p38 MAPK參與千金藤素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡*

李素芳， 林 森， 張幼怡， 袁 谷， 徐 明△

(1北京大學(xué)第三醫(yī)院血管醫(yī)學(xué)研究所，分子心血管教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；2北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，北京分子科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物有機(jī)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100871)

p38 MAPK參與千金藤素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡*

李素芳1， 林 森2， 張幼怡1， 袁 谷2， 徐 明1△

(1北京大學(xué)第三醫(yī)院血管醫(yī)學(xué)研究所，分子心血管教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；2北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系，北京分子科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，生物有機(jī)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100871)

目的探討千金藤素(CEP)致Sprague-Dawley(SD)乳大鼠心肌細(xì)胞的凋亡作用及其信號(hào)途徑。方法應(yīng)用MTT法檢測(cè)千金藤素對(duì)心肌細(xì)胞活性的抑制作用；利用Hoechst 33342染色及Western blotting方法檢測(cè)凋亡相關(guān)信號(hào)分子caspase-3，觀察CEP致心肌細(xì)胞凋亡的作用；采用Western blotting法觀測(cè) CEP對(duì)有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族3個(gè)主要信號(hào)分子c - Jun氨基端激酶(JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、p38 MAPK磷酸化水平的影響，并利用ERK和p38 MAPK的特異性抑制劑，分別驗(yàn)證兩種分子所介導(dǎo)的信號(hào)通路在CEP致心肌細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果(1)CEP能夠劑量依賴和時(shí)間依賴地抑制心肌細(xì)胞的活性。(2)CEP作用于心肌細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂現(xiàn)象和caspase-3激活。(3)CEP作用下p38 MAPK和ERK磷酸化水平顯著增強(qiáng)，JNK的磷酸化狀態(tài)未發(fā)生顯著改變。(4)p38 MAPK磷酸化抑制劑SB203580顯著減輕CEP對(duì)心肌細(xì)胞活性的抑制作用；ERK磷酸化抑制劑PD98059不能影響CEP對(duì)心肌細(xì)胞活性的抑制作用。結(jié)論p38 MAPK參與CEP致心肌細(xì)胞凋亡作用。

千金藤素； 心肌細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 有絲分裂素激活蛋白激酶類

千金藤素(cepharanthine，CEP) 是從防己科植物頭花千金藤和地不容中分離提取的雙芐基異喹啉生物堿[1]。在我國，臨床研究發(fā)現(xiàn)CEP具有升高白細(xì)胞的作用[2]。國外學(xué)者的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CEP具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用[3,4]:CEP作用于HuH-7細(xì)胞(人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系)從15μmol/L到20mmol/L，均明顯抑制細(xì)胞活性；10 μmol/L的CEP明顯引起Jurkat細(xì)胞(人類T細(xì)胞白血病細(xì)胞系)、K562細(xì)胞(人類慢性髓性白血病細(xì)胞系)凋亡。但是目前關(guān)于CEP對(duì)其它類型細(xì)胞的毒副作用缺少相關(guān)報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，10 μmol/L濃度的CEP可以顯著抑制心肌細(xì)胞活性，提示其可能具有潛在的心臟毒副作用。本文通過體外培養(yǎng)乳大鼠心肌細(xì)胞，觀察CEP致心肌細(xì)胞凋亡的作用，并進(jìn)一步探討其可能的藥物作用途徑。

材 料 和 方 法

1材料

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)和胰酶均購自Hyclone；II型膠原酶、ERK磷酸化抑制劑PD98059、p38 MAPK磷酸化抑制劑SB203580和Hoechst 33342均購自Sigma；抗ERK1(K-23)抗體、抗p38 MAPK抗體、抗GAPDH抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgGⅡ抗均購自Santa Cruz；抗phospho-ERK1/2抗體、抗phospho-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185)抗體、抗phospho-p38MAPK抗體和抗caspase-3抗體均購自Cell Signaling；千金藤素購自中國藥品生物制品檢定所；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、噻唑蘭[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]和Triton X-100均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；Hanks BSS購自Decent Biotech；二喹林甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和化學(xué)發(fā)光底物(SuperSignal West Pico enhanced-chemiluminescent substrate，ECL)試劑盒均購自Pierce；硝酸纖維素膜購自Pall。

