pIRES2-EGFP-BCL11B真核表達(dá)載體體外表達(dá)的動(dòng)態(tài)分析*

陳 思， 黃 欣， 楊力建， 陳少華， 鄭海濤， 沈 琦， 李 萡， 李揚(yáng)秋,3△

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院血液病研究所，3教育部再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632；2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣東 深圳 518060)

pIRES2-EGFP-BCL11B真核表達(dá)載體體外表達(dá)的動(dòng)態(tài)分析*

陳 思1,2， 黃 欣1， 楊力建1， 陳少華1， 鄭海濤1， 沈 琦1， 李 萡1， 李揚(yáng)秋1,3△

(暨南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院血液病研究所，3教育部再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632；2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，廣東 深圳 518060)

目的： 研究真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-BCL11B(B細(xì)胞白血病/淋巴瘤11B基因)在K293(人胚腎細(xì)胞株)和Raji(人Burkitt 淋巴瘤細(xì)胞株)細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法分別利用脂質(zhì)體和核轉(zhuǎn)染技術(shù)將真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-BCL11B(pBCL11B)轉(zhuǎn)染至K293和Raji細(xì)胞中，并設(shè)立空質(zhì)粒組(pI2)和空轉(zhuǎn)染組(MOCK)作為對(duì)照。通過熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后48 h各組EGFP的表達(dá)，確定轉(zhuǎn)染效率。通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Taqman)技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后24 h各組BCL11B mRNA的表達(dá)情況，通過Western blotting技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后48 h各組BCL11B蛋白的表達(dá)情況。高分辨率活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀察轉(zhuǎn)染后36-72 h重組質(zhì)粒在Raji細(xì)胞增殖過程中的表達(dá)。結(jié)果K293細(xì)胞pBCL11B、pI2和MOCK組的轉(zhuǎn)染效率分別為(71.23±4.62)％、(70.45±3.58)％和(0.30±0.10)％，而Raji細(xì)胞各組的轉(zhuǎn)染效率分別為(23.12±5.94)％、(22.48±6.25)％和(0.30±0.10)％。實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后pBCL11B組在mRNA和蛋白水平均能檢測到BCL11B基因的有效表達(dá)，BCL11B的表達(dá)量均明顯高于pI2組和MOCK組(Plt;0.05)?；罴?xì)胞追蹤顯示轉(zhuǎn)染后36-72 h重組質(zhì)粒在細(xì)胞中可穩(wěn)定表達(dá)且轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以正常分裂增殖。結(jié)論系統(tǒng)分析了真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP-BCL11B轉(zhuǎn)染至K293和Raji細(xì)胞的表達(dá)變化特點(diǎn)，轉(zhuǎn)染后可以檢測到該基因的有效上調(diào)，研究結(jié)果為下一步轉(zhuǎn)染正常人T細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。

