siRNA下調(diào)astrocyte elevated gene-1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響的體外研究

劉海燕, 姜玉杰, 孫若鵬

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院 1兒科，2血液科，山東 濟(jì)南 250021；3山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科，山東 濟(jì)南 250012)

siRNA下調(diào)astrocyte elevated gene-1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響的體外研究

劉海燕1△, 姜玉杰2, 孫若鵬3

(山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院1兒科，2血液科，山東 濟(jì)南 250021；3山東大學(xué)齊魯醫(yī)院兒科，山東 濟(jì)南 250012)

目的探討siRNA下調(diào)astrocyte elevated gene-1(AEG-1)表達(dá)對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響。方法用設(shè)計合成的AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株M17和SK-N-SH，采用熒光定量RT - PCR技術(shù)觀察AEG-1 siRNA對AEG-1基因表達(dá)的影響；用MTT法和克隆形成實(shí)驗觀察AEG-1 siRNA對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖抑制作用；用流式細(xì)胞術(shù)檢測下調(diào)AEG-1表達(dá)對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響。結(jié)果用AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，RT - PCR結(jié)果證實(shí)AEG-1 siRNA能顯著基因下調(diào)AEG-1表達(dá)，與對照組相比有顯著差異(Plt;0.01)；MTT法和克隆形成實(shí)驗結(jié)果證明下調(diào)AEG-1表達(dá)可顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明下調(diào)AEG-1表達(dá)可促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，并將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。結(jié)論AEG-1 siRNA可下調(diào)基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中表達(dá)，并抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

基因，AEG-1； RNA干擾； 神經(jīng)母細(xì)胞瘤； 細(xì)胞凋亡

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma)是起源于神經(jīng)外胚層的原始神經(jīng)嵴細(xì)胞的原始腫瘤，是繼白血病、腦瘤和惡性淋巴瘤之后居于兒童第4位的腫瘤，占所有兒童惡性腫瘤的8%-10%[1]。此病的臨床特點(diǎn)多變，可以發(fā)展為威脅生命的疾病，也可以自行消退，常常被描述為“神秘莫測”。隨著科技的發(fā)展，多種檢測手段證實(shí)某些生物學(xué)變量與兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤有關(guān)，如：Shimada組織學(xué)分級、腫瘤DNA倍性、腫瘤組織內(nèi)N-myc基因擴(kuò)增、神經(jīng)生長因子受體高親和力基因編碼表達(dá)酪氨酸激酶(tyrosine kinase ，TRK-A)等。盡管如此，神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制還不清楚，更多的關(guān)于影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基因或生物學(xué)標(biāo)記仍待明確。

Astrocyte elevated gene-1(AEG-1)是Su等[2]在2002年首次克隆出來的新基因，由12個外顯子和11個內(nèi)含子組成，位于8q22，該區(qū)域也是人類膠質(zhì)瘤的高度相關(guān)地帶。AEG-1 cDNA的全長為3 611bp，包括多聚A尾，開放閱讀框架從220到1 986堿基，編碼的蛋白由582個氨基酸組成，分子量為64 kD，等電點(diǎn)為9.33[3-5]。

近年來對AEG-1的深入研究發(fā)現(xiàn)，它不僅能促進(jìn)神經(jīng)退行性變的發(fā)生，還能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[6]。最近的研究強(qiáng)烈支持AEG-1是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵基因，但其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)情況，對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖及凋亡的影響還不明確。因此，本課題首次利用RNA干擾技術(shù)，研究AEG-1對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響，為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的基因治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1材料和試劑

1.1細(xì)胞 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系M17和SK-N-SH購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (China Centre for Type Culture Collection, CCTCC)，單層培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液(葡萄糖 4.5 g/L)。

1.2試劑與儀器 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、總RNA提取試劑Trizol、RT - PCR 試劑盒(大連TaKaRa)。CO2培養(yǎng)箱(NU-3500)、倒置熒光顯微鏡(Olympus)、熒光定量PCR儀(ABI7000)、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)。

2方法

2.1siRNA設(shè)計 根據(jù)AEG-1的DNA序列(GenBank Accession No. NC_000008.9)設(shè)計出2個siRNA序列(siRNA1，siRNA2)及無關(guān)對照序列(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)，見表1。

2.2siRNA轉(zhuǎn)染和分組 取人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH和M17以1 ×106cells/well細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞長至80%匯合后，轉(zhuǎn)染操作按Lipofectamine 2000 reagent說明書進(jìn)行，siRNA與脂質(zhì)體分別用適量不含血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)基稀釋，5 min后混合，室溫靜置20 min后加入細(xì)胞板孔中，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，吸除含有Lipofectamine - siRNA的培養(yǎng)液，每孔加入2 mL新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分組：實(shí)驗分為空白對照組(parental cells，無特殊處理組)、陰性對照組(control-siRNA處理)和實(shí)驗組(AEG-1 siRNA1、AEG-1 siRNA2處理)。