2方法

2.1新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 取出生1-2 d的Sprague-Dawley(SD)新生大鼠(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供)進(jìn)行新生大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，方法同前[5]。心肌細(xì)胞懸液，接種于直徑100 mm的培養(yǎng)皿中， 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h 后，更換為無血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細(xì)胞處理分為3組：對(duì)照組、CEP處理組、CEP + 磷酸化抑制劑處理組(CEP + SB203580 、CEP + PD98059 )和磷酸化抑制劑處理組(SB203580、PD98059)。提前30 min分別加入SB203580或PD98059，終濃度為10 μmol/L。

2.2細(xì)胞活性檢測(cè) 采用MTT法，方法同前[6]。細(xì)胞種到96孔板，5×104cells/well，藥物處理后，換為含5 g/L MTT的1×PBS溶液。繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)(37 ℃、2%CO2)培養(yǎng)4 h后，將溶液吸棄，每孔加入15 μL DMSO溶解結(jié)晶，15 min后待結(jié)晶完全溶解，在波長570 nm處讀取吸光值，間接反映活細(xì)胞數(shù)量。

2.3細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Hoechst 33342染色法。約2×105cells/well心肌細(xì)胞接種于6孔板，處理組給予10 μmol/L CEP孵育48 h 。吸棄培養(yǎng)液，PBS溶液(37℃溫浴)洗2遍。每孔加入4%多聚甲醛(37 ℃溫浴)200μL，室溫固定15 min， PBS溶液洗3次，每次5 min，加入0.2% Triton X-100，37 ℃破膜15 min，0.3% Triton X-100室溫洗3次，每次5 min。每孔加入200 μL Hoechst 33342室溫染色15 min，終濃度為40 mg/L。0.3% Triton X-100室溫洗3次，每次5 min，在倒置熒光顯微鏡下采集觀察細(xì)胞核的形態(tài)。

2.4蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。106cells/well，細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入65 μL裂解液[含20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L sodium pyrophosphate， 5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaF，1 mmol/L sodium vanadate，0.1% SDS，10% glycerol，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1 mmol/L aprotinin，1 mmol/L PMSF]。將細(xì)胞樣本超聲裂解，超聲強(qiáng)度為40 W，每個(gè)樣本超聲3次，每次10 s。4 ℃ 12 000×g離心15 min，收取上清。蛋白濃度測(cè)定采用BCA法。取50 μg蛋白上樣、10%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶或5%BSA粉室溫封閉1 h?？筩aspase-3抗體、抗p-ERK1/2抗體、 抗ERK1/2抗體、抗p-JNK抗體、抗p-p38 MAPK抗體、抗p38 MAPK抗體、GAPDH抗體，按照1∶1 000稀釋的濃度雜交，4 ℃過夜。1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgGⅡ抗室溫雜交1 h，采用ECL試劑顯色并曝光成像。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1MTT法檢測(cè)CEP對(duì)心肌細(xì)胞活性的影響

CEP可以劑量和時(shí)間依賴性抑制心肌細(xì)胞的活性。與對(duì)照組相比， 3 μmol/L、5 μmol/L 、10 μmol/L CEP孵育心肌細(xì)胞，細(xì)胞活性明顯減低。CEP孵育48 h，3 μmol/L細(xì)胞活性減低至61.3% ± 8.3%(Plt;0.01)，5 μmol/L細(xì)胞活性減低至50.5%±9.7%(Plt;0.01)，而10 μmol/L細(xì)胞活性降至2.2% ± 0.8%(Plt;0.01)；10 μmol/L CEP 孵育心肌細(xì)胞，12 h 細(xì)胞活性顯著下降，細(xì)胞活性降至80.8%±0.3%(Plt;0.01)，24 h細(xì)胞活性降至55.1% ± 9.0%(Plt;0.01)，見圖1。

Figure 1. Effects of CEP on myocardial cell viability. A: the cardiomyocytes were exposed to different concentrations of CEP (0-10 μmol/L) for 48 h; B: the cells were exposed to 10 μmol/L of CEP for 12 h, 24 h and 48 h. Cell viability was determined by MTT assay. ±sE.n=3. **Plt;0.01 vs control group(0 μmol/L or 0 h).

