實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測凝血塊中乙腦病毒RNA*

張擁軍,王金章,朱莉莉,陳 端,陳 煒

2.福建醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院教學(xué)基地;

3.福建省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測中心;

4.廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局;

流行性乙型腦炎(簡稱乙腦)是一種經(jīng)蚊傳播的人獸共患病,主要流行于東南亞及澳洲一些國家和地區(qū)。以嚴(yán)重的腦炎和神經(jīng)疾病為特征,病死率和致殘率高。其致病因子-乙腦病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬,基因組為全長約11 kb的單股正鏈RNA,編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白M和外膜蛋白E)及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A 、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[1]。

盡管人類作為JEV傳播鏈中的終末宿主,病毒血癥期比較短暫,且病毒載量較低,從患者組織、血液或其它體液中檢測JEV特異RNA依然是實(shí)驗(yàn)室確診JEV感染的手段之一[1]。國內(nèi)外多家實(shí)驗(yàn)室先后建立起一些檢測JEV RNA的方法,包括逆轉(zhuǎn)錄PCR、逆轉(zhuǎn)錄套式PCR、逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等[2-7],其中逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光PCR因?yàn)槠淇焖?、簡便、靈敏成為主流發(fā)展方向。但我們?cè)趯?shí)際工作中發(fā)現(xiàn),該方法的靈敏度還不能勝任臨床樣品的檢測[7],因此JEV核酸檢測還沒有作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)診斷的備選方案。

本研究的目的,一是評(píng)價(jià)部分文獻(xiàn)報(bào)道和自行設(shè)計(jì)的實(shí)時(shí)熒光PCR引物的檢測效果,以建立更加靈敏便捷的檢測方法。二是采用新建立的檢測體系,分別選用部分急性期患者血清和凝血塊提取病毒核酸,比較來自同一患者的兩類樣品分別用于JEV核酸檢測的差異?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 毒株、標(biāo)本 武漢生物制品研究所生產(chǎn)的乙型腦炎減毒活疫苗 SA14-14-2株作為陽性參比品,0.5mL生理鹽水復(fù)溶,滴度不低于5×105pfu/mL。所用血清和凝血塊(包括IgM陽性血清和相應(yīng)凝血塊各15份,IgM陰性的血清和相應(yīng)凝血塊各15份)來自2010年6-12月福州市部分醫(yī)院送檢疑似乙腦患者樣品,均處于感染急性期。血清樣品用上海貝西公司ELISA試劑盒檢測JEV-IgM抗體,保存于-20℃?zhèn)溆?。分離血清后,將凝血塊置于微量離心管,保存于-20℃,集中處理。

1.2 主要試劑、儀器 JEV-IgM 抗體檢測ELISA試劑盒購自上海貝西公司,病毒DNA/RNA提取試劑盒(MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0)及一步法SYBRGREEN I RT-PCR試劑盒(One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II)購自T aKaRa公司(大連),病毒 RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini kit)購自QIAGEN公司(美國)。實(shí)時(shí)熒光PCR儀為7500 real time PCR system(Applied Biosystem,美國),高速臺(tái)式離心機(jī)為Eppendorf(美國)產(chǎn)品。

1.3 凝血塊處理、核酸提取根據(jù)文獻(xiàn)[8],將凝血塊轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器,以適量(2～3mL)紅細(xì)胞裂解緩沖液浸泡凝血塊約20min,研磨,離心棄上清,重懸于100μ L生理鹽水。其余步驟按TaKaRa公司試劑盒說明書進(jìn)行,以70μ L洗脫液洗脫。疫苗株RNA模板提取采用QIAGEN公司病毒RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini kit),共使用 140μ L 懸液,50μ L洗脫。

1.4 引物序列及擴(kuò)增反應(yīng) 本研究部分引物來自相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2-6],部分引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中選取的48個(gè)乙腦病毒全基因序列,用Primer Express 3.0軟件分析,并參考乙腦病毒減毒活疫苗SA14-14-2株序列(NCBI登錄號(hào)：AF315119)設(shè)計(jì)(見表1)。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。

