豬胸膜肺炎放線桿菌PCR快速分型系統(tǒng)的建立及應(yīng)用

邱索平，何孔旺，劉中勇，林志雄，陳 文

（1.從化出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東從化 510900；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇南京 210014；3.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州 510623）

豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，App）引起的豬接觸傳染性胸膜肺炎，廣泛存在于各年齡段豬。該病全球范圍內(nèi)廣泛存在，是豬主要的傳染性呼吸道疾病，導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病的病理特征是纖維素性胸膜肺炎，肺血管內(nèi)血栓引起的肺纖維素性壞死性病灶。莢膜（CP）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（OMP）、毒素（Apx）、轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tbp）、蛋白酶、滲透因子、菌毛等是其主要毒力因子。根據(jù)培養(yǎng)過程中App對NAD的依賴性將其分為兩個生物型：NAD依賴性的生物Ⅰ型和NAD非依賴性的生物Ⅱ型[2]。生物Ⅱ型（App13，App14）雖然也可使豬致病，但毒力比生物Ⅰ型弱，因此目前國內(nèi)外研究主要針對生物Ⅰ型進(jìn)行。至今為止生物Ⅰ型已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)有14個血清型（1~12，15和K2:O7）[3-4]。各異型血清型之間很少產(chǎn)生交叉免疫反應(yīng)，目前還沒有一種疫苗可以對App所有血清型都產(chǎn)生保護(hù)力[5]。該病于80年代開始在我國流行，目前已廣泛存在。該病后期抗生素治療幾乎無效，且各地區(qū)的血清型也有差異，所以快速、準(zhǔn)確的進(jìn)行App的鑒定和分型顯得尤為重要。

目前，玻片凝集、乳膠凝集、免疫擴(kuò)散、間接血凝等血清學(xué)分型方法已被用于App的分型，但玻片凝集實(shí)驗(yàn)等快速血清學(xué)分型方法存在交叉反應(yīng)。比較可靠的血清學(xué)分型方法如免疫擴(kuò)散，間接血凝等又比較費(fèi)時。血清學(xué)分型中存在的交叉反應(yīng)最可能的原因是由于LPS上存在相同的抗原表位[6]，已報(bào)道，血清型1和9之間，血清型3、6和8之間，血清型4和7之間存在血清型的交叉反應(yīng)。PCR分型方法從基因的型特異性著手進(jìn)行App的分型，避免了血清學(xué)分型時的交叉反應(yīng)，且分型快速、準(zhǔn)確。本研究旨在建立一個App的PCR分型體系，可實(shí)際用于實(shí)驗(yàn)室診斷，以及進(jìn)行國內(nèi)流行株的調(diào)查。本實(shí)驗(yàn)中建立的PCR分型系統(tǒng)由1個單重PCR，3個分別根據(jù)omlA基因、apx基因和cps基因建立的多重PCR組成，分別命名為cpx-種屬特異性PCR、omlA-PCR、apx-PCR、cps-PCR。

1 材料和方法

1.1 菌株

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌參考菌株血清型1型（Shope）、2 型（S1536）、3 型（S1421）、4 型（M62）、5a 型（K17）、5b（L20）、6 型（FemΦ）、7 型（WF83）、8型（405）、9 型（CVJ13261）、10 型（D13039）購自中國獸醫(yī)藥監(jiān)察所；血清型 11型（56153）、12型（1096）由北京農(nóng)科院陳曉林研究員惠贈；分離株JS3、ZJ5和JS7系從江蘇、浙江等地病豬體內(nèi)分離并經(jīng)血清學(xué)鑒定為3、5和7型，以上菌株均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存。

1.2 主要試劑和儀器主要試劑和儀器

Taq酶（上海生工）；DL-2000 marker；胰蛋白胨、酵母抽提物（OXOID公司）；NAD（Roche 公 司 ）；Agarose（Promega）；TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice 和MiniCyclerTM（MJ Research）；PTC-100 PCR 儀；DYCP-31D型水平電泳槽；TGL-16G-A型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；THZ-C恒溫振蕩器（太倉實(shí)驗(yàn)儀器廠）；復(fù)日RF-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）。

1.3 PCR模板的準(zhǔn)備

1.3.1 組織病料的處理

取約1 g病料，剪碎后勻漿器加2 mL水研磨成糊狀，先低速4 000 r/min離心2 min，取上清，去除組織塊；然后把上清再高速10 000 r/min離心5 min，棄上清，用ddH2O或TE溶解沉淀，煮沸5 min，冰上放置，冷卻后10 000 r/min離心2 min，上清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 臨床分離株的處理

