雌激素制備大鼠子宮肌瘤動物模型

陳海剛，朱 蘭，崔全才，郞景和，李 玢

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院 1婦產科 2病理科，北京100730

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)中最常見的一種良性腫瘤，多見于育齡女性，40～50歲婦女的發(fā)病率高達51%～60%，且呈逐年上升趨勢，53%的婦女子宮切除的指征是子宮肌瘤［1］。但目前該病的病因和發(fā)病機制尚未清楚。子宮肌瘤動物模型的建立也處于研究階段。本研究基于肌瘤對雌激素 (estrogen，E2)的高度敏感性以及E2在其發(fā)病機制中的重要地位［2-6］，利用處于繁殖期的雌性大鼠，外源性給予E2，探討不同劑量及給藥周期對大鼠子宮肌瘤形成的影響，并與人子宮肌瘤進行病理組織學比較，探討動物模型的最佳建立方法。

材料和方法

實驗動物普通級 Sprague-Dawley大鼠60只(北京協(xié)和醫(yī)院動物中心)，雌性，未經(jīng)生育交配，體重 (200±20)g。飼養(yǎng)條件:室溫 (23±2)℃，相對濕度50%～70%，光照12 h，黑暗12 h，每籠5只。以清潔級維持鼠料和凈化水飼養(yǎng)，自由飲水、自由攝食。所有動物抵達實驗室后，馴化至少1周后用于實驗。

E2誘導大鼠子宮肌瘤模型建立參照Fujii等［7］的方法建立E2誘導的大鼠子宮肌瘤模型。將60只大鼠隨機分為3組，分別為200 μg模型組 (n=20)，每只大鼠肌肉注射E2200 μg，每周2次;300 μg模型組(n=20)，每只肌肉注射E2300 μg，每周2次;正常對照組 (n=20)，肌肉注射生理鹽水0.1 ml，每周2次。于實驗8周和10周時分別處死動物每組各10只，將子宮完整剪下，觀察子宮和肌瘤形態(tài)，計算肌瘤形成率和子宮臟器系數(shù) (子宮重量/體重×100%)，并將子宮固定于10%甲醛固定液中。

血清雌、孕激素水平分別于實驗8周和10周于眶動脈取血1 ml，3000 r/min(r=10 cm)離心10 min分離血清，測定血清E2和孕激素 (progesterone，P)含量。

子宮病理組織學觀察子宮組織經(jīng)10%甲醛固定液固定48 h后以石蠟包埋，4 μm切片，HE染色。顯微鏡下觀察染色切片，并與人子宮肌瘤病理切片進行比較。

子宮雌、孕激素受體表達免疫組織化學法測定子宮雌激素受體 (estrogen receptor，ER)及孕激素受體 (progesterone receptor，PR)的表達?？笶R多克隆抗體及抗PR多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，按試劑盒說明染色，組織切片中出現(xiàn)棕黃色顆粒著色即為ER和PR表達陽性。

統(tǒng)計學處理采用SPSS統(tǒng)計軟件，結果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用F檢驗，定性資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

不同給藥劑量和周期對大鼠子宮肌瘤形成的影響對照組大鼠子宮質地均勻，未見結節(jié)或囊腫。兩模型組大鼠于8周和10周時可見子宮形態(tài)改變、肌層增生，個別大鼠分角子宮可見肌壁間肌瘤、漿膜下肌瘤。200 μg組平均肌瘤形成率為30%，300 μg組平均肌瘤形成率為20%，均較對照組顯著增加 (P＜0.05)。不同劑量模型組8周及10周平均肌瘤形成率為25%。兩模型組動物死亡率均為15%，高于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義。不同劑量模型組10周的平均動物死亡率為30%，顯著高于對照組 (P＜0.05)，而3組的8周動物死亡率皆為0。

E2對大鼠子宮重量和臟器系數(shù)的影響200 μg組大鼠的子宮重量和臟器系數(shù)與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義。與對照組相比，300 μg組大鼠8周的子宮重量和臟器系數(shù)差異無統(tǒng)計學意義，但10周的子宮重量和臟器系數(shù)顯著增加 (P＜0.01)(表1)。