實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR按 TaKaRa公司試劑盒說明書進(jìn)行,總體積20μ L,其反應(yīng)體系配制及反應(yīng)條件設(shè)定見表2。

表1 JEV核酸實(shí)時(shí)熒光檢測引物Table 1 Primer sequences of real-time RT-PCR assays for Japanese encephalitis virus RNA

2 結(jié) 果

2.1 9對(duì)JEV引物的擴(kuò)增效果評(píng)價(jià) 取復(fù)溶的JEV減毒活疫苗懸液提取病毒 RNA,并進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋,得到分別相當(dāng)于 5×104、5×103、5×102、50 、5 、0.5 、0.05pfu/mL 病毒量的 RNA 參比品。按試劑盒說明書配制20μ L的反應(yīng)體系,其中加入2μ L RNA模板。在相同條件下,分別進(jìn)行9對(duì)引物與系列稀釋樣品的擴(kuò)增,并進(jìn)行融解曲線分析,見圖1。逐一比較擴(kuò)增曲線及解鏈溫度,確定出這9對(duì)引物的檢測限在50-500pfu/mL之間,其中對(duì)5×104pfu/mL參比品的Ct值在18.01～29.36的范圍。因此,結(jié)合各自的檢測限、陽性產(chǎn)物解鏈溫度的穩(wěn)定性、陽性產(chǎn)物與非特異擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈溫度的差異等因素,見表1,選擇針對(duì)病毒衣殼蛋白區(qū)域的引物6為最佳,其檢測限為50 pfu/mL,解鏈溫度為82.4℃。

表2 熒光PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件Table 2 Real-time PCR reaction mixture and amplification parameters

圖1 陽性樣品及陰性對(duì)照的融解曲線A-I：分別代表引物1-9Fig.1 Dissociation plots of amplification products for positive samples and negative controlA-I：refers to primer pair 1-9 respectively

2.2 血清和凝血塊樣品的檢測 選取2010年送檢的臨床疑似乙腦患者凝血塊樣品,包括乙腦IgM抗體陽性和IgM陰性各15份,同時(shí)選擇這些凝血塊對(duì)應(yīng)的血清樣品,提取病毒DNA/RNA。按照新建立的反應(yīng)體系及相同條件,分別檢測這部分血清和凝血塊中JEV RNA。結(jié)果顯示,凝血塊樣品中,有7份在82.4℃附近出現(xiàn)明顯擴(kuò)增產(chǎn)物,與非特征擴(kuò)增產(chǎn)物明顯不同,因此判為陽性,見圖2A。其中包括IgM陽性樣品5例,IgM陰性樣品2例,見表3。而所有血清樣品均為陰性(在特征82.4℃解鏈溫度處無擴(kuò)增產(chǎn)物),見圖2B。

圖2 部分樣品及陽性對(duì)照的融解曲線A：凝血塊;B：血清Fig.2 Dissociation plots of amplification products for 7 selected samples and positive controlA：blood clots;B：sera

表3 熒光PCR檢測血清和凝血塊樣品中病毒RNATable 3 Summary of real-time PCR results for viral RNA in sera and blood clots

