p16基因在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中甲基化的研究

范昭 葉靜 龍霞 張信

腫瘤表觀遺傳學(xué)是一門新興科學(xué)，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑、基因組印跡和非編碼RNA調(diào)控等幾個(gè)方面。其中，DNA甲基化與腫瘤的關(guān)系是研究的熱點(diǎn)。近年來，日益增多的研究表明腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移與DNA甲基化密切相關(guān)。p16基因作為抑癌基因，其第1外顯子5'啟動子區(qū)域CpG島的甲基化在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1］。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)法(methylation-specific PCR，MSP)，檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織及乳腺非癌組織中p16基因的甲基化狀態(tài)，以探討p16基因甲基化在乳腺癌發(fā)生中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集我院甲狀腺乳腺外科2007年3～10個(gè)月，手術(shù)切除的新鮮乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織共42例，作為癌癥組;對照組為21例乳腺良性病變旁正常乳腺組織，包括纖維腺瘤19例和乳管內(nèi)乳頭狀瘤2例，此外，對照組還包括癌旁正常乳腺組織3例。所有病例均為女性，年齡19～70歲，平均35.6歲，術(shù)前均未接受過放化療，并經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)，－80℃速凍保存。

1.2 方法

1.2.1 組織DNA提取 按照QIAamp DNA Mini Kits 51304試劑盒(Qiagen公司)說明書進(jìn)行操作，紫外分光光度儀檢測其含量和純度。

1.2.2 甲基化修飾 所有標(biāo)本DNA均取1.0μg進(jìn)行甲基化修飾，操作流程參照CpGenome TM DNA Modification Kit S7820(Chemicon公司)甲基化試劑盒說明書，修飾后的DNA分裝儲存。

1.2.3 MSP擴(kuò)增 PCR反應(yīng)試劑盒為2×PCR Master mix K0171(Fermentas公司):2×PCR Master mix 12.5 μl，上下游引物各 1 μl(10 pmol/μl)，甲基化后的DNA2 μl，用水補(bǔ)至 25 μl。p16 基因擴(kuò)增采用巢式PCR，第一輪PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán) 35 個(gè)周期后，最后 72℃ 延伸 8 min。巢式 PCR引物，F(xiàn):5'-GAAGAAAGAGGAGGGTTGG-3'，R:5'-CTACAAAC CCTCTACCCACC-3'。取 PCR 產(chǎn)物 0.3 μl做第二輪PCR，p16(甲基化與非甲基化)擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30個(gè)周期，最后72℃延伸8 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。p16甲基化引物，MF:5'-TTATTAGAGG GTGGGGCGGATCGC-3'，MR:5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'，片段大小為 150 bp;非甲基化引物，UF:5'-TTATTAGAGGGTGGGGTGGATTGT-3'，UR:5'-CAACCCCAAACCA CAACCATAA-3'，片段大小為151 bp。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS13.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

42例散發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，有18例檢測到p16基因啟動子甲基化，甲基化率為42.9%;24例乳腺非癌組織中檢測到2例(均為乳腺纖維腺瘤)甲基化，甲基化率為8.3%;其中3例癌旁正常組織甲基化均為陰性，對應(yīng)的癌組織有2例甲基化陽性，1例甲基化陰性。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p16基因啟動子的甲基化率乳腺癌組與非癌組比較差異有顯著性(χ2=8.619，P ＜0.05)，見圖 1。

圖1 p16基因在乳腺癌和非癌組織中的甲基化情況

3 討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移與細(xì)胞周期調(diào)控異常密切相關(guān)，特別是G1期相關(guān)的各種因子，包括正向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞周期蛋白、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶;負(fù)向調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞周期蛋白依賴性因子、抑癌基因產(chǎn)物，這些蛋白可以獨(dú)立或協(xié)同促進(jìn)或抑制惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。p16基因是人類發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因，屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因家族，是細(xì)胞周期負(fù)調(diào)控基因。p16蛋白能與周期蛋白競爭結(jié)合細(xì)胞周期素依賴酶(CDK4、6)，從而抑制細(xì)胞周期素D與CDK復(fù)合物的活性，阻止細(xì)胞進(jìn)入G1/S期，對細(xì)胞周期起反向調(diào)節(jié)作用，抑制細(xì)胞的分裂與增殖。若失去p16蛋白的抑制作用，細(xì)胞會異常增生、分裂，最終失去控制，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