表1 合成的AEG-1 siRNA及無關(guān)對照siRNA序列

2.3熒光定量RT-PCR檢測AEG-1 mRNA 收獲轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，細(xì)胞總RNA提取采用Trizol一步抽提法。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA(TaKaRa RT kit)。AEG-1上游引物:5’-GGC AAT TGG GTA GAC GAA GA-3’，下游引物:5’-CCT GTT TTG GAC GGG TTT TA-3’。GAPDH(內(nèi)參照)上游引物: 5’-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3’，下游引物 5’-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3’。寡核苷酸引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。SYBR green system(TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法依照說明書。冰浴條件下操作，徹底混合后放入熒光定量PCR儀(ABI7000型)。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 5 min后，95 ℃ 30 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。每份標(biāo)本設(shè)3個復(fù)孔, 實(shí)驗重復(fù)3次。用比較閾值法(即2-ΔΔCT方法)來測定目的基因的相對表達(dá)變化。

2.4細(xì)胞生長曲線檢測 用0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染48 h后的單層培養(yǎng)細(xì)胞，用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔2 000個細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL。將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，使細(xì)胞達(dá)到80%匯合。在不同時點(diǎn)(4 h、24 h、48 h、72 h)移棄細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加入含MTT溶液(5 g/L)10 μL的新鮮培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，輕輕振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上調(diào)定各孔吸光度值(A)，記錄結(jié)果。以只加培養(yǎng)液、不加細(xì)胞的空白對照孔調(diào)零。實(shí)驗重復(fù)3次。以時間為橫軸，吸光度值為縱軸繪制細(xì)胞生長曲線。

2.5克隆形成 轉(zhuǎn)染48 h后的單層培養(yǎng)細(xì)胞，消化脫壁后用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，按每個10 cm平皿接種200個細(xì)胞的密度，加培養(yǎng)液10 mL，以十字方向輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細(xì)胞分散均勻。每種細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔。靜止培養(yǎng)14d。移棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后，用醋酸甲醇(1∶4)溶液固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。在顯微鏡下計數(shù)克隆，大于50個細(xì)胞的克隆計數(shù)在內(nèi)。實(shí)驗重復(fù)3次。

2.6細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測 轉(zhuǎn)染48 h后的單層培養(yǎng)細(xì)胞，消化液消化后，用4 ℃預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞2次，用250 μL 1×binding buffer重懸細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)其濃度為1×109cells/L。取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，設(shè)a、b、c、d 4管，a管加入5 μL Annexin-V-FITC，b管加入10 μL PI染液，c管加入5 μL Annexin-V-FITC和10 μL PI染液；d管作為分析的空白對照?；靹蚝笫覝乇芄夥跤?5 min。在反應(yīng)管中加入400 μL PBS，上機(jī)檢測。流式細(xì)胞儀分析：用Cell Quest軟件獲取細(xì)胞，先用d管作空白對照設(shè)定FSC、SSC、FITC和PI等參數(shù)，再用a、b管調(diào)整熒光1和熒光2的補(bǔ)償，各參數(shù)設(shè)定好后，分析c管的數(shù)據(jù)。實(shí)驗重復(fù)3次。

2.7細(xì)胞周期 轉(zhuǎn)染48 h后的單層培養(yǎng)細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。PBS洗滌2次(1 000 r/min離心5 min)，用冷PBS懸浮細(xì)胞，濃度(1-2)×109cells/L。加入2-3 mL -20 ℃ 預(yù)冷70%乙醇固定細(xì)胞，4 ℃，1 h。PBS洗滌2次(1 000 r/min離心5 min)。細(xì)胞沉淀加1 mL PI染色液，混勻，4 ℃避光染色30 min，300目尼龍網(wǎng)過濾后上機(jī)檢測。首先設(shè)定合適的獲取條件，用CellQuest軟件獲取細(xì)胞10 000個，保存獲取數(shù)據(jù)。再用Modifit軟件分析細(xì)胞周期。實(shí)驗重復(fù)3次。

3統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1siRNA下調(diào)AEG-1基因表達(dá)的效果

與空白對照組(parental cells)和陰性對照組(control siRNA)相比，針對2個不同序列的siRNA均能顯著下調(diào)AEG-1基因表達(dá)，M17細(xì)胞的AEG-1 mRNA表達(dá)抑制率分別為41.8%和34.5%；SK-N-SH細(xì)胞的AEG-1 mRNA表達(dá)抑制率分別為61.8%和43.6%，見圖1。2個細(xì)胞株中的實(shí)驗結(jié)果表明AEG-1 siRNA1能更好地下調(diào)基因的表達(dá)，因此后面的實(shí)驗均用AEG-1 siRNA1轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

Figure 1. Knock-down of AEG-1 by specific siRNAs. Fourty-eight hours after transfection, cells were harvested. AEG-1 mRNA levels were quantified by real-time PCR analysis. Data were normalized using GAPDH as an internal standard. ±s.n=3.*Plt;0.05 vs parental cells.

