• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    胚胎腦片免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染技術(shù)在神經(jīng)元發(fā)生研究中的應(yīng)用

    2011-11-02 01:52:37吳美延莉陳愛(ài)軍
    關(guān)鍵詞:腦片放射狀瓊脂糖

    敖 然 吳美延 趙 慧 周 莉陳愛(ài)軍

    (吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系,長(zhǎng)春 130021)

    胚胎腦片免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染技術(shù)在神經(jīng)元發(fā)生研究中的應(yīng)用

    敖 然 吳美延 趙 慧 周 莉*陳愛(ài)軍

    (吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系,長(zhǎng)春 130021)

    目的 為更客觀地觀察胚胎腦神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、分化和遷移,建立胚胎腦片免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染技術(shù)。方法 灌流固定,取胚胎14天(E14)大鼠腦,低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋,振動(dòng)切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果 波形蛋白(Vimentin)和乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)雙陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色熒光,胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀。ChAT陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光,除胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸展外,可見(jiàn)皮層板區(qū)也有陽(yáng)性細(xì)胞集聚。結(jié)論 此項(xiàng)技術(shù)可直接觀察到胚胎腦神經(jīng)祖細(xì)胞和成神經(jīng)細(xì)胞的完整形態(tài),并通過(guò)免疫熒光組織化學(xué)方法鑒定其表型,從而闡明相互之間的關(guān)系。

    胚胎腦片; 免疫熒光組織化學(xué); 神經(jīng)元發(fā)生

    在研究胚胎端腦神經(jīng)元發(fā)生時(shí),為證實(shí)神經(jīng)元的來(lái)源、遷移和歸宿,常常需要通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)鑒別神經(jīng)元類(lèi)型,有時(shí)還需檢測(cè)兩種標(biāo)志性蛋白共存于同一種細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。但是,由于胚胎端腦細(xì)胞核大,細(xì)胞質(zhì)極少,一般免疫組織化學(xué)雙重染色很難客觀地辨認(rèn)兩種蛋白是否共存于同一胞質(zhì)內(nèi)。此外,一般石蠟切片和冰凍切片,厚度為5-20μm,端腦細(xì)胞多為放射狀突起細(xì)胞,在如此薄的組織切片上僅能見(jiàn)到長(zhǎng)突起的斷續(xù)截面,而不能觀察這些細(xì)胞長(zhǎng)突起的立體完整形態(tài)以及與周?chē)?xì)胞的聯(lián)系,因此,薄切片和一般免疫組織化學(xué)染色技術(shù)限制了對(duì)胚胎腦發(fā)育的研究。使用瓊脂糖包埋胚胎腦組織,振動(dòng)切片機(jī)把腦切成厚度為60-100μm的腦片,免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)行漂染,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察,不但可以觀察端腦細(xì)胞的完整形態(tài),還可以在活體熒光標(biāo)記之后動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)祖細(xì)胞增殖、分裂,產(chǎn)生成神經(jīng)細(xì)胞后的遷移以及最后的歸宿,從而更深入地了解神經(jīng)元發(fā)生的細(xì)胞機(jī)制。然而,由于缺乏此類(lèi)技術(shù)的相關(guān)資料,使其不能在國(guó)內(nèi)普遍應(yīng)用。因此實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索,建立了一套較完善的技術(shù)體系。

    材料和方法

    1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    實(shí)驗(yàn)所用清潔級(jí) Wistar大白鼠3只,雌性2只,雄性1只,由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為 SCXK-(吉)2003-0001)。雌性大鼠體質(zhì)量為(220±10)g,雄性大鼠體質(zhì)量為(250±10)g,按常規(guī)方法將雌雄大鼠合籠交配,次日清晨以鏡檢陰道涂片,發(fā)現(xiàn)精子或陰栓之日為妊娠第零天(E0),并記錄胎齡,屏障環(huán)境飼養(yǎng)。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 取材及腦片標(biāo)本制備

