檢測非霍奇金淋巴瘤患者外周血CD14+單核細胞組織因子和血管內(nèi)皮生長因子的臨床意義

王紅霞，李秀梅，韓秀華，江亞軍，朱貴華，莊萬傳

1徐州醫(yī)學院附屬連云港醫(yī)院 (連云港市第一人民醫(yī)院)病理科，江蘇連云港222002

2蚌埠醫(yī)學院附屬連云港醫(yī)院 (連云港市第二人民醫(yī)院)血液科，江蘇連云港222002

細胞炎癥因子表達失調(diào)可能導致外周單核細胞激活及某些細胞表型改變，并參與惡性淋巴瘤的侵襲生長、浸潤轉(zhuǎn)移和血管新生等過程［1，2］。本研究采用流式細胞術(shù)檢測非霍奇金淋巴瘤 (non-Hodgkin lymphoma，NHL)患者外周血CD14+單核細胞表面組織因子 (tissue factor，TF)和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達并分析兩者與國際預后指數(shù) (International Prognostic Index，IPI)及短期療效間的潛在關(guān)系，旨在研究兩者在NHL患者病情評估、預后評價以及短期療效觀察中的臨床意義。

對象和方法

對象選擇2004年10月至2010年3月在連云港市第二人民醫(yī)院病理確診的NHL患者47例作為病例組，男28例，女19例，年齡7～80歲，中位年齡46歲，平均 (46.3±17.3)歲;≤60歲34例，＞60歲13例。B細胞性NHL 41例、T細胞性NHL 6例。

按照 Ann Arbor分期法［3］，患者分為Ⅱ期 (6例)、Ⅲ期 (22例)和Ⅳ期組 (19例)。無全身癥狀的25例，有全身癥狀的22例。乳酸脫氫酶 (lactate dehydrogenase，LDH;正常參考值:110～246 U/L)正常者26例，升高者21例。依據(jù)美國東部腫瘤協(xié)作組 (Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體力狀態(tài)分級標準［4］，患者可分為體力狀態(tài)≤1級(35例)和≥2級組 (12例)。結(jié)外病灶數(shù)=1者31例、＞1者16例。

健康體檢者30例作為對照組，男19例，女11例，年齡11～77歲，中位年齡49歲，平均 (45.0±17.8)歲。

對照組和病例組在性別、年齡構(gòu)成方面的差異無統(tǒng)計學意義 (P均＞0.05)，影響單核細胞功能的其他因素如自身免疫性疾病、伴發(fā)腫瘤、急慢性感染性疾病、血栓性疾病等均被排除。

化療方案與療效評價所有患者均常規(guī)化療4周期，具體方案包括環(huán)磷酰胺+長春新堿+潑尼松(COP方案)21例次、環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+潑尼松 (CHOP方案)106例次、環(huán)磷酰胺+米托蒽醌+長春新堿+潑尼松 (CMOP方案)16例次、CHOP+利妥昔單抗 (RCHOP方案)12例次、CHOP+依托泊苷 (CHOPE方案)23例次、環(huán)磷酰胺+多柔比星+長春新堿+地塞米松/甲氨蝶呤+阿糖胞苷 (Hyper-CVAD/MA方案)4例次、氟達拉濱+阿糖胞苷+粒細胞集落刺激因子 (FLAG方案)2例次。

參照文獻 ［5］判斷臨床療效。完全緩解:臨床及影像學上可檢測到的病灶消失，癥狀消失且持續(xù)超過1個月;部分緩解:病灶最大直徑及其最大垂直直徑的乘積縮小≥50%，無新病灶且持續(xù)超過1個月;疾病穩(wěn)定:病灶最大直徑及其最大垂直直徑的乘積縮小＜50%或增大≤25%持續(xù)超過1個月;疾病進展:病灶最大直徑及其最大垂直直徑的乘積增大＞25%或出現(xiàn)新病灶。4周期化療結(jié)束后47例患者中，完全緩解20例、部分緩解16例、疾病穩(wěn)定6例、疾病進展5例，其中完全緩解和部分緩解病例組成緩解組 (36例)，疾病穩(wěn)定和疾病進展病例組成未緩解組 (11例)。