37℃在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落溶于50μL無菌蒸餾水中，煮沸5 min，冰上放置，冷卻后10 000 r/min離心2 min，上清-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR分型體系的建立

1.4.1 cpx-種屬特異性PCR快速鑒定App[7]

合成引物 cpxAF 5'-TAGAACCTTGTAAGCTC GTCCATA-3'，cpxAR5'-CGTTTGTTAAGTGGTGTT GAGC-3'。PCR 反應(yīng)體系：模板 5 μL，10×buffer 5 μL，cpxAF、cpxAR 各 05 uM，100uM dNTP，Tap酶 0.5 U，1.5 uM MgCl2。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s，30個循環(huán)后 72℃ 10 min。

電泳 1%瓊脂糖凝膠，含溴化乙錠0.25 μg/mL，緩沖液為0.5×TBE，每孔加樣1μL以120V恒壓電泳30 min后紫外燈下觀察結(jié)果。

1.4.2 omlA-PCR分型體系

根據(jù)GenBank上已登陸的App不同血清型omlA基因中間部分的差異合成5條引物（表1），其中LPF為公用上游引物，下游引物為LP1R、LP2R[8]、LP3R、LP4R。

反應(yīng)體系（50μL）模板cpx-種屬特異性PCR檢測 App陽性的模板 1μL，10×buffer 5μL，LPF各1uM，LP1F、LP2F、LP3F、LP4F 各 0.5 uM，100 uM dNTP，Tap酶 0.5U，1.5 uM MgCl2。反應(yīng)條件 94℃ 4 min；94℃ 1 min，54 ℃ 30 s，72℃ 1 min，共 30 個循環(huán)；72℃ 10 min。

表 1 omlA-PCR擴(kuò)增omlA基因的引物的位置和序列

電泳 1.5%瓊脂糖凝膠，含溴化乙錠0.25μg/mL，緩沖液為0.5×TBE，每孔加樣5μL以120V恒壓電泳60 min后紫外燈下觀察結(jié)果。

1.4.3 apx-PCR分型體系

Apx是App最重要的毒力因子，不同血清型的菌株可產(chǎn)生4種Apx即ApxⅠ~Ⅳ，所有血清型菌株都具有apxⅣ基因，但不同血清型菌珠具有不同的apxⅠ、apxⅡ、apxⅢ基因組合。血清型型 1、5a、5b、9、11 具有 apxⅠ和 apxⅡ基因；血清型 2、3、4、6、8 具有apxⅡ和apxⅢ基因，3型因?yàn)槿狈pxⅠBD基因可以從血清型2、4、6、8中區(qū)分出來；血清型7和12僅有apxⅡ基因；血清型10僅有apxⅠ基因[9-10]。根據(jù)App毒素基因的特點(diǎn)，以apxⅠA基因?yàn)槟０?，引物AIF，AIR在分型體系中預(yù)期僅擴(kuò)增一條約1 035 bp的條帶，引物AIIF、AIIR則以apxⅡA基因?yàn)槟０孱A(yù)期僅擴(kuò)增一條約482 bp的條帶，以apxⅢA基因?yàn)槟０澹?AIIIF、AIIIR（由 Gram 等[8]設(shè)計(jì)）僅擴(kuò)增一條約635 bp的條帶，引物BDIF、BDIR根據(jù)分泌基因apxⅠBD設(shè)計(jì)[11]，僅擴(kuò)增一條約1447 bp的條帶（表 2）。

反應(yīng)體系（50μL） 模板 1μL，10×buffer 5μL，BDIF、BDIR 各 0.75uM；AIF、AIR、AIIF、AIIR、AIIIF、AIIIR 各 0.5uM，200uM dNTP，Tap 酶 1U，1.5uM MgCl2。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共 35 個循環(huán)；72℃ 10 min。