基因,BCL11B； 真核表達(dá)載體； K293細(xì)胞； Raji細(xì)胞

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病11B(B-cell lymphoma/leukemia 11B,BCL11B)基因是近年來發(fā)現(xiàn)的Bcl家族的新成員，在T細(xì)胞發(fā)育、分化和增殖中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，BCL11B基因是小鼠胸腺細(xì)胞發(fā)育、分化和存活所必須的基因，BCL11B的缺失會(huì)導(dǎo)致胸腺雙陽性細(xì)胞的陽性選擇受阻、T細(xì)胞受體(T-cell receptor,TCR)α、β發(fā)育受阻及胸腺細(xì)胞凋亡增加[1,2]。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該基因與維持腫瘤性T細(xì)胞株(Juakat和huT-78)的生存密切相關(guān)[3]。但是，BCL11B基因?qū)τ谌祟怲細(xì)胞的作用仍少見報(bào)道，其功能、靶基因及作用機(jī)制也尚未完全清楚。本研究將成功構(gòu)建的pIRES2-EGFP-BCL11B真核表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染至幾乎不表達(dá)BCL11B基因的K293和Raji細(xì)胞中[BCL11B基因mRNA水平基礎(chǔ)表達(dá)量分別為(6.7±0.5)/105個(gè)β2微球蛋白(β2-microglobulin,β2M)拷貝和(1.8±0.2)/105個(gè)β2M拷貝，分析其在真核細(xì)胞中表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化情況，從而為進(jìn)一步轉(zhuǎn)染該基因至正常人T細(xì)胞、明確該基因?qū)φＨ薚細(xì)胞的影響提供基礎(chǔ)研究。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑和儀器 核轉(zhuǎn)染儀及試劑盒(Amaxa)；Chromo 4實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter)；Delta Vision 高分辨率顯微鏡系統(tǒng)(Applied Precision)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；超凈工作臺(tái)(廣興醫(yī)學(xué)生物工程研究所)；電泳儀及轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad)；Trizol 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen)；RPMI-1640 培養(yǎng)液(Gibco)；小牛血清(四季青)；熒光實(shí)時(shí)定量 PCR的Ampli Taq Gold 試劑盒(Roche)；引物(TIB Molbiol)；RIPA蛋白提取試劑盒(申能博彩)；小鼠抗人β-actin單抗(博士德)；兔抗人BCL11B單抗(Bethyl)；兔抗人EGFP單抗、羊抗小鼠IgG和羊抗兔IgG單抗(eBioscience)；DAB顯影試劑盒(Tiangen)；標(biāo)準(zhǔn)品由合作伙伴德國Greifswald大學(xué)血液腫瘤?？芐chmidt教授惠贈(zèng)。

1.2K293和Raji細(xì)胞 為本所保存。

1.3重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-BCL11B 為合作伙伴德國Greifswald大學(xué)Schmidt教授惠贈(zèng)。

2方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組 轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞K293和懸浮細(xì)胞Raji均分為3組，分別為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒組(pBCL11B)、空質(zhì)粒組(pI2)和空轉(zhuǎn)染組(MOCK)。

2.2K293和Raji細(xì)胞培養(yǎng) K293細(xì)胞用含10％ 小牛血清、1×105U/L青-鏈霉素的IMDM培養(yǎng)基，于37 ℃、5％ CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，貼壁細(xì)胞達(dá)80％瓶壁面積時(shí)以0.25％胰酶消化、傳代。Raji細(xì)胞用含10％ 小牛血清、1×105U/L青-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5％ CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.3重組質(zhì)粒的酶切鑒定 將重組質(zhì)粒分別用XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，反應(yīng)體系為為20 μL，包括pIRES2-BCL11B-EGFP重組質(zhì)粒5 μL、10×buffer Tango 4 μL、XhoⅠ和BamHⅠ內(nèi)切酶各1 μL、超純水9 μL，混勻后置于37 ℃作用4 h。酶切產(chǎn)物用1％ 的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2.4脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染K293細(xì)胞株 轉(zhuǎn)染前24 h將K293細(xì)胞傳代、接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中。用無抗生素?zé)o血清的IMDM 培養(yǎng)基分別稀釋5 μg 的pIRES2-BCL11B- EGFP重組質(zhì)粒和15 μL脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000至終體積為300 μL，培養(yǎng)6 h后去上清，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5核轉(zhuǎn)染介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Raji細(xì)胞株 收集2.5×106處于對(duì)數(shù)生長期的Raji細(xì)胞，200×g離心10 min，完全去除上清。用100 μL 預(yù)熱至室溫的NucleofectorTMSolution和Supplement混合液懸浮細(xì)胞，加入5 μg BCL11B重組質(zhì)粒，用核轉(zhuǎn)染專用的移液管混勻后加入核轉(zhuǎn)杯，啟動(dòng)核酸轉(zhuǎn)染儀細(xì)胞特異性程序(M-013)，程序完成后立刻用專用的移液管將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞液，接種于RPMI-1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)6-12 h后離心去上清，更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.6轉(zhuǎn)染效率檢測 收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞約1×105，一方面熒光顯微鏡激發(fā)光下觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent proteins,EGFP)表達(dá)情況；另一方面，離心后用0.5 mL 1×PBS洗2次，重懸吹勻后用200 μL 1×PBS重懸細(xì)胞，在488 nm的激發(fā)光下，用于流式細(xì)胞儀分析EGFP表達(dá)情況。