表1 雌激素對大鼠子宮重量和臟器系數(shù)的影響 (n=20，±s)Table 1 The changes in uterine weight and organ coefficient after estrogen injection(n=20，±s)

表1 雌激素對大鼠子宮重量和臟器系數(shù)的影響 (n=20，±s)Table 1 The changes in uterine weight and organ coefficient after estrogen injection(n=20，±s)

與對照組比較，aP＜0.01aP＜0.01 compared with control group

Group n 周期Duration(w)分組體重Weight(g)子宮重量Uterine weight(g)臟器系數(shù)Organ coefficient(%)對照組Control group 10 8 277.3±17.0 0.83±0.25 0.30±0.10 10 10 293.8±23.4 0.77±0.23 0.26±0.09 200 μg組 200 μg group 10 8 263.7±24.5 1.03±0.42 0.41±0.22 7 10 262.7±11.6 3.15±4.58 1.16±1.63 300 μg組 300 μg group 10 8 251.3±14.5 3.79±5.84 1.53±2.43 7 10 256.7±22.2 1.54±0.67a 0.59±0.21a

E2注射對大鼠血清E2、P水平的影響與對照組相比，兩模型組的血清E2水平均顯著升高 (P＜0.01)。200 μg組的血清P水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義 (P＞0.05)，而300 μg組的血清P水平顯著低于對照組 (P＜0.05)(表2)。

大鼠與人子宮肌瘤病理組織學特征對照組大鼠子宮肌壁厚度均勻，色澤淡紅，未見結節(jié)或囊腫形成;模型組大鼠于8周和10周解剖時見明顯增生，甚至出現(xiàn)腫塊 (圖1)。鏡下觀察似人的肌瘤表現(xiàn) (圖2)。

E2對大鼠子宮ER、PR表達的影響ER、PR

蛋白在子宮內膜組織、內膜下組織和肌層組織的胞漿內均可表達。免疫組化結果顯示，所有標本均不同程度地表達ER、PR，陽性細胞表達部位均以細胞核著色為主。對照組子宮組織中，部分細胞胞漿內可見淺黃色ER、PR蛋白顆粒著色;兩模型組子宮組織中大量細胞胞漿內均可見黃褐色的ER、PR蛋白顆粒著色，陽性細胞數(shù)明顯多于對照組，且肌瘤組織中的陽性細胞數(shù)明顯多于鄰近正常平滑肌組織 (圖3)。

討 論

子宮肌瘤的發(fā)病原因復雜，目前普遍認為子宮肌瘤為性激素依賴性腫瘤，長期高水平卵巢激素的刺激是導致子宮肌瘤發(fā)生的重要致病因素［8］。本研究通過對雌性大鼠給予不同劑量和時間的E2，探討通過E2給藥建立子宮肌瘤動物模型的可行性。

本研究結果顯示，模型組大部分大鼠的子宮均出現(xiàn)了較明顯的平滑肌瘤樣改變，并且在病理組織學上與人子宮肌瘤相似，而對照組大鼠的子宮在肉眼與鏡下觀察均無明顯變化，提示模型建立成功。

本研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予E2后，血清E2水平升高，子宮重量和臟器系數(shù)增加，部分大鼠形成子宮肌瘤，ER表達明顯增強。此結果表明，子宮肌瘤具有明顯的E2依賴性，E2可能是誘導子宮肌瘤形成的直接因素。

研究中分組給予大鼠 E2200 μg/只和 300 μg/只，200 μg組平均肌瘤形成率為30%，300 μg組平均肌瘤形成率為20%，差異無統(tǒng)計學意義。根據(jù)給藥周期分析可見，給藥8周和10周的肌瘤形成率均為25%，差異無統(tǒng)計學意義。此結果提示延長E2的作用時間或許并不能顯著提高肌瘤形成率。在200～300 μg/只的給藥劑量下，給藥8周即可達到較好的肌瘤形成率。