2siRNA下調(diào)AEG-1表達(dá)抑制細(xì)胞的增殖

2.1MTT法檢測細(xì)胞生長曲線 結(jié)果顯示，AEG-1 siRNA組的細(xì)胞增殖較陰性對照組和空白對照組均明顯減慢。72 h時M17細(xì)胞AEG-1 siRNA組吸光度值與空白對照組相比為42.9%，SK-N-SH細(xì)胞為49.5%，差異顯著(Plt;0.05)，見圖2。

Figure 2. AEG-1 siRNA inhibits cell proliferation in neuroblastoma cells. Cell viability was evaluated by MTT assay. The results showed a significant decrease in the number of cells by 42.9% in M17 cells (A) and 49.5% in SK-N-SH cells (B) .±s.n=3.*Plt;0.05 vs AEG-1 siRNA1.

2.2克隆形成實(shí)驗 結(jié)果顯示，AEG-1 siRNA組細(xì)胞增殖減慢(Plt;0.05)。M17細(xì)胞的AEG-1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組形成的克隆數(shù)分別為81.5±7.5、134.1±10.3、143.2±10.1，SK-N-SH細(xì)胞的AEG-1 siRNA組、陰性對照組、空白對照組形成的克隆數(shù)分別為62.3±7.4、116.3±10.8、121.2±9.8，見圖3。

Figure 3. AEG-1 siRNA inhibits proliferation in neuroblastoma cells. Compared with the parental cells, the number of colonies was significantly reduced in AEG-1 siRNA1 group±s.n=3.*Plt;0.05 vs parental cells.

3siRNA下調(diào)AEG-1基因表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞儀檢測可見, 細(xì)胞轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA后，凋亡率明顯增加。M17細(xì)胞實(shí)驗組凋亡率為14.2%±2.4%，而陰性對照組和空白對照組凋亡率分別為3.9% ±1.4%和3.4% ±1.3%，實(shí)驗組與陰性對照組、空白對照組相比差異顯著(Plt;0.01) ；空白對照與陰性對照相比，凋亡率的差異不顯著(Pgt;0.05) 。轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA后，SK-N-SH細(xì)胞凋亡率達(dá)到12.9%±2.2%,而陰性對照組和空白對照組凋亡率分別為5.1%±1.5%和4.9%±1.6%，實(shí)驗組與陰性對照組、空白對照組相比差異顯著(Plt;0.01)；空白對照與陰性對照相比，凋亡率無顯著差異 (Pgt;0.05)，見圖4。

4下調(diào)AEG-1基因表達(dá)對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響

應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測M17和SK-N-SH細(xì)胞轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA后48 h細(xì)胞周期的變化，與陰性對照組比較，下調(diào)AEG-1后的DNA合成前期(G0/G1期)細(xì)胞比率顯著增加，合成期(S)和DNA合成后期/分裂期(G2/M)細(xì)胞比率明顯減少，見圖5。

討 論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是嬰兒最易發(fā)生的腫瘤，占1歲以內(nèi)的患兒所有腫瘤的50%；是兒童第二大致死性原因，僅次于意外事故。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的不均一性是與其它腫瘤相比最與眾不同的特性。盡管現(xiàn)有多種積極治療手段，但其總生存率僅大約為40%。雖然神經(jīng)母細(xì)胞瘤的一些亞型可能會自然消退或進(jìn)展非常緩慢，但確診時大約一半的病例為高?；颊摺Ｔ谶^去的30年里在診斷治療等方面都取得了很大進(jìn)展，可是神經(jīng)母細(xì)胞瘤對臨床和基礎(chǔ)科學(xué)工作者來說仍是一個挑戰(zhàn)。闡明其確切的分子通路可能會有助于研究人員和臨床醫(yī)師選擇合適的治療方案對待腫瘤的復(fù)發(fā)和進(jìn)展。

Figure 5. Knock-down of AEG-1 reduces S-and G2/M-phase cells. A：in both M17 and SK-N-SH cells 48 h after AEG-1 siRNA1 transfection, the population of G0/G1 phase was significantly increased and the population of S phase and G2/M phase was obviously decreased±s.n=3.*Plt;0.05 vs parental cells. B： representative results were shown.

