收率89.2%。MS(ESI+)m/z：893(M+Na，100%)；Anal. Calcd for C50H70N4O9: C 68.97, H 8.05, N 6.44; found C 67.78, H 8.08, N 6.46。

3 總結(jié)與討論

以L-脯氨酸叔丁脂(4)為起始原料，用液相法經(jīng)2步脫N-保護基及3步成肽縮合反應(yīng)成功合成了8個目標(biāo)脂三肽1ae～1ah和1be～1bh，為下步新型環(huán)六脂肽胺型抗真菌劑的全合成與活性研究打下了堅實的基礎(chǔ)。該脂三肽合成路線總收率達67.4 %～80.0%，所合成目標(biāo)化合物均為首次報道。

脂肪酸與肽類的成肽鍵縮合反應(yīng)是合成脂肽化合物的關(guān)鍵。在脂肽類化合物的固相或液相合成中，一般采用肽分子中的游離氨基對脂肪酸“活潑酯”的定向親核氨解反應(yīng)來實現(xiàn)。其中，傳統(tǒng)的脂肪酸“活潑酯”多數(shù)為2,4,5-三氯苯酚等多鹵取代苯酚酯[3，4]，但多鹵取代苯酚毒性大。作者采用相對廉價且安全易得的HOBt，成功制備了4′-烷氧基-1,1′-聯(lián)苯-4-羧酸-N-羥基苯并三氮唑“活潑酯”(I,R2CO2Bt)，而且，該步4個脂肪酸“活潑酯”與2個三肽縮合制備8個目標(biāo)脂三肽的收率達76.7%～91.0%，平均收率為87.4%?？傊撃繕?biāo)脂三肽化合物的合成路線具有反應(yīng)條件溫和安全、操作簡便、總收率高等優(yōu)點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

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2010-06-06

[修回日期] 2011-01-04

Synthesisof4′-alkoxy-1,1′-bisphenyl-4-carboxylicacidlipotripeptides

ZHOU Ting, YAO Jian-Zhong, ZHANG Dong-Wei, LIU Hong-Ming, SHENG Chun-Quan, MIAO Zhen-Yuan, ZHANG Wan-Nian

(School of Pharmacy, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China )

ObjectiveTo prepare 4′-alkoxy-1,1′-bisphenyl-4-carboxylic acid lipotripeptides , which is the key intermediates for total synthesis of novel caspofungin-like cyclohexalipopeptide antifungal agents.MethodsStarting from Pro-O-t-Bu , the target compound 1 were prepared via 5 steps including condensation with N-Fmoc-L-Thr(O-t-Bu)-OH (a) or N-Fmoc-L-Ser(O-t-Bu)-OH (b), then removed of N-Fmoc group and coupling with Nα-Fmoc-Nδ-Cbz-L-Orn-OH followed by removal of Nα-Fmoc group and reaction with 4′-alkoxy-1,1-4-carboxylic acid N-hydroxybenzotriazole ester (Ie～If).Results8 target compounds 1ae～1af and 1be～1bf had been synthesized in an overall yield ranged from 67.4% to 80.0%. The structures were confirmed by ESI-MS spectra and elemental analysis.ConclusionThe process developed had several adventages of facile reaction conditions, convenient workup and high yield.

medicinal chemistry; synthesis; lipotripeptide; caspofungin; cyclohexalipopeptide; antifungal agent

國家自然科學(xué)基金(30772674、30930107)和上海市重點學(xué)科建設(shè)基金(B906)資助項目.

周 亭(1984-),女，碩士研究生. E-mail:zhouting8451@sina.com.

姚建忠.E-mail:yaojz@sh163.net.張萬年. E-mail:zhangwnk@hotmail.com.

R914

A

1006-0111(2011)01-0017-04