研究證實(shí)在原發(fā)性腫瘤中p16基因突變、缺失率相對較低，而甲基化發(fā)生頻率很高?；虍惓＜谆侨祟惸[瘤早期發(fā)生的1個(gè)重要事件，p16基因甲基化存在于大多數(shù)腫瘤中，如子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、肺癌及白血病中都有報(bào)道。Wong等［2］采用MSP方法，對48例乳腺癌石蠟標(biāo)本進(jìn)行檢測，p16基因甲基化率為27.1%，有淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的甲基化率高于無轉(zhuǎn)移的甲基化率。發(fā)生甲基化的標(biāo)本p16蛋白失表達(dá)率高于非甲基化病例，認(rèn)為p16基因超甲基化是乳腺癌中常見的分子生物學(xué)改變之一，其超甲基化和乳腺癌浸潤及轉(zhuǎn)移有相關(guān)性;甲基化是p16基因失活的主要方式之一。但該研究沒有對非癌組織進(jìn)行甲基化檢測。在Jing等研究中同樣證明了乳腺癌中p16基因超甲基化是其mRNA和蛋白失表達(dá)的主要原因［3］。隨后，Dominguez等［4］和 Munot等［5］也采用 MSP 方法對大量乳腺癌患者進(jìn)行p16基因的甲基化檢測，甲基化率分別為19%(19/100)和 50%(100/200)。Vallian 等［6］采用MSP和重復(fù)序列PCR(PCR-REP)2種方法，對伊朗乳腺癌患者進(jìn)行p16基因甲基化檢測，甲基化率分別為35.7%和40%，2種方法研究結(jié)果相差不大，他們認(rèn)為在伊朗乳腺癌患者中p16基因超甲基化是早期常見的事件，可將p16基因甲基化狀態(tài)用在伊朗乳腺癌患者診斷和治療上。在我們研究中，p16基因在散發(fā)性乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中甲基化率為42.9%，與大多數(shù)研究結(jié)果一致。我們在24例乳腺非癌組織中除了2例乳腺纖維腺瘤檢測出甲基化，其余均未發(fā)生甲基化，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明p16基因甲基化對于乳腺癌的臨床早期診斷具有一定指導(dǎo)意義。由于收集的癌組織標(biāo)本均為浸潤性導(dǎo)管癌，并且多數(shù)為Ⅰ期，故未進(jìn)行甲基化與臨床病理特性相關(guān)性分析。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤患者血漿中存在來源于腫瘤細(xì)胞的游離DNA，在癌癥發(fā)生過程中涉及一系列基因突變及甲基化的改變，為診斷提供分子標(biāo)記。血漿DNA具有取材方便和無創(chuàng)性等特點(diǎn)，通過檢測這些分子標(biāo)記為腫瘤的早期診斷及病情監(jiān)控提供可行性。p16基因在乳腺癌患者外周血中甲基化檢測的研究也有報(bào)道。同時(shí)收集61例乳腺癌患者血漿與相應(yīng)組織標(biāo)本，應(yīng)用MSP技術(shù)，檢測p16基因甲基化狀態(tài)。61例乳腺癌患者血漿和相應(yīng)癌組織中，p16基因的甲基化檢出率分別為44.3%和46.2%，兩者檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［7］。Feng等［8］研究檢測到 p16基因在散發(fā)性乳腺癌患者血漿標(biāo)本中甲基化率為25.4%，與相應(yīng)癌組織標(biāo)本中甲基化率28.6%相差不大，進(jìn)一步說明p16基因很可能成為乳腺癌診斷的分子標(biāo)記物，具有臨床應(yīng)用的價(jià)值。

［1］Bian YS，Osterheld MC，F(xiàn)ontolliet C，et al.p16 inactivation by methylation of the GDKN2A promoter occurs early during neop1astic pmgression in Barrett’s esophagus〔J〕.Gastroente-rology，2002，l22(4):1113.

［2］Wong SC，Chan J K，Lee K C，et al.Differential expression of p16/p21/p27 and cyclin D1/D3，and their relationships to cell proliferation，apoptosis，and tumour progression in invasive ductal carcinoma of the breast〔J〕.J Pathol，2001，194(1):35.

［3］Jing F，Jun L，Yong Z，et al.Multigene methylation in serum of sporadic Chinese female breast cancer patients as a prognostic biomarker〔J〕.Oncology，2008，75(1-2):60.

［4］Dominguez G，Silva J，Garcia JM，et al.Prevalence of aberrant methylation of p14ARF over p16INK4a in some human primary tumors〔J〕.Mutat Res，2003，530(1 ～2):9.

［5］Munot K，Bell SM，Lane S，et al.Pattern of expression of genes linked to epigenetic silencing in human breast cancer〔J〕.Hum Pathol，2006，37(8):989.

［6］Vallian S，Sedaghat M，Nassiri I，et al.Methylation status of p16INK4A tumor suppressor gene in Iranian patients with sporadic breast cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135(8):991.

［7］今 毅，謝 文，余小萍，等.乳腺癌患者腫瘤循環(huán)DNA的定量分析〔J〕.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28(11):1024.

［8］Feng J，Hu LH，Lu J，et al.Diagnostic value of BRCA1 and p16 gene methylation in sporadic breast cancer〔J〕.Chin J Cancer，2009，28(4):436.