電泳 1.5%瓊脂糖凝膠，含溴化乙錠0.25 μg/mL，緩沖液為0.5×TBE，每孔加樣15μL以120V恒壓電泳45 min后紫外燈下觀察結(jié)果。

1.4.4 cps-PCR分型體系

根據(jù)GenBank上已登錄的序列，自行設(shè)計(jì)引物cps1F、cps1R、cps8F、cps8R，引物 cps2R、cps6F、cps6R均由Stine等[12]設(shè)計(jì)（表3）。引物cps1F、cps1R以1型為模板僅擴(kuò)增一條約1 071 bp的條帶，引物cps8F、cps2R以2型為模板擴(kuò)增一條約1 218 bp的條帶，引物cps6F、cps6R以6型為模板擴(kuò)增一條約718 bp的條帶，引物cps8F、cps8R則同時以6型和8型為模板分別擴(kuò)增出約414 bp和423 bp大小的條帶。

表 2 apx-PCR擴(kuò)增毒素基因的引物的位置和序列

表 3 cps-PCR中擴(kuò)增cps基因的引物

反應(yīng)體系（50μL） 模板 1μL，10×buffer 5μL，cps1F、cps1R、cps2R、cps6F、cps6R、cps8F、cps8R 各0.5uM，100uM dNTP，Tap 酶 0.5U，1.5uM MgCl2。反應(yīng)條件 94℃ 4 min；94℃ 1 min，60℃30 s，72℃ 1.5 min，共33個循環(huán)；72℃10 min。電泳：1%瓊脂糖凝膠，含溴化乙錠0.25μg/mL，緩沖液為0.5×TBE，每孔加樣15μL以120V恒壓電泳45 min后紫外燈下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 參考菌株在PCR分型系統(tǒng)中的結(jié)果分析

cpx-種屬特異性PCR中，App1~12型均擴(kuò)增出與預(yù)期大小一致的約489 bp的條帶；對馬鏈球菌獸疫亞種、多殺性巴氏桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、副豬嗜血桿菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、豬肺炎支原體（168株）等均未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖1）。

電泳分析omlA-PCR分型體系PCR產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果一致，4對引物將App1~12型分成 5 組，血清型 1、9、11、12為一組（omlAI）；血清型 2、8為一組（omlAII）；血清型 3、6、7 為一組（omlAIII），血清型4的擴(kuò)增片段比血清型3、6、7的擴(kuò)增片段約大37bp，可將其單獨(dú)歸為一組（omlAIV）；血 清 型 5a、5b、10 為 一 組（omlAV）（圖 2）。

根據(jù)Frey等[11]的方法，apx-PCR分型體系將12個血清型的App分成5組，5組分別為：血清型 1、5a、5b、9、11為一組；血清型 2、4、6、8 為一組；血清型3單獨(dú)為一組；血清型7、12為一組；血清型10單獨(dú)為一組（圖3）。

cps-PCR分型體系中，2和8型模板公用上游引物cps8F，血清型1、2、6和8均擴(kuò)增出于預(yù)期結(jié)果大小一致的條帶，因6型有兩對引物cps6F、cps6R和cps8F、cps8R，所以6型模板擴(kuò)增出414 bp和718 bp的 2 特異性條帶。血清型 3、4、5a、5b、7、9、10、11、12在該體系中均無擴(kuò)增條帶（圖4）。

該分型體系由1個單重PCR，3個多重PCR組成，可以區(qū)分App生物Ⅰ型1~12個血清型中除血清型9和11外的10個血清型。隨后的實(shí)驗(yàn)中將分型系統(tǒng)直接用于臨床標(biāo)本的檢測，避免樣品送檢過程中細(xì)菌死亡或者其他人為因素未分離出App而不能進(jìn)一步鑒定和分型的缺陷。

2.2 樣品檢測

樣品經(jīng)cpx-PCR檢測后，陽性者再繼續(xù)分型，對臨床發(fā)病病料可以按1.3.1方法提取模板分型12 h內(nèi)可知道分型結(jié)果，健康豬樣品37℃增菌培養(yǎng)18 h后再分型。

該分型系統(tǒng)對分離株JS3、ZJ5和JS7的分型結(jié)果均與已知血清學(xué)分型結(jié)果一致。對實(shí)驗(yàn)室保存App1、3、5、7型人工發(fā)病豬肺臟12份、扁桃體12份，鼻拭子12份（每種血清型樣本各3份）增菌后可以分型，并且也可以直接分型，分型結(jié)果與已知血清型一致。對以上豬肺臟和扁桃體-20℃保存一年的樣品增菌后或者直接提取摸板均可分型。