2.7實(shí)時(shí)定量PCR檢測BCL11B mRNA的表達(dá) 分別收集轉(zhuǎn)染后24 h各組細(xì)胞，常規(guī)方法提取RNA，合成cDNA。熒光實(shí)時(shí)定量PCR總反應(yīng)體積為25 μL，包括dATP、dCTP和dGTP各0.1 mmol/L，dUTP 0.2 mmol/L，0.75 U Ampli Taq Gold 聚合酶，0.25 U 尿嘧啶糖基酶(UNG)，1×PCR緩沖液，4.5 mmol/L MgCl2以及0.5 μmol/L上、下游引物，0.1 μmol/L 6FAM-TAMRA探針和2 μL cDNA或標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)用于熒光實(shí)時(shí)定量PCR的引物和探針具體序列見表1。在50℃ 2 min，95℃ 5 min變性后，共進(jìn)行45循環(huán)擴(kuò)增，每一循環(huán)包括95℃ 15 s和64℃ 1 min。根據(jù)樣本中的β2M拷貝數(shù)，計(jì)算100 000個(gè)β2M拷貝中所含BCL11B拷貝數(shù)。計(jì)算公式為：n=100 000× BCL11B/β2M。

表1 用于實(shí)時(shí)定量PCR(TaqMan)的引物和探針序列

2.8Western blotting檢測BCL11B蛋白的表達(dá) 分別收集轉(zhuǎn)染后48h各組約1.5×106細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液試劑盒提取總蛋白。將各組蛋白樣品按常規(guī)方法定量，并變性后加樣于10％ 的SDS-PAGE膠中，恒壓60 V 30 min后改為80 V 45 min。用半干轉(zhuǎn)儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓15 V 15 min。用3％ blocking reagent封閉NC膜1 h。根據(jù)所需要的蛋白分子量大小(β-actin蛋白42 kD，EGFP蛋白48 kD，BCL11B蛋白120 kD)和預(yù)染marker的指示位置，將NC膜剪成小條帶，分別放入1∶500的小鼠抗人β-actinⅠ抗、1∶500的兔抗人EGFP單抗、1∶5 000的兔抗人BCL11BⅠ抗，4 ℃過夜。再分別放入1∶300的羊抗小鼠和羊抗兔Ⅱ抗，37 ℃孵育1 h。通過DAB試劑盒檢測人內(nèi)參照基因β-actin蛋白、標(biāo)記基因EGFP蛋白以及目的蛋白BCL11B的表達(dá)情況。掃描圖像，最后通過Image Quantition灰度分析軟件分析各組條帶的灰度值，以各組β-actin的灰度值為內(nèi)參照，計(jì)算各組EGFP和BCL11B蛋白水平的表達(dá)情況。

2.9BCL11B基因在Raji細(xì)胞的動(dòng)態(tài)檢測 在轉(zhuǎn)染后36-72 h利用高分辨率活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Raji細(xì)胞中EGFP變化情況。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1pIRES2-BCL11B-EGFP重組質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定

應(yīng)用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切pIRES2-BCL11B-EGFP真核表達(dá)質(zhì)粒，得到大小為2 479 bp和5 255 bp的2條片段，所得片段大小正確。應(yīng)用BCL11B常規(guī)引物PCR擴(kuò)增BCL11B基因，得到大小為193 bp的片段，所得到的片段大小正確，見圖1。

Figure 1.Identification of pIRES2-BCL11B-EGFP recombinant plasmid by electrophoresis analysis.M: 1 kb plus DNA marker; Lane 1: pIRES2-BCL11B-EGFP recombinant plasmid digested by XhoⅠ and BamHⅠ (2 479 bp and 5 255 bp); Lane 2: PCR product of BCL11B (193 bp); Lane 3: pIRES2- BCL11B-EGFP recombinant plasmid.