2CEP誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡

與對(duì)照組相比，10 μmol/L CEP作用心肌細(xì)胞48 h后，細(xì)胞核皺縮、核碎裂現(xiàn)象明顯，箭頭所指處為發(fā)生核碎裂的細(xì)胞，見圖2A。檢測(cè)caspase-3的激活情況，可以見到剪切體caspase-3即激活的caspase-3增多，見圖2B。

Figure 2. Effects of CEP on apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes. A: the Hoechst staining for the detection of cardiomyocytes with the apoptotic morphology. Cardiomyocytes were treated with CEP (10 μmol/L) for 48 h,and then fixed and stained with Hoechst 33342. The fragmented nucleus of apoptotic cells were observed under fluorescence microscope;B: Western blotting analysis of CEP-induced expression of cleaved caspase-3.Cleaved caspase-3 increased in cardiomyocytes incubated with CEP(10 μmol/L) for 48 h. Con:control.

3CEP對(duì)p38MAPK、EKR1/2和JNK1/2活性的影響

CEP分別孵育心肌細(xì)胞3 h、6 h、12 h和24 h。Western blotting結(jié)果顯示， p38 MAPK磷酸化水平在各時(shí)點(diǎn)均較對(duì)照組明顯增高；ERK1/2磷酸化水平在3 h、6 h和12 h較對(duì)照組明顯增強(qiáng)，24 h磷酸化水平無明顯變化；而JNK1/2的活性未受到顯著影響，見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CEP可顯著激活p38 MAPK和ERK1/2，提示p38 MAPK和ERK1/2可能與CEP的致細(xì)胞凋亡作用相關(guān)。

4抑制p38MAPK和ERK1/2的磷酸化對(duì)CEP致心肌細(xì)胞凋亡作用的影響

CEP + SB203580組細(xì)胞活性較高于CEP組[(74.0 ± 4.7)%vs(45.5± 4.1)%,Plt;0.01]，見圖4A；CEP + PD98059組細(xì)胞的活性與CEP組無明顯差異[(52.8± 4.8)%vs(53.7± 4.8)%]，見圖4B。

Figure 3. Effects of CEP on p38 MAPK, ERK1/2 and JNK1/2 activation. The cells were exposed to 10 μmol/L CEP for 3 h, 6 h, 12 h and 24 h. The phosphorylation levels of p38 MAPK, ERK1/2 and JNK1/2 were determined by Western blotting.Con:control.

Figure 4. Effects of p38 MAPK inhibitor SB203580 (SB,10 μmol/L) (A) and ERK1/2 inhibitor PD98059 (PD,10 μmol/L) (B) on the apoptosis induced by CEP (10 μmol/L). ±sE. n=3. **Plt;0.01 vs Con group; ##Plt;0.01 vs CEP group.Con:control.

討 論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)CEP孵育心肌細(xì)胞，可以劑量和時(shí)間依賴地降低心肌細(xì)胞活性。這一發(fā)現(xiàn)亦在腫瘤細(xì)胞Jurkat(人類T細(xì)胞白血病細(xì)胞系)、K562 (人類慢性髓性白血病細(xì)胞系)、HuH-7(人類肝細(xì)胞癌細(xì)胞系)等細(xì)胞觀察到相同現(xiàn)象[3，4，7]。這種對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用均是因?yàn)檎T導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。凋亡是細(xì)胞常見的死亡方式之一，但因?yàn)榇嬖凇暗蛲鲆鸬睦^發(fā)性壞死”這一現(xiàn)象，而使凋亡和壞死變的不易區(qū)分。在本實(shí)驗(yàn)中， CEP孵育心肌細(xì)胞后，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞隨著CEP孵育時(shí)間的延長逐步出現(xiàn)“皺縮”現(xiàn)象，并未出現(xiàn)“腫脹”等壞死所具有的特征(圖2)。在此基礎(chǔ)上，通過Hoechst核染色，觀察到細(xì)胞核的碎裂，利用Western blotting亦觀察到caspase-3的明顯激活，上述結(jié)果提示細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)，而非壞死。但是這并不能排除凋亡引起的繼發(fā)性壞死，因?yàn)槔^發(fā)性壞死也存在caspase-3的激活，要確定本實(shí)驗(yàn)中心肌細(xì)胞是否存在繼發(fā)性壞死，有待于通過流式細(xì)胞分析術(shù)和透射電子顯微鏡等實(shí)驗(yàn)[8]進(jìn)一步鑒定。