IPIIPI評分依據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡 (National Comprehensive Cancer Network，NCCN)評分標準［6］。根據(jù)年齡 (＞60歲)、Ann Arbor分期 (Ⅲ/Ⅳ期)、LDH異常、體力狀態(tài) (2～4級)和結(jié)外病變數(shù)＞1等5個預后危險因素將患者分為低危組(15例)，低中危組 (14例)，高中危組 (11例)和高危組 (7例)。

LDH測定清晨空腹采取靜脈血2 ml置于無抗凝物的真空采血管中，1200 g離心10 min后分離血清。采用速率法檢測血清LDH水平，儀器為美國強生公司VITROS950全自動干化學分析儀，試劑盒為LDH(L→P法)測定試劑盒 (購自上海榮盛生物技術(shù)有限公司)。

TF和VEGF測定分別于化療前及化療4周期后抽取肘靜脈血2 ml，置于3.8%枸櫞酸鈉抗凝的真空采血管中，分別取20 μl全血至2個檢測管中，其中對照管加入CD14-PerCP(購自美國R＆D公司)、IgG1-FITC(購自美國BD公司)和IgG2a-PE(購自美國BD公司)各20 μl，測量管加入 CD14-PerCP、TF-FITC(購自AbD Serotec公司)和VEGF-PE(購自美國R＆D公司)各20 μl。輕輕混勻后室溫避光反應20 min后加入2 ml溶血素，振蕩混勻后，避光反應10 min后加入2 ml PBS緩沖液洗滌，重復洗滌1次后加入200 μl PBS緩沖液懸浮細胞，于2 h內(nèi)用FACSCalibur型流式細胞儀 (購自美國BD公司)進行檢測，波長為488 nm，光源為功率15 mW的氬離子激光器。用CellQuest軟件進行TF和VEGF表達百分率分析，每個樣本檢測1×104個細胞。

統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩定量指標間相關(guān)性分析采用Pearson定量資料相關(guān)分析法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

NHL患者外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達病例組外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達顯著高于對照組 (P均＜0.01)，TF和VEGF的表達呈正相關(guān) (r=0.708，P=0.00)?！?0歲與＞60歲患者外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達的差異無統(tǒng)計學意義 (P均＞0.05)。具有預后危險因素患者外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達顯著高于不具有預后危險因素者 (P均＜0.05)，Ann Arbor分期Ⅲ期和Ⅳ期患者比較兩者表達的差異無統(tǒng)計學意義 (P均＞0.05，表1)。

不同危險分層NHL患者外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達情況高中危組和高危組外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達顯著高于較低危組和低中危組 (P均＜0.01)，高中危組和高危組比較兩者表達的差異無統(tǒng)計學意義 (P均＞0.05，表2)。

不同療效NHL患者外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達情況化療前未緩解組外周血CD14+單核細胞TF(45.66% ±9.17%比30.90% ±8.58%，P＜0.01)和VEGF表達(48.28% ±6.13%比36.30% ±7.12%，P＜0.01)顯著高于緩解組。化療后緩解組TF(22.48%±6.92%)和VEGF的表達 (24.30%±11.66%)較化療前顯著降低 (P均＜0.01)，但未緩解組TF(46.21%±8.99%)和VEGF的表達(51.25%±6.70%)與化療前的差異無統(tǒng)計學意義 (P均＞0.05)。

討 論

TF廣泛分布于各種組織細胞如單核細胞和腫瘤細胞等表面，在病理狀態(tài)下由各種炎癥介質(zhì)誘導表達。TF通過MAPK等信號通路參與腫瘤生長、血管新生［7］、浸潤轉(zhuǎn)移等過程［8-11］。

本研究結(jié)果顯示:NHL患者外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達明顯上調(diào)，且TF和VEGF呈正相關(guān)關(guān)系，提示TF和VEGF可能協(xié)同參與NHL的發(fā)生發(fā)展過程?；A(chǔ)研究表明高表達TF的轉(zhuǎn)染瘤細胞建立的實驗性腫瘤組織血管豐富且伴VEGF轉(zhuǎn)錄增強，敲除TF胞內(nèi)區(qū)后這一作用明顯削弱［12，13］，因此推測TF能上調(diào)NHL單核細胞表達VEGF，進而促使NHL形成新生血管，但是兩者具體的作用機制有待進一步研究闡述。