2重組質(zhì)粒在K293細(xì)胞中的表達(dá)

2.1轉(zhuǎn)染效率檢測

利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后，K293細(xì)胞EGFP表達(dá)情況以明確轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，K293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率較高，其中pBCL11B組的轉(zhuǎn)染效率為(71.23±4.62)％，pI2組的轉(zhuǎn)染效率為(70.45±3.58)％，而MOCK組則幾乎不表達(dá)EFGP，轉(zhuǎn)染效率為(0.30±0.10)％,見圖2。

Figure 2.Detection of the transfection efficiency in K293 cells by fluorescence microscopy(×100) and flow cytometry(FCM).A and B: pBCL11B (fluorescence microscopy); C: pBCL11B (FCM); D and E: pI2 (fluorescence microscopy); F: pI2 (FCM); G and H: MOCK (fluorescence microscopy); I: MOCK (FCM).

2.2mRNA和蛋白水平鑒定BCL11B的表達(dá) Real-time PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，K293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后pBCL11B組的BCL11B基因在mRNA和蛋白水平均能有效表達(dá)。在mRNA水平，用BCL11B在每105個(gè)β2M中的拷貝數(shù)代表BCL11B的絕對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染后24 h pBCL11B組BCL11B的拷貝數(shù)為(1 237 167±1 32 571.0)/105個(gè)β2M拷貝，而pI2組和MOCK組BCL11B的拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于pBCL11B組，在30個(gè)拷貝/105個(gè)β2M拷貝以下，差異顯著(Plt;0.05),見表2。在蛋白水平，經(jīng)Western blotting、DAB顯色及Image Quantition軟件灰度分析比對(duì)，用EGFP、BCL11B與內(nèi)參β-actin的灰度比值代表蛋白表達(dá)相對(duì)量。結(jié)果顯示：在轉(zhuǎn)染后48 h，pBCL11B組、pI2組和MOCK組的EGFP蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(2.01±0.12)、(2.89±0.37)和0，pBCL11B組和pI2組EGFP蛋白的表達(dá)無明顯差異，而這兩組與MOCK組相比，差異均顯著(Plt;0.05)。各組的BCL11B蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(1.35±0.06)、(0.04±0.01)和(0.11±0.03)，pBCL11B組BCL11B蛋白表達(dá)量明顯高于其它2組(Plt;0.05)，見表2、圖3。

表2 K293細(xì)胞中各組BCL11B mRNA和蛋白表達(dá)情況

Figure 3.EGFP and BCL11B protein expression in K293 cells detected by Western blotting.

3重組質(zhì)粒在Raji細(xì)胞中的表達(dá)

3.1轉(zhuǎn)染效率檢測 利用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察經(jīng)核轉(zhuǎn)染24 h后Raji細(xì)胞EGFP的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，懸浮細(xì)胞Raji的轉(zhuǎn)染效率要遠(yuǎn)低于貼壁細(xì)胞K293，pBCL11B組的轉(zhuǎn)染效率為(23.12±5.94)％，pI2組的轉(zhuǎn)染效率為(22.48±6.25)％，而MOCK組則幾乎不表達(dá)EFGP，轉(zhuǎn)染效率為(0.30±0.10)％，見圖4。

Figure 4.Detection of the transfection efficiency in Raji cells by fluorescence microscopy(×100) and flow cytometry(FCM).A and B: pBCL11B (fluorescence microscopy); C: pBCL11B (FCM); D and E: pI2 (fluorescence microscopy); F: pI2 (FCM); G and H: MOCK (fluorescence microscopy); I: MOCK (FCM).