AEG-1是近年發(fā)現(xiàn)的新基因[2,3, 5]。隨著對AEG-1的深入研究，發(fā)現(xiàn)AEG-1不僅促進(jìn)神經(jīng)退行性變的發(fā)生，還促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，是腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵基因[7-9]。AEG-1在多種腫瘤組織和體外培養(yǎng)的細(xì)胞中高表達(dá)，如：乳腺癌[10]、多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤[9]、前列腺癌[11]、黑色素瘤[12]、肝細(xì)胞癌[13]等。AEG-1參與了多種調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移的信號通路的激活。AEG-1是NF-κB誘導(dǎo)基因表達(dá)的正性調(diào)節(jié)蛋白[14]。AEG-1還是Ha-ras的下游基因，Ha-ras調(diào)控AEG-1主要在轉(zhuǎn)錄水平而不是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[15]，它通過激活PI3K/GSK3β/c-Myc信號通路調(diào)控AEG-1的表達(dá)[12]。Kikuno等[14]的研究表明在前列腺癌細(xì)胞中AEG-1的過表達(dá)作為AKT正反饋的激活物和FOXO3a的抑制因子起著重要的作用；Yoo等[16]通過對肝細(xì)胞癌的研究還發(fā)現(xiàn)AEG-1通過激活ERK42/44和上調(diào)Wnt信號通路最后的效應(yīng)器-淋巴增強(qiáng)因子1(LEF1/TCF1)來激活對肝細(xì)胞癌的發(fā)生起重要作用的Wnt/beta-catenin信號通路。以上的信號通路對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移起著重要作用。國外的多項研究結(jié)果證實(shí)AEG-1作為其參與者，是在腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面起重要作用的基因。

本實(shí)驗用siRNA下調(diào)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株中AEG-1基因的表達(dá)，通過檢測AEG-1基因下調(diào)對細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期等生物學(xué)特性的影響研究探討AEG-1在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中所起的作用。采用MTT法和克隆形成實(shí)驗檢測神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力，2種方法所得到的結(jié)果是一致的,即下調(diào)AEG-1能夠顯著降低神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力。同時，下調(diào)AEG-1能增加細(xì)胞的凋亡率，說明AEG-1在細(xì)胞凋亡的過程中起了重要作用。細(xì)胞周期結(jié)果也表明下調(diào)AEG-1能夠使更多的細(xì)胞阻滯在G0/G1期，減少處于增殖旺盛的細(xì)胞的比例。而空白對照組與陰性對照組之間沒有顯著差異。研究結(jié)果初步顯示利用RNA干擾技術(shù)能阻斷AEG-1的異常高表達(dá)，下調(diào)AEG-1的表達(dá)，在一定程度上抑制了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。表明AEG-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用，可能是神經(jīng)母細(xì)胞瘤的基因治療中有前景的新靶點(diǎn)。

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Knockdownofastrocyteelevatedgene-1bysiRNAinhibitscellproliferationandinducesapoptosisinhumanneuroblastomacellline

LIU Hai-yan1, JIANG Yu-jie2, SUN Ruo-peng3

(1DepartmentofPediatrics,2DepartmentofHematology,ProvincialHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Jinan250021,China;3DepartmentofPediatrics,QiluHospital,ShandongUniversity,Jinan250012,China.E-mail:liuhaiyan26@yahoo.com.cn)

AIM: To investigate the effect of siRNA-induced astrocyte elevated gene-1 (AEG-1) down-regulation on the proliferation, apoptosis and cell cycle of neuroblastoma cells.METHODSAn siRNA targeting to AEG-1 mRNA (AEG-1 siRNA) was constructed and transfected into neuroblastoma cells with Lipofectamine 2000. A non-specific siRNA (control siRNA) and non-treatment were used as negative control and blank control,respectively . The cell proliferation was detected by MTT method and colony formation assay. The apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry.RESULTSCompared with control groups, the expression of AEG-1 mRNA was evidently declined in the cells transfected with AEG-1 siRNAs (Plt;0.05). AEG-1 siRNA significantly decreased the cell proliferation. After treated with AEG-1 siRNA for 48 h, the percentage of apoptotic cells was significant increased and the cell cycle was arrested in G0/G1phase compared with the control cells (Plt;0.05).CONCLUSIONThe mRNA expression ofAEG-1 is down-regulated by AEG-1 siRNA in neuroblastoma cells. Knockdown ofAEG-1 expression in human neuroblastoma cells significantly inhibits cell proliferation and apoptosis, and induces cell arrest in G0/G1phase of the cell cycle.

Genes,AEG-1; RNA interference; Neuroblastoma; Apoptosis

1000-4718(2011)04-0705-06

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.016

2010-08-13

2010-12-09

△通訊作者 Tel：0531-85186335；E-mail：liuhaiyan26@yahoo.com.cn