    取懷孕14天 Wistar大鼠乙醚麻醉,打開(kāi)胸腔左心室插管,快速注入預(yù)熱生理鹽水,沖凈血液,10%中性甲醛溶液灌流固定,取出胚胎腦,置入同一種固定液中,再固定24h,4℃;10%低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋,置于4℃冰箱內(nèi)冷卻1h,繼續(xù)固定 24h,4℃。調(diào)節(jié)振動(dòng)切片機(jī)刀片角度。修整組織塊,去掉組織周?chē)^(guò)多的瓊脂糖,用膠水把包埋塊固定于切片臺(tái)上,將胚胎腦調(diào)整為冠狀位,切片厚度為60μm,調(diào)節(jié)切片速度和振幅,連續(xù)切片,切片置入裝有0.01Mol PBS的平板孔中保存?zhèn)溆肹1-3]。

    2.2 免疫熒光組織化學(xué)雙重漂染

    胰蛋白酶消化修復(fù)抗原,用預(yù)熱0.1%胰蛋白酶液37℃孵育切片,30min;為使抗體滲入細(xì)胞內(nèi),使用去污劑使細(xì)胞膜穿孔,3%TritonX-100恒溫?fù)u床中孵育20℃,24h;0.01%卵白素孵育30min,RT,以封閉內(nèi)源性生物素[4-7];即3%甲醇-過(guò)氧化氫孵育40min,RT,封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;為封閉非特異性反應(yīng),分別用 5%山羊血清和 2%BSA孵育30min,RT;同時(shí)加入兩種不同一抗孵育,4℃過(guò)夜,一是小鼠抗大鼠單克隆抗波形蛋白抗體(Vimentin),二是兔抗大鼠多克隆抗乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶抗體(ChA T),用一抗稀釋液(含10mg/ml BSA 和0.05(v/v)%Tween的 PBS)配制抗體,效價(jià)分別為1:200和1:100,PBS分別替代兩種抗體作為陰性對(duì)照;針對(duì)ChAT滴加羊抗兔生物素化 IgG(二抗)孵育40min,RT;SABC復(fù)合物標(biāo)記Cy3孵育40min,RT(避光);針對(duì)Vimentin滴加羊抗小鼠 FITC-IgG(二抗稀釋液為含5%BSA和1‰Triton X-100的PBS),效價(jià)為1:50,孵育60min,RT(避光);防熒光淬滅封片劑封片,放入濕盒中保存;激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。以上步驟除加一抗前封閉非特異性反應(yīng)步驟無(wú)需將組織片沖洗外,其余步驟完成后均需使用含0.1%Triton X-100的 PBS漂洗3-5次 ,每次 3-5min。

    結(jié) 果

    在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察連續(xù)切片的每一張腦片,發(fā)現(xiàn)僅在第三張腦片端腦背側(cè)前角部(圖1a)可見(jiàn)乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT,膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志性蛋白)陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光,這些細(xì)胞胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸展,此外,皮層板區(qū)也積聚許多不規(guī)則形ChAT陽(yáng)性細(xì)胞(圖1c);而波形蛋白(Vimentin,放射狀膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志性蛋白)陽(yáng)性細(xì)胞幾乎在每一張腦片中均有表達(dá),呈綠色熒光,這些細(xì)胞胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸向軟腦膜[8,9],并在其末端相互連接成網(wǎng)(圖1b)。當(dāng)把同一張腦片的兩種不同熒光染色重疊時(shí),ChAT和Vimentin雙陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色熒光,僅見(jiàn)于腦室區(qū)呈放射狀(圖1d)。此結(jié)果不僅提示膽堿能神經(jīng)元是由放射狀膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生,而且還提示放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在不對(duì)稱(chēng)分裂的同時(shí),已經(jīng)出現(xiàn)將要產(chǎn)生的神經(jīng)元表型,這一發(fā)現(xiàn)對(duì)于研究端腦神經(jīng)元的發(fā)生和遷移機(jī)制甚為重要。