3.2mRNA和蛋白水平鑒定BCL11B的表達(dá) Real-time PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，Raji細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后pBCL11B組的BCL11B基因在mRNA和蛋白水平均能有效表達(dá)。在mRNA水平，轉(zhuǎn)染24 h后pBCL11B組BCL11B的拷貝數(shù)為(21 244±1 370)/105個(gè)β2M拷貝，而pI2組和MOCK組BCL11B的拷貝數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于pBCL11B組，在1個(gè)拷貝/105β2M拷貝以下,見表3。而在蛋白水平，轉(zhuǎn)染后48 h，pBCL11B組、pI2組和MOCK組的EGFP蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.40±0.03)、(0.35±0.07)和(0.02±0.01)，pBCL11B組和pI2組EGFP蛋白的表達(dá)無明顯差異，而這兩組與MOCK組相比，差異均顯著(Plt;0.05)。在轉(zhuǎn)染后48 h，pBCL11B組、pI2組和MOCK組的BCL11B蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.390±0.050)、(0.007±0.002)和0，差異顯著(Plt;0.05)，見表3、圖5。

表3 Raji細(xì)胞中各組BCL11B mRNA和蛋白表達(dá)情況

Figure 5.EGFP and BCL11B protein expression in Raji cells detected by Western blotting.

3.3高分辨率活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)觀測轉(zhuǎn)染后36-72 h期間pBCL11B組細(xì)胞變化情況 利用高分辨率活細(xì)胞成像系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染后36-72 h不間斷連續(xù)觀測pBCL11B組Raji細(xì)胞中EGFP變化情況。圖6顯示，轉(zhuǎn)染后36 h某一個(gè)已經(jīng)表達(dá)EGFP的Raji母細(xì)胞在轉(zhuǎn)染70 h后細(xì)胞形態(tài)及EGFP表達(dá)變化還不是很明顯，見圖6A、B，細(xì)胞處于有絲分裂前期的準(zhǔn)備階段。而在70-72 h間，母細(xì)胞發(fā)生有絲分裂，并且子細(xì)胞也帶有EGFP,見圖6C、D。說明轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞可以正常增殖，并且，所分裂的子細(xì)胞也保留母細(xì)胞攜帶BCL11B重組質(zhì)粒的性狀。

Figure 6.The changes of EGFP expression in Raji cells detected by the high-resolution live cell imaging system(×400).The arrangement of A-D presents the time course..

討 論

BCL11B基因的首次報(bào)道見于2000年[4]，10年來科研工作者對(duì)該基因的功能進(jìn)行了研究?，F(xiàn)已證實(shí)BCL11B基因編碼C2H2型鋅指蛋白，選擇性地結(jié)合特異性靶結(jié)構(gòu)，調(diào)控基因的表達(dá)，但其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能及作用的靶基因尚未完全明確。BCL11B基因既可以作為轉(zhuǎn)錄抑制因子與COUP-TF和NuRD的某些基序結(jié)合來抑制基因的表達(dá)[4,5]，也可以作為轉(zhuǎn)錄活化因子激活I(lǐng)L-2的表達(dá)[6]。最近的研究表明，BCL11B基因不僅與T細(xì)胞的發(fā)育、分化和存活密切相關(guān)，還是中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]、皮膚[8]和牙齒[9]等器官發(fā)育所必須的基因。盡管動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究取得了一定的進(jìn)展[1,2]，但BCL11B基因?qū)τ谌祟怲細(xì)胞的作用仍少見報(bào)道，只有Grabarczyk等[3]曾利用靶向特異性siRNA下調(diào)正常人外周血BCL11B基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BCL11B表達(dá)的缺失對(duì)正常成熟T細(xì)胞無影響。為進(jìn)一步研究BCL11B基因的功能，我們將構(gòu)建成功的pIRES2-BCL11B-EGFP真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至幾乎不表達(dá)BCL11B基因的K293和Raji細(xì)胞株中，試圖了解重組質(zhì)粒在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況，從而為下一步上調(diào)正常人T細(xì)胞的BCL11B基因表達(dá)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。同時(shí)，本課題組也設(shè)計(jì)、合成了針對(duì)BCL11B基因的序列特異性小干擾RNA(siRNA)，下調(diào)高表達(dá)BCL11B基因的腫瘤性T細(xì)胞株Molt-4細(xì)胞中BCL11B基因的表達(dá)，研究對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡產(chǎn)生的影響[10]。siRNA也將用于下調(diào)正常人T細(xì)胞的BCL11B基因表達(dá)，以期全面評(píng)價(jià)BCL11B基因?qū)θ薚細(xì)胞的影響。