3 討 論

目前JEV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷仍然以ELISA方法檢測患者血清中病毒特異性IgM抗體為主,病毒RNA的檢測是血清學(xué)方法的補(bǔ)充手段[1]。開展病毒RNA檢測,一方面可以對(duì)處于病毒血癥期而IgM抗體陰性的患者進(jìn)行確診,避免出現(xiàn)漏診;另一方面,病毒RNA陽性,意味著患者處于病毒血癥期,可以指導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室有針對(duì)性地進(jìn)行病毒分離,有利于監(jiān)控JEV野毒株在環(huán)境中的進(jìn)化和變異[1]。由于乙腦病毒的傳播主要通過豬、水禽、蚊之間的自然循環(huán),只有豬和水禽產(chǎn)生的病毒血癥才足以感染蚊子,因而是JEV維持、擴(kuò)增及傳播的重要宿主。雖然人、馬感染JEV可以導(dǎo)致致死性腦炎,由于病毒血癥期病毒載量低、持續(xù)時(shí)間短,對(duì)JEV的傳播擴(kuò)散貢獻(xiàn)不大,只被認(rèn)為是病毒的終末宿主[1]。如何從低病毒載量臨床樣品中快速檢出JEV RNA,一直是各級(jí)臨床實(shí)驗(yàn)室努力發(fā)展的方向。

鑒于JEV在患者樣品中病毒載量較低,必須建立高度敏感的核酸檢測方法。文獻(xiàn)報(bào)道各種核酸檢測方法中,檢測限在0.1～64pfu之間[2-7],尤其以實(shí)時(shí)熒光PCR敏感、快速。其中TaqMan探針的實(shí)時(shí)熒光PCR方法,盡管靈敏度高、特異性強(qiáng),由于試劑昂貴,其大規(guī)模推廣應(yīng)用受到限制。而以 SYBR Green I染料為主的實(shí)時(shí)熒光PCR方法,盡管由于非特異性擴(kuò)增的干擾,在方法的特異性上可能稍遜,其敏感性與TaqMan方法相差無幾,試劑成本則大大降低,因此受到基層實(shí)驗(yàn)室的青睞,更加適合于大規(guī)模監(jiān)測和調(diào)查。我們?cè)诮⒆约簩?shí)驗(yàn)室的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光PCR體系過程中發(fā)現(xiàn),一些文獻(xiàn)所報(bào)道的體系,主要針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)參比毒株或分離培養(yǎng)物,無法滿足低病毒載量臨床樣品的檢測。因此,我們對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道及自行設(shè)計(jì)的9對(duì)引物進(jìn)行了檢測效果評(píng)價(jià)。

有別于傳統(tǒng)PCR引物設(shè)計(jì),實(shí)時(shí)熒光PCR引物還有一些特別的要求。Applied Biosystems公司的Primer Express3.0軟件中主要遵循以下原則：擴(kuò)增產(chǎn)物長度50～150bp;最適引物長度為20寡核苷酸;G+C%在30%～80%之間;解鏈溫度Tm在58℃～60℃,最佳Tm為59℃,并且2個(gè)引物之間Tm應(yīng)該比較接近;3'末端最后5個(gè)核苷酸不能有2個(gè)以上G+C殘基;尤其要避免相同的核苷酸重復(fù),更不能有連續(xù)4個(gè)G殘基。按照這樣的原則,我們發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中出現(xiàn)的引物T m在51.3℃～68.6℃,同一對(duì)引物之間相差最大的達(dá)到7℃;并且10個(gè)引物中有3個(gè)引物的最后5個(gè)核苷酸有2個(gè)以上G+C,甚至還出現(xiàn)連續(xù)的4個(gè)G殘基;部分?jǐn)U增產(chǎn)物長度也超過150bp(表1)。這可能就是這批引物檢測效果欠佳的原因。而重新設(shè)計(jì)的4對(duì)引物,T m值在58.55℃～61.98℃之間,同一對(duì)引物之間Tm相差在1℃以內(nèi),也避免了那些容易導(dǎo)致“表現(xiàn)不佳的結(jié)構(gòu)”。因此,新引物均能得到較低的檢測限(50pfu/mL,見表1),檢測效果明顯優(yōu)于文獻(xiàn)中的引物。