表1 對照組、病例組以及各病例亞組外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達水平 (x ± s，%)Table 1 Levels of TF and VEGF expressions on peripheral CD14+monocytes in control group，disease group and its subgroups(x ± s，%)

表2 不同危險分層NHL患者外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達水平 (x ± s，%)Table 2 Values of TF and VEGF expressions on peripheral CD14+monocytes in different risk stratification of NHL patients(x ± s，%)

本研究顯示:NHL晚期播散患者單核細胞TF和VEGF表達明顯高于早期局灶患者，提示單核細胞高表達TF和VEGF參與了NHL的浸潤轉(zhuǎn)移等過程。Nadir等［8］研究證實:高表達TF的腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力顯著增強，阻斷TF受體功能后腫瘤細胞轉(zhuǎn)移能力明顯降低。Versteeg等［14］分別給嚴重聯(lián)合免疫缺陷病小鼠注射高表達TF和低表達TF的黑色素瘤細胞，高表達TF小鼠大多數(shù)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶，而低表達TF小鼠很少出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶。臨床研究亦證實:TF表達水平與腫瘤分期分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等特性顯著相關(guān)［15，16］。

有全身癥狀、LDH升高及ECOG評分2～4級的NHL患者CD14+單核細胞TF和VEGF表達量顯著高于無全身癥狀、LDH正常及ECOG評分0～1級者，提示NHL患者發(fā)熱等全身癥狀以及體力下降可能與TF和VEGF的高表達有關(guān)。LDH增高NHL患者CD14+單核細胞TF和VEGF表達量顯著高于LDH正常者，可能由于淋巴瘤細胞迅速生長過程中局部缺氧和營養(yǎng)消耗而引起腫瘤組織細胞壞死，釋放LDH的同時伴有其他炎癥細胞因子釋放，后者進而激活單核細胞上調(diào)TF等的表達。

單因素和多因素回歸分析證實患者年齡、LDH水平、體力狀態(tài)、Ann Arbor分期和結(jié)外病灶數(shù)是影響NHL預后的重要因素［17］。本研究結(jié)果顯示:高中危組和高危組外周血CD14+單核細胞TF和VEGF表達水平明顯高于低危組和低中危組，提示CD14+單核細胞表達TF和VEGF與患者危險分期密切相關(guān)，可能是NHL患者的一個預后不良指標。Nitori等［15］研究表明:TF(－)的胰腺癌患者即使發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其預后仍較TF表達陽性的患者好，但是CD14+單核細胞TF和VEGF表達與NHL患者預后間的關(guān)系需要進一步研究證實。

全身化療仍然是治療淋巴瘤的重要手段，但是臨床上即使是病理類型和臨床分期相同的患者，采用相同的化療方案，療效也明顯不相同。影響化療效果的因素包括:血管生成能力和腫瘤細胞增殖活性等［18，19］。臨床緩解病例化療前 CD14+單核細胞TF和VEGF表達水平明顯低于未緩解者，其可能與TF和VEGF促進微血栓形成、促進血管新生、增強侵襲力及抑制細胞凋亡等有關(guān)，但尚缺少充分的證據(jù)支持?；熀缶徑獠±鼵D14+單核細胞TF和VEGF表達水平較化療前明顯降低，但未緩解病例化療前后兩者比較未見明顯變化。上述結(jié)果提示:CD14+單核細胞表達TF和VEGF的水平高低可能是影響短期療效的兩個因素，即高表達TF和VEGF的患者對化療的敏感性差。

綜上所述，CD14+單核細胞可能通過高表達TF和VEGF共同參與NHL的侵襲浸潤和血管新生等過程。外周血CD14+單核細胞TF和VEGF高表達可作為NHL病情評估、預后評價以及短期療效觀察的指標之一。

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