不同氮源發(fā)酵生產豆豉纖溶酶的紫外吸收光譜研究

齊海萍，胡文忠，姜愛麗，田密霞

（大連民族學院教育部國家民委重點實驗室，遼寧大連116600）

不同氮源發(fā)酵生產豆豉纖溶酶的紫外吸收光譜研究

齊海萍，胡文忠*，姜愛麗，田密霞

（大連民族學院教育部國家民委重點實驗室，遼寧大連116600）

采用紫外在線檢測方法，對豆豉纖溶酶產生菌UγD8菌株在不同氮源下連續(xù)發(fā)酵56h，對其發(fā)酵特性進行研究，研究結果表明，以酵母膏為氮源發(fā)酵產酶時間44h，吸光度Abs最大，為1.4002；以豆?jié){為氮源發(fā)酵產酶時間為36h，Abs為1.0557；以豆渣為氮源發(fā)酵產酶時間為48h，Abs為1.3301。所用枯草桿菌UγD8發(fā)酵生產豆豉纖溶酶的最佳氮源為酵母膏，產酶量大，但產酶時間晚。其利用率順序為酵母膏＞豆渣＞豆?jié){。選用紫外吸收光譜技術用于檢測發(fā)酵液中有機氮源消耗以及豆豉纖溶酶的產生等動態(tài)變化，得到較為理想的結果，且方便快捷，靈敏度高，可以廣泛用于發(fā)酵過程的監(jiān)測。

UγD8菌株，紫外吸收光譜，氮源

豆豉纖溶酶是一種絲氨酸蛋白激酶，是從中國傳統發(fā)酵食品淡豆豉中提取得到的，豆豉纖溶酶具有與鏈激酶、尿激酶等溶血栓藥物同樣的溶解血栓作用，比之現用于臨床的溶血栓藥物，豆豉纖溶酶具有安全性好，易被人體吸收，作用直接迅速，作用持續(xù)時間長，可由微生物發(fā)酵生產因而造價低廉等優(yōu)點，是一種很有潛力的新型溶血栓藥物［1-2］。近幾年，隨著檢測儀器的精密化和數據處理技術的迅速發(fā)展，發(fā)酵過程在線檢測的研究逐漸深入，一些新興的檢測技術應運而生，如紅外光譜技術［3-6］、熒光分析法、離子敏場效應晶體管技術、核磁共振技術、生物傳感器技術、質譜分析技術、色譜分析技術等。本文研究了發(fā)酵過程中發(fā)酵液紫外吸收光譜的變化，分析比較了發(fā)酵液吸收光譜的變化與細菌生長以及發(fā)酵產酶過程之間的聯系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

血纖維蛋白原 購自Sigma公司；牛凝血酶 購自天津血研所；其它藥品 均為國產分析純；產酶菌UγD8菌株 本實驗室篩選獲得；種子培養(yǎng)基Ⅰ（g/L）葡萄糖 1.5，豆餅粉 2，KH2PO40.1，K2HPO40.25，MgSO45H2O 0.05，酵母膏提取物0.15，pH 7，121℃，20min；發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ（g/L） 葡萄糖1.5，KH2PO40.1，K2HPO40.25，MgSO4·5H2O 0.05，pH 7，121℃，20min；液體培養(yǎng)基Ⅲ 在發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ中添加20g/L的不同氮源，酵母膏，豆渣，豆?jié){。

電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超凈工作臺 安泰公司；BR4i型臺式高速冷凍離心機 法國Jouan公司；UV-2100型紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；UV-2550雙光束紫外光分光光度計 日本島津；pHS-3C精密pH計上海三北儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵液的制備 將斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，37℃，250r·min-1培養(yǎng)8h，然后以4%的接種量分別接入不同的液體培養(yǎng)基Ⅲ中，37℃，250r·min-1培養(yǎng)56h，每隔4h取1mL發(fā)酵液進行以下研究。

1.2.2 豆豉纖溶酶發(fā)酵液紫外吸收光譜的測定 取適量發(fā)酵液，4℃，8000r·min-1離心10min，取上清，雙蒸水稀釋25倍進行紫外光譜掃描，其參比為蒸餾水。分光光度計參數設定：中速掃描，掃描范圍220～320nm，采樣間隔1nm，光譜帶寬0.1nm。

