阿魏側(cè)耳多糖酶水解制備工藝研究△

王瑩，李國(guó)玉，黃健，魏秀巖，馬躍平，高建波，王金輝,,3*

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

國(guó)家863項(xiàng)目(2008AA10Z323)

*王金輝,E-mail：tcm_shz@yahoo.cn

阿魏側(cè)耳多糖酶水解制備工藝研究△

王瑩1，李國(guó)玉1，黃健2，魏秀巖2，馬躍平2，高建波1，王金輝1,2,3*

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子832002；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110016；3.教育部省部共建新疆特種植物藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832002)

目的采用蛋白酶水解法提取制備阿魏側(cè)耳多糖。方法采用硫酸-苯酚顯色測(cè)定多糖的含量，采用UV法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。研究不同蛋白酶在不同條件下對(duì)阿魏側(cè)耳多糖提取率和除蛋白效果的影響。結(jié)果最佳酶底比為8mg·g-1，溫度60℃，最適pH值為6.0，最佳酶解時(shí)間為90min。結(jié)論采用蛋白酶水解法可以制得純度很高的阿魏側(cè)耳多糖。

蛋白酶水解法；阿魏側(cè)耳多糖；提取制備工藝

阿魏側(cè)耳PleurotusferulaeLanzi又名阿魏菇，是一種新疆特色的食、藥兩用大型真菌，因寄生或腐生在藥用植物阿魏上而得名[1]。試驗(yàn)研究表明阿魏側(cè)耳多糖(Pleurotusferulaepolysaccharide, PFP)對(duì)γ輻射產(chǎn)生的自由基所造成的鼠肝線粒體細(xì)胞膜傷害具有抗氧化抑制效果[2]。巨噬細(xì)胞吞噬作用試驗(yàn)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)的誘生與檢測(cè)試驗(yàn)測(cè)得阿魏側(cè)耳粗多糖具有免疫增強(qiáng)活性[3]。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)阿魏菇多糖具有明顯的抗氧化[4]、延緩衰老[5]、抗腫瘤[6-11]、抑制核糖核酸酶[12]等作用。

阿魏側(cè)耳多糖的提取方法研究，多簡(jiǎn)單采用熱水浸提的方法[3,12-14]。筆者研究表明，阿魏側(cè)耳多糖提取過(guò)程中，蛋白質(zhì)類成分干擾很大，采用常規(guī)的離子交換色譜法、溶劑法(Sevage法)除蛋白的過(guò)程復(fù)雜，并且容易引進(jìn)有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，嚴(yán)重影響阿魏側(cè)耳多糖的質(zhì)量。因此，本研究采用蛋白酶水解的方法，建立了阿魏側(cè)耳多糖的高效的提取純化方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器

SartoriusBP211D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，SK5200HP型超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲有限公司)，UV-2409型紫外分光光度計(jì)，DZKW型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，791型磁力加熱攪拌器(南匯電訊器材廠)，EYBLA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，SHZ-D9(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，DzF型真空干燥箱(上海市精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.2試藥

阿魏側(cè)耳購(gòu)于新疆石河子市，經(jīng)石河子大學(xué)譚勇博士鑒定為阿魏側(cè)耳PleurotusferulaeLanzi。標(biāo)本號(hào)為No.20071002001，保存在石河子大學(xué)藥學(xué)院。葡萄糖、苯酚、無(wú)水乙醇、濃硫酸等均為分析純，水為二重蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1利用文獻(xiàn)硫酸-苯酚法[12]測(cè)定多糖的含量

2.1.1 苯酚溶液制備 苯酚5g，用少量水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成苯酚溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取烘干至恒重的無(wú)水葡萄糖0.101 1g，溶于100mL蒸餾水中，配成1.011mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2,0.3,0.4,0.6,0.8mL置5只試管中，加蒸餾水至1.0mL，加入硫酸-苯酚顯色液(加1mL苯酚溶液和5mL硫酸)，沸水浴30min，放至室溫，在490nm處，測(cè)其吸光度A。用同樣處理的蒸餾水做空白對(duì)照，以吸光度A為縱坐標(biāo)，糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=1.429 3X-0.044 5，r=0.999 8，表明多糖在0.028 89～0.115 5 mg·mL-1具有良好的線性關(guān)系。

2.1.3 測(cè)定法 樣品加1 mL苯酚溶液和5 mL硫酸，沸水浴30 min，冷卻至室溫，490 nm處測(cè)吸光度A，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算，即得。