近幾年關(guān)于CEP致細(xì)胞凋亡作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域。研究提示其作用機(jī)制主要涉及MAPKs家族的3個(gè)蛋白質(zhì)分子：JNK1/2、ERK1/2、p38 MAPK[3，4，7]。那么CEP致心肌細(xì)胞凋亡的效應(yīng)是否與MAPKs家族這3個(gè)信號(hào)分子相關(guān)，每個(gè)信號(hào)途徑的作用是否存在差異呢？本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CEP作用下ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化水平明顯升高，提示CEP可能通過ERK1/2和p38 MAPK發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)。但是進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ERK1/2的抑制劑未能顯著抑制CEP引起的心肌細(xì)胞活性下降，究竟CEP介導(dǎo)的ERK1/2的激活存在何種作用，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。p38 MAPK的抑制劑明顯減低了CEP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞活性下降，提示p38 MAPK在CEP誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中具有重要作用。研究表明CEP可以使細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平顯著升高[9]，而ROS又可以激活p38 MAPK，由此我們推測(cè)CEP致心肌細(xì)胞凋亡可能經(jīng)由ROS-p38 MAPK信號(hào)途徑。JNK和p38 MAPK激活的通路基本上是一致的[10]，但本實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到JNK的磷酸化變化，一方面，可能與JNK的激活窗口和模式有關(guān)，另一方面，可能與腳手架蛋白的作用有關(guān)[11，12]，如JIP、SKRP1、β-arrestin-2等，它們的存在使CEP的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有了相對(duì)特異性，這還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

目前，CEP主要被用于治療因腫瘤化療造成的白細(xì)胞減少癥。CEP藥物代謝動(dòng)力學(xué)的研究表明[13]，血漿內(nèi)濃度為1-2 mg/L (1.35 μmol/L-2.70 μmol/L) 不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生任何副作用。但是本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，3 μmol/L CEP即可顯著抑制心肌細(xì)胞活性，所以提示我們使用CEP時(shí)需要注意CEP的潛在心臟毒副作用。總之，本研究為CEP的心肌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)提供了新的線索。

[1] 李 紅，周東海，黃麗春，等. 千金藤素在家兔體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究[J]. 工業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病, 1997, 23(5): 313 -314.

[2] 肖 懷，劉光明，王 卓,等. 千金藤素片含量測(cè)定方法改進(jìn)[J]. 中成藥, 2005, 27 (3): 362 -364.

[3] Biswas KK, Tancharoen S, Sarker KP, et al. Cepharanthine triggers apoptosis in a human hepatocellular carcinoma cell line (HuH-7) through the activation of JNK1/2 and the downregulation of Akt[J]. FEBS Lett, 2006, 580(2): 703 -710.

[4] Wu J, Suzuki H, Zhou YW, et al. Cepharanthine activates caspases and induces apoptosis in Jurkat and K562 human leukemia cell lines[J]. J Cell Biochem, 2001, 82(2): 200 -214.

[5] Feng W, Song Y, Zhang Y, et al. Stimulation of adenosine A2Breceptors induces interleukin-6 secretion in cardiac fibroblasts via the PKC-δ-P38 signalling pathway[J]. Br J Pharmacol, 2010, 159(8): 1598 -1607.