1.2.3 豆豉纖溶酶活性測定方法 采用纖維蛋白平板法進行［7］。

1.2.4 發(fā)酵過程中菌體濃度的測定［7］取培養(yǎng)不同時間的發(fā)酵液加雙蒸水稀釋20倍，以同樣稀釋20倍沒有接種的培養(yǎng)基為空白對照，660nm測定OD值，以OD值表示菌體濃度的大小。

2 結果與討論

2.1 以酵母膏為唯一氮源發(fā)酵液的紫外掃描分析

圖1為發(fā)酵0～56h發(fā)酵液的紫外吸收情況。由圖1（a）可以看出：發(fā)酵前4h，發(fā)酵液紫外吸收的λmax在258nm左右沒有變化，只是其吸收強度顯著下降，Abs由1.2561降為1.0260，說明發(fā)酵前4h內發(fā)酵液中沒有新物質成分的生成，只是原有組分的消耗；圖1中（b）為發(fā)酵4、8h時發(fā)酵液的紫外吸收光譜，λmax由258nm位移至266nm，其吸收峰的位置紅移了8nm左右，可以推斷在4～8h內發(fā)酵液中的氨基酸，特別是芳香族氨基酸如色氨酸和酪氨酸的組成以及含量發(fā)生變化，可能有新物質的產生；圖1中（c）為發(fā)酵12、16、28、32h時發(fā)酵液的紫外吸收情況，可以看出在發(fā)酵16～32h，發(fā)酵液紫外吸收的λmax穩(wěn)定在265nm左右，其吸收強度在逐漸上升，Abs由1.0839升為1.3828，說明了發(fā)酵產生新物質的含量在不斷升高；圖1中（d）為發(fā)酵末期44、48、56h時發(fā)酵液的紫外吸收情況，λmax雖然沒變，但是其吸收強度卻有所下降，可能是新物質的含量降低造成的。

圖1 氮源為酵母膏的紫外掃描結果

2.2 以豆渣為唯一氮源發(fā)酵液的紫外掃描分析

由圖2可以看出，氮源為豆渣時，發(fā)酵前8h，發(fā)酵液紫外吸收的λmax穩(wěn)定在257nm，Abs有所下降；至發(fā)酵24h，發(fā)酵液紫外吸收的λmax移至265nm處；發(fā)酵24～40h，λmax沒有變化，Abs由0.8028升至1.3135；發(fā)酵44h以后，Abs有小幅度下降，說明所產生的新物質已開始減少。

圖2 氮源為豆渣的紫外掃描結果

2.3 以豆?jié){為唯一氮源發(fā)酵液的紫外掃描分析

由圖3可以看出，氮源為豆?jié){時，發(fā)酵液紫外吸收的吸收強度明顯較低，且發(fā)酵40h以后，Abs已開始下降，說明所產生的新物質已開始減少。

圖3 氮源為豆?jié){的紫外掃描結果

2.4 豆豉纖溶酶發(fā)酵中菌體濃度以及產酶量的變化

豆豉纖溶酶發(fā)酵56h內菌體濃度的變化見圖4。由圖4可以看出，2～12h為細菌生長的指數期。該時期細胞生長速率最大、酶系活躍、代謝旺盛，發(fā)酵液中的各營養(yǎng)成分消耗較為顯著，發(fā)酵液中各種營養(yǎng)物質的濃度，特別是碳氮比都將發(fā)生顯著改變，其中有機氮源物質的含量以及所占比例的變化將會影響其紫外吸收光譜。豆豉纖溶酶發(fā)酵過程中發(fā)酵液相對酶活的變化，見圖5。

圖4 豆豉纖溶酶產生菌UγD8發(fā)酵56h內菌體濃度的變化

圖5 豆豉纖溶酶發(fā)酵過程中酶活力的變化

豆豉纖溶酶發(fā)酵過程中酶活力的變化（見圖5）。發(fā)酵前12h主要為細菌生長階段，基本不產生豆豉纖溶酶。圖5顯示，豆豉纖溶酶發(fā)酵0～8h發(fā)酵液的相對酶活幾乎為0；發(fā)酵8h時開始檢測到發(fā)酵液中存在豆豉纖溶酶，但相對酶活較低；在發(fā)酵20～44h內，豆豉纖溶酶的酶活迅速增加，說明發(fā)酵液中豆豉纖溶酶的濃度迅速上升。發(fā)酵的最后階段44～56h內，所檢測到發(fā)酵液的相對酶活降低了，可能是由于發(fā)酵末期豆豉纖溶酶產量降低以及部分降解所致。