在給藥劑量為 200 μg/只和 300 μg/只時，10 周動物死亡率無差異，但高劑量組大鼠的死亡時間均早于低劑量組，提示E2誘導劑量可能與動物死亡率有關。這也可能是導致300 μg模型組肌瘤形成率低于200 μg模型組的原因。同時，10周時的動物死亡率顯著高于8周，表明動物死亡率與E2給藥周期可能存在正相關。綜合評價，給藥劑量為200 μg/只時可獲得較好的存活率和肌瘤形成率。

由于肌瘤形成之前可能出現(xiàn)肌細胞肥大增生、膠原纖維增生活躍、子宮微小肌瘤等［9］，僅通過病理組織學觀察子宮肌瘤形成情況尚不能完全反映E2對子宮平滑肌細胞增生的促進作用，用子宮重量和臟器系數(shù)能夠更加準確地評價E2的作用。數(shù)據(jù)分析可見，隨著給藥劑量增加、時間延長，大鼠子宮平滑肌細胞及纖維組織增生程度增加，子宮重量和臟器系數(shù)的增加均存在E2依賴性。

在E2連續(xù)給藥后，大鼠體內E2水平持續(xù)升高，并且與給藥時間和給藥劑量都存在相關性。與之相反，P水平則呈下降趨勢，考慮可能與體內性腺軸的反饋抑制有關。

E2是子宮肌瘤發(fā)生發(fā)展的主要因素，而目前關于P對子宮肌瘤的作用尚存在爭議。部分觀點認為，P能抑制子宮肌瘤生長，但近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)P在肌瘤的發(fā)病中也起著重要作用［10］。大量臨床實踐證實，P能夠抑制GnRH-a產生的E2不足和子宮肌瘤縮小的作用。應用P拮抗劑米非司酮可使肌瘤體積明顯縮?。?1］，進一步說明了P在子宮肌瘤發(fā)病中具有重要作用。

表2 大鼠血清雌、孕激素水平 (n=20，±s)Table 2 The serum estrogen(E2)and progesterone(P)levels in the rats(n=20，±s)

表2 大鼠血清雌、孕激素水平 (n=20，±s)Table 2 The serum estrogen(E2)and progesterone(P)levels in the rats(n=20，±s)

與對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01aP ＜0.05，bP ＜0.01 compared with control group

Group n 周期Duration(w)分組E2P(pg/ml)(ng/ml)對照組Control group 10 8 110.94± 60.66 24.17±15.29 10 10 107.35± 48.11 19.56± 8.23 200 μg組 200 μg group 10 8 1068.87 ±201.98b 16.08 ±17.40 7 10 1204.33±159.06b 14.08± 6.53 300 μg組 300 μg group 10 8 1320.36 ±557.91b 10.07 ± 4.78a 7 10 1630.34±440.91b 11.25± 5.03a

本研究結果顯示，給予外源性E2后，模型組動物在血清E2水平明顯升高的同時，P水平降低;子宮增生、變形，并伴有肌瘤形成，模型組大鼠子宮組織中ER和PR的表達均明顯強于對照組。說明外源性E2可抑制血清P水平，但可增強子宮PR的表達，與文獻報道結果一致［12］。曾有研究報道［7］，在模型開始建立時同時使用高劑量P和E2處理動物可抑制肌瘤形成。本研究結果進一步表明，血清中P的含量并非導致子宮肌瘤產生的必要因素，而局部組織中高濃度的ER、PR表達與子宮肌瘤的發(fā)生密切相關。

綜上，使用性成熟的雌性大鼠，給予E2200 μg/只，2次/周，連續(xù)8周后可成功建立子宮肌瘤動物模型，其病理組織學特征與人子宮肌瘤相似，可用于子宮肌瘤發(fā)病機制研究和治療藥物篩選。

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圖1 大鼠子宮病理組織學變化Fig 1 The pathohistological changes of the uteri of the rats

圖2 大鼠與人子宮病理組織學比較 (HE)Fig 2 The histological comparison between human and rat uteri(HE)

圖3 免疫組織化學染色測定子宮ER和PR表達 (×20)Fig 3 Investigations of the ER and PR in rats'uteri by immunohistochemical staining(×20)