    討 論

    使用瓊脂糖包埋胚胎腦組織,振動(dòng)切片機(jī)切片,免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)漂染,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察,這種技術(shù)比一般免疫組織化學(xué)技術(shù)在研究腦發(fā)育方面有更多的優(yōu)越性。由于大腦神經(jīng)元發(fā)生是以腦室為中心向周?chē)史派錉钸w移,逐漸形成放射狀結(jié)構(gòu)單位,此種立體結(jié)構(gòu)很難在平面上完整顯示,而振動(dòng)切片機(jī)切出的厚切片則彌補(bǔ)了這一不足。放射狀膠質(zhì)細(xì)胞是胚胎端腦中瞬時(shí)性神經(jīng)干細(xì)胞,它將在不同時(shí)間分化為神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。波形蛋白(vimentin)僅在神經(jīng)干細(xì)胞階段特異性表達(dá),當(dāng)細(xì)胞分化為特定類(lèi)型的神經(jīng)元時(shí),波形蛋白表達(dá)逐漸消失[10]。然而,我們正是應(yīng)用了上述技術(shù)才在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)干細(xì)胞階段不但表達(dá)波形蛋白,同時(shí)還表達(dá)它將要分化的神經(jīng)元類(lèi)型特異性蛋白,如膽堿能神經(jīng)元的乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶。盡管對(duì)此現(xiàn)象的意義還不甚了解,但是,它提示了在腦發(fā)育早期神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的作用遠(yuǎn)比目前已知的更為復(fù)雜。此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用使得胚胎端腦放射狀膠質(zhì)細(xì)胞如何產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程以及它們的時(shí)空關(guān)系更容易被觀察。這對(duì)研究腦神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生機(jī)制至關(guān)重要。

    圖1 E14大鼠腦片免疫熒光雙重染色圖1a.端腦冠狀切片hoechst33258染色,白框顯示端腦背側(cè)前角部;圖1b.Vimentin陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光,這些細(xì)胞胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸向軟腦膜,并在其末端相互連接成網(wǎng);圖1c.端腦背側(cè)前角部可見(jiàn)ChAT陽(yáng)性細(xì)胞,呈紅色熒光,這些細(xì)胞胞體位于腦室區(qū),長(zhǎng)突起呈放射狀伸展。此外,皮層板區(qū)集聚許多不規(guī)則形ChAT陽(yáng)性細(xì)胞;圖1d.同一張腦片的兩種不同熒光染色重疊,ChAT和Vimentin雙陽(yáng)性細(xì)胞呈黃色熒光,多見(jiàn)于腦室區(qū)呈放射狀。Fig.1 Immunofluorescence Double Staining for E14 Rat Brain sliceFig.1a. showing telencephalon coronal section with hoechst33258 staining,fore corner of dorsal telencephalon is showed by the white frame. Fig1b. Vimentin positive cells appeared to be green fluorescence,the cellular bodies locate in the ventricle zone(VZ),radial long processes extend to the pial and the each other links into web. Fig1c. ChAT positive cells with red fluorescence were found in the fore corner of dorsal telencephalon. Fig1d. When immunofluorescence double stainning was merged in a visual field ChAT and Vimentin double-positive cells appear to be yellow fluorescence and the radial long processes were seen in the VZ and SVZ,then ChAT positive cells were only observed in the cortex plate.