2.2多糖提取條件正交試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.1因素水平設(shè)計(jì) 選取影響多糖提取的3個(gè)主要因素：溫度(A)、時(shí)間(B)、料液比(C)，采用L9(34)進(jìn)行了正交試驗(yàn)，以多糖得率為指標(biāo)，優(yōu)選最佳工藝。為了提高統(tǒng)計(jì)分析的可靠性，每一條件下都作了重復(fù)試驗(yàn)(n=3)，測(cè)定結(jié)果取其平均值。因素水平表見表1。

表1 阿魏側(cè)耳多糖提取正交試驗(yàn)因素水平表

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 阿魏側(cè)耳多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析表

表2直觀分析可知,RC>RA>RB，即影響阿魏菇多糖提取率的諸因素的主次關(guān)系依次是料液比(C)>浸提溫度(A)>浸提時(shí)間(B)。

表3方差分析表明，最佳工藝條件為A1B1C3。即浸提溫度70 ℃，浸提時(shí)間2 h，料液比1∶40。

2.3阿魏側(cè)耳多糖木瓜蛋白酶解純化工藝的考察

2.3.1最適酶用量的確定 取7個(gè)具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20mL(0.5568g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶(酶與底物質(zhì)量比)0,2,4,6,8,10,12mg·g-1，用HCL調(diào)pH6，50℃水浴2h后沸水浴10min使酶滅活，冷卻至室溫，3000r·min-1離心5min，取上清液加95%乙醇至醇濃度80%，3000r·min-1離心10min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測(cè)多糖得率，結(jié)果見表4，確定最佳酶底比為8mg·g-1。

表4 最適酶用量考察結(jié)果

2.3.2 最適酶解時(shí)間的確定 取7個(gè)具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20 mL(0.556 8 g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶89.12 mg用HCL調(diào)pH 6，分別50℃水浴0,30,60，90，120，150，180 min后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測(cè)多糖得率,結(jié)果見表5，確定最佳酶解時(shí)間為90 min。

表5 最適酶解時(shí)間考察結(jié)果

2.3.3 最適pH值的確定 取3個(gè)具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20 mL(0.556 8 g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶89.12 mg用HCL分別調(diào)pH為3、4、5、6、7、8、9，分別50 ℃水浴90 min后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測(cè)多糖得率，結(jié)果見表6，確定最佳酶解pH值為6。

表6 最適酶解時(shí)間考察結(jié)果

2.3.4 最適酶解溫度的確定 取7個(gè)具塞錐形瓶，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20 mL(0.556 8 g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶89.12 mg用HCL分別調(diào)pH為6，分別30，40，50，60，70，80，90 ℃水浴90 min后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測(cè)多糖得率,結(jié)果見表7，確定最佳酶解溫度為60 ℃。

表7 最適酶解溫度考察結(jié)果

2.3.5 工藝驗(yàn)證 取3個(gè)具塞錐形瓶平行做3組，每瓶加入阿魏側(cè)耳提取液20 mL(0.556 8g·mL-1)，分別加入木瓜蛋白酶89.12 mg用HCL分別調(diào)pH為6，60 ℃水浴90 min后沸水浴10 min使酶滅活，冷卻至室溫，3 000 r·min-1離心5 min，取上清液加95 %乙醇至醇濃度80 %，3 000 r·min-1離心10 min取沉淀，同法洗滌沉淀3次，測(cè)多糖得率分別為3.11 %，3.15 %，3.09 %，RSD=0.8 %(n=3)。

3 討論

影響阿魏側(cè)耳多糖提取工藝的各因素重要程度依次為料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間，且料液比對(duì)阿魏側(cè)耳多糖提取有顯著性影響。正交分析得到的阿魏側(cè)耳多糖提取工藝最佳參數(shù)為浸提溫度70℃，浸提時(shí)間2h，料液比1∶40。

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StudyonExtractionofPolysaccharideofPleurotusferulae

WANG Ying1，LI Guo-yu1，HUANG Jian2，WEI Xiu-yan2，MA Yue-ping2，GAO Jian-bo1，WANG Jin-hui1,2,3

(1.SchoolofPharmacy,ShiheziUniversity,Shihezi832002,China; 2.SchoolofTraditionalChineseMateriaMedica,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China; 3.KeyLaboratoryofPhytomedicineResources&ModernizationofTCM,Shihezi832002,China)

Objective: Enzymatic hydrolysis processes of polysaccharides fromPleurotusferulaewere investigated.

: Enzymatic hydrolysis processes were developed by determination the concentration of the polysaccharides from by using UV spectrophotometry method. : The enzyme concentration ( mg·g)，time ( ℃)，pH .，and temperature ( min) of hydrolysis processes, was developed. : Enzymatic hydrolysis is powerful for extracting the polysaccharide from .

Enzymatic hydrolysis; polysaccharide; Extraction processes

--)