[6] Liu X, Gai Y, Xu M, et al. Trimetazidine inhibits pressure overload-induced cardiac fibrosis through NADPH oxidase-ROS-CTGF pathway[J]. Cardiovasc Res, 2010, 88(1): 150 -158.

[7] Wu J, Suzuki H, Akhand AA, et al. Modes of activation of mitogen-activated protein kinases and their roles in cepharanthine-induced apoptosis in human leukemia cells[J]. Cell Signal, 2002, 14(6): 509 - 515.

[8] Krysko DV, Vanden-Berghe T, D’Herde K, et al. Apoptosis and necrosis: detection, discrimination and phagocytosis[J]. Methods, 2008, 44(3): 205 -221.

[9] Furusawa S, Wu J, Fujimura T, et al. Cepharanthine inhibits proliferation of cancer cells by inducing apoptosis[J]. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 1998, 20(2): 87 -97.

[10]Muslin AJ. MAPK signalling in cardiovascular health and disease: molecular mechanisms and therapeutic targets[J]. Clin Sci (Lond), 2008, 115(7): 203 -218.

[11]Morrison DK, Davis RJ. Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2003, 19: 91-118.

[12]Whitmarsh AJ. The JIP family of MAPK scaffold proteins [J]. Biochem Soc Trans, 2006, 34( 5): 828 -832.

[13]Furusawa S, Wu J. The effects of biscoclaurine alkaloid cepharanthine on mammalian cells: implications for cancer, shock, and inflammatory diseases[J]. Life Sci, 2007, 80(12): 1073-1079.

p38MAPKinvolvesincepharanthine-inducedapoptosisincardiomyocytes

LI Su-fang1, LIN Sen2, ZHANG You-yi1, YUAN Gu2, XU Ming1

(1InstituteofVascularMedicine,PekingUniversityThirdHospitalandKeyLaboratoryofMolecularCardiovascularSciences,MinistryofEducation,Beijing100191,China;2DepartmentofChemicalBiology,CollegeofChemistryandMolecularEngineering,PekingUniversity,BeijingNationalLaboratoryforMolecularSciences,KeyLaboratoryofBioorganicChemistryandMolecularEngineering,MinistryofEducation,Beijing100871,China.E-mail:xuminghi@bjmu.edu.cn)

AIM: To investigate the apoptotic effect of cepharanthine (CEP) on neonatal rat cardiomyocytes(NRCMs) and the underlying mechanisms.METHODSMTT assay was used to detect the viability of the cells. CEP-induced apoptosis in NRCMs was evaluated by Hoechst 33342 staining and the expression of activated caspase-3. The phosphorylation levels of mitogen-activated protein kinases (MAPKs),such as extracellular signal-regulated kinase (ERK), c-jun N-terminal kinase (JNK) and p38 MAPK,were examined by Western blotting. The specific inhibitors of ERK and p38 MAPK were applied for identifying the roles of the corresponding signal pathways in CEP-induced apoptosis of cardiomyocytes.RESULTSCEP inhibited the viability of NRCMs in a dose-and time-dependent manners. Positive nuclear fragmentation and activated caspase-3 were found in CEP-treated NRCMs. The phosphorylation levels of ERK and p38 MAPK were significantly elevated in CEP-treated NRCMs, but the change of JNK was not obvious. SB203580, an inhibitor of p38 MAPK, significantly alleviated the apoptotic effect induced by CEP. However, PD98059, an inhibitor of ERK1/2, did not significantly reduce the apoptotic effect.CONCLUSIONp38 MAPK is involved in CEP-induced apoptosis in NRCMs.

Cepharanthine; Cardiomyocytes; Apoptosis; Mitogen-activated protein kinases

1000-4718(2011)04-0638-05

R34

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.003

2010-12-30

2011-02-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30821001；No.90913004；No.81070196)； 北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.7082101)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才和北京市優(yōu)秀人才項(xiàng)目資助項(xiàng)目(No. BMU20100012)

△通訊作者 Tel：010-82265519；E-mail: xuminghi@bjmu.edu.cn