檢測病毒DNA或 RNA通常采用全血、血漿、血清、腦脊液、唾液、尿液等材料,對(duì)于來自同一個(gè)患者,不同來源的材料得到的病毒載量結(jié)果是否存在差異,類似的報(bào)道不多見,利用血清分離后剩下的凝血塊作為檢材的報(bào)道更加少見[9-15]。我們首次采用實(shí)時(shí)熒光PCR檢測凝血塊的病毒DNA/RNA提取物中JEV RNA,發(fā)現(xiàn)凝血塊樣品較血清樣品敏感,可能基于以下因素。1)病毒載量在不同檢材中的分布存在不均一。以人免疫缺陷病毒(HIV)為例,Lee等人檢測同一患者的新鮮血液、外周單核細(xì)胞(PBMCs)、血漿、血小板、紅細(xì)胞等血液成分中 HIV DNA及感染性病毒,發(fā)現(xiàn)血小板中存在大量HIV,稱之為血小板相關(guān)HIV-1,并伴隨HIV感染的各個(gè)階段[11]。另外Bruisten等人檢測全血、血漿、PBMCs和血小板中HIV,幾乎所有PBMCs均為陽性,其余樣品檢出率低于PBMCs[12]。類似結(jié)果同樣在丙型肝炎病毒(HCV)RNA檢測中得到驗(yàn)證。Schmidt等人通過改進(jìn)RNA提取方法,發(fā)現(xiàn)部分患者血漿HCV RNA陰性,而全血樣品為陽性[13]。2)一些病毒本身可以感染并長時(shí)間存在于PBMCs中。例如HCV、乙型肝炎病毒(HBV)除了具有肝細(xì)胞嗜性外,還可以感染其它細(xì)胞如PBMCs[14]。而另一方面,血漿或血清中的部分HCV RNA,可能隨著免疫復(fù)合物沉淀及冷球蛋白凝集,導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性;而采用全血樣品,可以同時(shí)提取細(xì)胞內(nèi)和血漿中RNA,可能有助于低病毒載量患者的診斷[15]。對(duì)于JEV,病毒感染初期JEV能夠在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中有效復(fù)制并存活較長時(shí)間,可能充當(dāng)JEV進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的載體[2,12]。Sapkal等人嘗試用12名乙腦患者(9例IgM陽性,3例陰性)凝血塊中的白細(xì)胞分離JEV,通過與植物血凝素P刺激過的PBMCs共同培養(yǎng),成功分離到 2株 JEV。同時(shí)以這12名患者腦脊液樣品接種小鼠,卻未分離到病毒[8]。3)樣品處理過程中的濃縮效應(yīng)。常用的從患者血清、血漿中提取病毒DNA/RNA的方法,一般需要的樣品量在 200μ L以下,相當(dāng)于500μ L左右全血。我們選擇的紅細(xì)胞裂解液浸泡加上機(jī)械研磨、離心的處理程序,可以一次處理3mL以上全血的凝血塊,因此也能夠提升檢測靈敏度。另外,從血清或血漿中提取的DNA/RNA樣品,往往缺乏合適的內(nèi)對(duì)照,無法對(duì)樣品處理及PCR過程進(jìn)行有效質(zhì)控。而凝血塊樣品中提取的DNA/RNA,由于存在大量人類細(xì)胞成分,很容易利用一些人類管家基因,實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)過程的質(zhì)量控制。

我們建立的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測JEV RNA方法,盡管其敏感度稍遜于敏感度最高的套式PCR方法,仍然從30例確診或疑似乙腦患者凝血塊中檢出7例陽性,而血清樣品無一例陽性。該方法快速、簡便、靈敏,尤其避免了套式PCR中經(jīng)常出現(xiàn)的污染。目前病毒性腦炎相關(guān)的病原體核酸檢測,因?yàn)椴《据d量不高,一些病原體的檢測不得不采用繁瑣的套式PCR來提高檢出陽性率。以上結(jié)果和分析表明,利用凝血塊樣品提取病毒DNA/RNA,對(duì)病毒性腦炎的實(shí)驗(yàn)室診斷具有重要價(jià)值。

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