3 結論

實驗表明：不同氮源對發(fā)酵特性的影響非常明顯。

豆豉纖溶酶發(fā)酵過程中發(fā)酵液紫外吸收光譜呈現以上變化的原因為：發(fā)酵前期，發(fā)酵液紫外吸收的波峰位置基本沒有變化，只是其吸收強度顯著下降，是由于細菌生長在該時間段處于指數期，細胞代謝旺盛，大量消耗發(fā)酵液中各營養(yǎng)成分，導致氮源物質的含量顯著降低，所以發(fā)酵液的紫外吸收強度顯著下降。發(fā)酵前中期（大約8～20h）內發(fā)酵液紫外吸收的波峰位置發(fā)生了位移，是由于該時間段發(fā)酵產生了新物質豆豉纖溶酶，新蛋白的產生使得發(fā)酵液中氨基酸的組成和結構發(fā)生了改變，特別是芳香族氨基酸如色氨酸和酪氨酸的含量發(fā)生變化導致了發(fā)酵液紫外吸收光譜發(fā)生了改變。發(fā)酵中期發(fā)酵液紫外吸收強度顯著升高，因為該時間段剛好是發(fā)酵液酶活迅速增加的時期，發(fā)酵液中豆豉纖溶酶含量不斷增加導致了紫外吸收強度的逐漸升高。發(fā)酵末期，由于部分豆豉纖溶酶的降解致使發(fā)酵液紫外吸收強度下降，因此，為了酶的高產高收，發(fā)酵時間至末期應即時停止發(fā)酵，分離提取產物酶。

同時，我們從實驗數據中也可以發(fā)現，不同氮源發(fā)酵，其開始產生新物質（即豆豉纖溶酶）的時間是不同的，豆?jié){產酶時間較早。所產酶量也有很大不同（見表1）：酵母膏發(fā)酵44h的Abs最大，為1.4002；豆?jié){，36h，1.0557；豆渣，48h，1.3301。由此，我們可以得到以下結論，所用枯草桿菌UγD8發(fā)酵生產豆豉纖溶酶的最佳氮源為酵母膏，產酶量大，但產酶時間晚，其利用率順序為酵母膏＞豆渣＞豆?jié){。

表1 不同氮源對酶發(fā)酵特性的影響

［1］王金英，劉宇峰.豆豉抗栓作用的研究［J］.生物技術，1997，7（5）：18-20.

［2］張萍萍.纖溶酶產生菌的發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學性質初探［D］.河北大學碩士學位論文，2006.

［3］邱江，潘紅春，韓崇家，等.紅外光譜監(jiān)測糖化酶發(fā)酵過程［J］.光譜學與光譜分析，1999，19（6）：831-833.

［4］葛向紅，趙元黎，張鳳秋，等.癌細胞對血清光譜的影響［J］.光譜學與光譜分析，2004，24（7）：841-843.

［5］趙元黎，張鳳秋，葛向紅，等.細胞培養(yǎng)基的吸收光譜研究［J］.光譜學與光譜分析，2004，24（8）：907-909.

［6］薛萍，鄭文杰.紫外可見光譜在生物無機化學中的應用［J］.廣州化工，2002，30（4）：79-82.

［7］齊海萍.豆豉纖溶酶的制備、酶學特性及功能性質研究［D］.江南大學博士學位論文，2004.

Study on fermentation liquid’s absorption spectra in dochi fibrinolytic enzyme fermentation with various nitrogen sources

QI Hai-ping，HU Wen-zhong*，JIANG Ai-li，TIAN Mi-xia
（College of Life Science，Dalian Nationalities University，Education Department and National Nationality Key Lab，Dalian 116600，China）

UV line detection method was utilized in this experiment，strain UγD8 with high productive fibrinolytic enzyme fermented for 56h under various nitrogen sources，the fermentation liquid was detected by UV every 4h. Conclusions showed as below：when yeast extract as nitrogen source，after fermentation for 8h，the new material began to produce，after fermentation for 44h，maximum absorbance（1.4002）appeared，fermentation end，the absorbance decreased.When soybean milk was the sole nitrogen source，the time of new material started to produce was at 4h fermented，in the 36h，absorbance value achieved maximum（1.0557）.Soybean dreg as nitrogen sources，when fermented for 4h，the broth generated new material，in the 48h，the absorbance value climaxed at 1.3301.

strain UγD8；UV absorption spectrum；nitrogen source

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）01-0175-03

2009-12-17 *通訊聯系人

齊海萍（1973-），女，博士，講師，研究方向：食品生物技術。

遼寧省教育廳基金項目（2008135）。