在35份本實(shí)驗(yàn)室收集的臨床可疑病料中檢出2份陽性，分型結(jié)果均為7型。本實(shí)驗(yàn)對350頭健康豬的肺臟和扁桃體進(jìn)行了檢測，在浙江嘉興健康豬扁桃體中增菌后檢測到3份陽性，分別為血清型12型、4型、3型。在廣東從化與河源健康豬扁桃體中增菌后各檢測到一份陽性，均為7型，350份肺臟中均未檢測出陽性。

3 討論

根據(jù)omlA基因和apx基因的App分型，已有報(bào)道[8]，但Gram等不能區(qū)分血清型1、9、11；血清型2和 8。2003年，Nattawooti Sthitmatee[13]等在 Gram 等報(bào)道的apx-PCR分型子體系的基礎(chǔ)上結(jié)合apxIVA-PCR可將血清型1從血清型9和11中區(qū)分出來，但不能區(qū)分血清型9和11以及血清型2和8，且apxIVA-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較大。更早時間，Hennessy等[14]報(bào)道了用隨機(jī)引物對App PCR分型的方法，可以區(qū)分App1~12型，但實(shí)驗(yàn)需要純化好的細(xì)菌，且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差。Hernane等[15]根據(jù)aroA基因，建立了PCR-RFLP的分型方法，將App1~12分成3群，Victor等[16]根據(jù)tbpA和tbpB基因同樣建立了PCR-RELP的分型方法，但不能區(qū)分血清型4和11、血清型7和9，兩者都過于復(fù)雜。

最近，Jaglic等[17]2004年報(bào)道了根據(jù)apxIVA基因序列的差異，建立了PCR-REA的分型方法，但不能區(qū)分血清型8和10，血清型9和11。2003年，Stine等[11]報(bào)道了根據(jù)cps的差異在同一體系中一次性鑒定血清型 2，5，6 的 PCR 方法。1 年后，Jennifer等[7]報(bào)道了根據(jù)cps基因區(qū)分血清型1、2、8的PCR方法，但不是在一個PCR體系內(nèi)一次性區(qū)分血清型1、2、8。

本實(shí)驗(yàn)在omlA基因和apx基因PCR分型系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合cps基因的型特異性PCR將App1~12型中除血清型9和11外的其他10個血清型完全區(qū)分。Gram等的omlA-PCR體系中血清型3、6、7的PCR擴(kuò)增條帶約為577 bp，4型約為614 bp，兩者相對偏差較小，瓊脂糖電泳不易將4型從3、6、7型中區(qū)分出來。本實(shí)驗(yàn)omlA-PCR體系中將血清型3、6、7擴(kuò)增出的條帶縮小到約為314 bp，4型約為351 bp，加大了兩者相對偏差，電泳后明顯可以將4型從 3、6、7型中區(qū)分出來。另外，本實(shí)驗(yàn)中的apx-PCR體系中省去了Gram等的apx-PCR體系中的針對apxBDⅢ基因設(shè)計(jì)的一對引物，但并不影響分組結(jié)果。本分型系統(tǒng)中cps-PCR結(jié)合cpx-種屬特異性PCR可以單獨(dú)成一體系用于鑒定血清型1、2、6和8。同時，該分型系統(tǒng)與傳統(tǒng)的血清學(xué)方法相結(jié)合，可以更好的對App進(jìn)行分型。

目前國內(nèi)診斷本病的方法大多是采用細(xì)菌分離鑒定和血清學(xué)診斷。App對外界抵抗力較弱，在送檢過程中極易死亡，再加上病料污染，抗生素濫用等因素細(xì)菌很難分離，并且細(xì)菌分離鑒定費(fèi)時費(fèi)力，過程煩瑣。而傳統(tǒng)的血清學(xué)分型方法很難完全區(qū)分App生物Ⅰ型的12個血清型。由于交叉反應(yīng)的存在，血清學(xué)方法較難從血清型9和11中區(qū)分血清型1，血清型6和8區(qū)分同樣不易。而本研究成功解決了這一問題。另外，亞臨床感染或帶菌狀態(tài)下的假陰性以及目前國內(nèi)App疫苗大都是滅活苗，血清學(xué)方法難以對免疫豬和感染豬作出鑒別診斷等都使血清學(xué)分型方法受到局限。本實(shí)驗(yàn)建立了快速，準(zhǔn)確的App分型系統(tǒng)，可以及時鑒定App暴發(fā)地區(qū)的主要流行的血清型，為盡早控制疾病提供幫助。

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