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是將目的基因轉(zhuǎn)入某一細(xì)胞中，通過觀察細(xì)胞生物學(xué)功能的變化來認(rèn)識(shí)目的基因的功能，是目前應(yīng)用最多、技術(shù)最成熟的基因功能研究方法[11]。目前常用的基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)包括病毒性表達(dá)系統(tǒng)和非病毒性表達(dá)系統(tǒng)2種。病毒性載體具有轉(zhuǎn)染效率高、目的基因可穩(wěn)定表達(dá)等優(yōu)勢，但存在生物安全性等問題。非病毒性表達(dá)載體目前主要采用質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)和電穿孔等方法使目的基因被宿主細(xì)胞攝取。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法的主要問題是，不同細(xì)胞類型對(duì)外源DNA的攝取能力有所不同，對(duì)于懸浮細(xì)胞和原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果較差。本研究中我們首先利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞K293，效果理想，轉(zhuǎn)染效率在70％以上。同時(shí)，我們嘗試用脂質(zhì)體方式轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞Raji，轉(zhuǎn)染效率不超過5％。隨后，我們選擇了核轉(zhuǎn)染的方法對(duì)Raji細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。核轉(zhuǎn)染技術(shù)是將傳統(tǒng)的電穿孔方法和具有細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)染緩沖液結(jié)合起來，針對(duì)不同的細(xì)胞類型，采用不同的經(jīng)過優(yōu)化的配套轉(zhuǎn)染試劑和轉(zhuǎn)染程序，在達(dá)到最理想的轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)保持細(xì)胞的活力。其最大優(yōu)點(diǎn)是可以直接將外源核酸同時(shí)輸送細(xì)胞核內(nèi)，特別適用于轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞和難于轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞系，且減少了使用病毒載體帶來的生物安全性問題。這項(xiàng)技術(shù)的高轉(zhuǎn)染效率和低毒性使轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的活力以及外源基因在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。本研究利用核轉(zhuǎn)染的方法使較難轉(zhuǎn)染的懸浮細(xì)胞Raji得到了較高的轉(zhuǎn)染效率，證實(shí)了核轉(zhuǎn)染的有效性，為今后通過此方法轉(zhuǎn)染人原代T細(xì)胞提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究共設(shè)立了2個(gè)對(duì)照組，分別是空質(zhì)粒對(duì)照pI2和轉(zhuǎn)染條件對(duì)照MOCK，以判斷質(zhì)粒本身和轉(zhuǎn)染條件對(duì)細(xì)胞的影響。轉(zhuǎn)染后對(duì)目的基因表達(dá)的檢測時(shí)間一般在24到48 h，最佳時(shí)間取決于被表達(dá)的基因本身、可用的檢測靈敏度以及在載體中調(diào)控表達(dá)的元件等，通常在24 h對(duì)mRNA水平進(jìn)行檢測、48 h對(duì)蛋白水平進(jìn)行檢測。本研究的結(jié)果顯示2種細(xì)胞均能在轉(zhuǎn)染后的24 h和48 h分別檢測到BCL11B基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，從而證明了重組質(zhì)粒可以在真核細(xì)胞中有效表達(dá)。此外，本研究還首次利用了高分辨率活細(xì)胞成像系統(tǒng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測了轉(zhuǎn)染36-72 h期間Raji細(xì)胞中pBCL11B組EGFP變化情況。結(jié)果顯示在某一個(gè)已經(jīng)表達(dá)EGFP的Raji細(xì)胞在發(fā)生有絲分裂時(shí)，其子細(xì)胞也帶有EGFP，這說明轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞可以正常增殖，且所分裂的子細(xì)胞保留了母細(xì)胞的性狀。

總之，本研究分別通過脂質(zhì)體和核轉(zhuǎn)染的方法比較系統(tǒng)地分析了pIRES2- BCL11B-EGFP重組質(zhì)粒在不同細(xì)胞株轉(zhuǎn)染的效率、基因和蛋白表達(dá)水平，以及隨著細(xì)胞增殖BCL11B基因的表達(dá)變化等，為分析基因轉(zhuǎn)導(dǎo)提供一些可行技術(shù)方法，更為進(jìn)一步上調(diào)正常人T細(xì)胞及研究BCL11B的功能提供基礎(chǔ)資料。

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DynamicanalysisofinvitroexpressionofB-celllymphoma/leukemia11BgenebyeukaryoticexpressiveplasmidpIRES2-EGFP-BCL11B

CHEN Si1,2,HUANG Xin1,YANG Li-jian1,CHEN Shao-hua1,ZHENG Hai-tao1,SHEN Qi1,LI Bo1,LI Yang-qiu1,3

(1InstituteofHematology,SchoolofMedicine,3KeyLaboratoryforRegenerativeMedicineofMinistryofEducation,JinanUniversity,Guangzhou510632,China;2DepartmentofImmunology,ShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China.E-mail:jnyangqiuli@163.com)

AIM: To analyze the ability of eukaryotic expressive plasmid pIRES2-EGFP-BCL11B to express B-cell lymphoma/leukemia 11B(BCL11B) gene in K293 and Raji cells.METHODSThe eukaryotic expressive plasmid pIRES2-BCL11B-EGFP (pBCL11B) was transfected into K293 cells and Raji cells by the techniques of Lipofectamine and Nucleofector transfection,respectively.Empty plasmid (pI2) and mock-transfection (MOCK) were used as controls.The transfection efficiency was examined by the methods of fluorescence microscopy and flow cytometry 48 h after transfection.The mRNA expression of BCL11B was analyzed at 24 h by real-time quantitative PCR with Taqman technique.The protein levels of BCL11B were determined at 48 h by Western blotting.The expression of recombinant plasmid during proliferation of Raji cells transfected with pIRES2-EGFP-BCL11B were observed by the high-resolution live cell imaging system from 36 h to 72 h.RESULTSThe transfection efficiency in pBCL11B,pI2 and MOCK groups in K293 cells was (71.23±4.62)％,(70.45±3.58)％ and (0.30±0.10)％,respectively.Simultaneously,that in Raji cells was(23.12±5.94)％,(22.48±6.25)％ and (0.30±0.10)％,respectively.Compared with pI2 and MOCK controls,the mRNA and the corresponding proteins of theBCL11Bgene were effectively in up-regulated pBCL11B group (Plt;0.05).The results of high-resolution live cell imaging system showed that the recombinant plasmid stably expressed EGFP protein from 36 h to 72 h after transfection,and the transfected cells proliferated normally.CONCLUSIONBCL11B gene is effectively up-regulated in K293 and Raji cells after transfected with pIRES2-BCL11B-EGFP eukaryotic expressive plasmid,indicating a useful way for subsequent step in human T-cells transfection.

Genes,BCL11B; Eukaryotic expression vector; K293 cells; Raji cells

1000-4718(2011)05-0944-07

R733.73

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.05.021

2010-08-31

2011-03-17

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30771980)；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2007B030703008;No.2009B050700029)

△通訊作者 Tel: 020-85226877; E-mail: jnyangqiuli@163.com