    此項(xiàng)技術(shù)的每一環(huán)節(jié)與常規(guī)免疫組織化學(xué)技術(shù)均有所不同。首先,選擇低熔點(diǎn)瓊脂糖作為包埋劑,可以避免因包埋組織時(shí)組織受熱過(guò)度而使被檢物喪失抗原性。再則,低熔點(diǎn)瓊脂糖質(zhì)地軟、黏度大,易與腦組織融為一體。關(guān)于使用濃度,文獻(xiàn)的報(bào)道不盡相同[11,12]。我們經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)摸索出適合于本實(shí)驗(yàn)的最佳濃度,即10%瓊脂糖。配制時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn):一是根據(jù)所需包埋組織的數(shù)量,配制適量的瓊脂糖溶液,現(xiàn)配現(xiàn)用,不宜反復(fù)加熱,因?yàn)榧訜釙r(shí)液體蒸發(fā)過(guò)多,瓊脂糖易粘在容器底部,還會(huì)出現(xiàn)許多氣泡,影響包埋組織的質(zhì)量;二是注意控制包埋時(shí)溶解瓊脂糖的溫度,一般控制在50℃左右為宜;三是在進(jìn)行包埋前,取出浸泡在10%中性甲醛中的大鼠胚胎腦,自來(lái)水充分沖洗殘留的甲醛,吸干腦表面的水分,防止在切片時(shí)腦組織與瓊脂糖分離;四是在包埋胚胎腦時(shí),使胚胎嘴部朝向正上方,以保證腦片呈冠狀面。操作時(shí)首先用鑷子夾住組織放入包埋槽底部,緩慢倒入瓊脂糖溶液,待浸沒(méi)包埋槽底部后慢慢抽出鑷子,繼續(xù)倒入瓊脂糖,使其完全覆蓋組織,將包埋好的組織塊置入冰箱冷藏室內(nèi)40-60min,完全凝固后再置入10%中性甲醛溶液24h,以增加瓊脂糖的硬度。如果使用其它組織可以適當(dāng)調(diào)整在甲醛內(nèi)浸泡時(shí)間,盡量使瓊脂糖的硬度與組織相近,以免切片時(shí)組織與瓊脂糖分離。倘若長(zhǎng)時(shí)間浸泡,應(yīng)及時(shí)更換甲醛液。

    振動(dòng)切片機(jī)是以切厚組織片為特點(diǎn),固定和非固定組織均可。這種厚組織片不易貼附于載玻片染色,故采用漂染方法。切片前先用量角器調(diào)節(jié)刀片角度,一般不應(yīng)小于20度,若角度不適當(dāng),刀片過(guò)度上翹,切片時(shí)后部的金屬托擠壓組織塊,使組織碎裂;組織塊修整后使用502膠將其固定在托盤(pán)上,隨后加入0.01mol/L PBS浸沒(méi)組織塊即可切片。切片的速度和振幅需依據(jù)組織塊的硬度和大小進(jìn)行調(diào)節(jié)。若已切好的組織片不準(zhǔn)備當(dāng)天染色,可放入留有微量PBS平板孔中,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩4诉^(guò)程應(yīng)注意如果切片在平板孔中浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng),易使瓊脂糖與組織分離,染色時(shí)不便于操作。

    對(duì)于免疫熒光組織化學(xué)厚切片染色,欲達(dá)到理想的染色效果,關(guān)鍵問(wèn)題在于如何使抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和抑制非特異性反應(yīng)[13]。本實(shí)驗(yàn)為使抗體能穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞質(zhì)中的中間絲蛋白結(jié)合,經(jīng)反復(fù)摸索細(xì)胞膜打孔條件,最后確認(rèn)使用高濃度去污劑,即3%TritonX-100,把裝有腦片的平板孔放入恒溫?fù)u床中,20℃,孵育24h。在每一步驟后的漂洗中,使用含 0.1%TritonX-100的 PBS,并且增加漂洗次數(shù),效果更佳。在控制非特異性反應(yīng)方面,注意要分別使用與二抗種屬相同的非免疫血清和2%BSA封閉,在一抗孵育和漂洗結(jié)束后再增加一次2%BSA封閉,以防止二抗發(fā)生的非特異性反應(yīng)。一抗和二抗稀釋液的配制也需加入一定量的BSA和低濃度的 Triton X-100,使得在加入一抗和二抗的同時(shí),再次封閉非特異性反應(yīng)。由于采用免疫熒光雙重染色,同時(shí)加入兩種不同種屬的抗體,因此在配制抗體時(shí),既要使所用稀釋液符合第一種抗體的效價(jià),又要同時(shí)符合第二種抗體的效價(jià)。此外,對(duì)照實(shí)驗(yàn)也很重要,除需設(shè)置一抗陰性對(duì)照和二抗陰性對(duì)照以外,還需設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,以此來(lái)判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)性和操作方法的正確性。免疫熒光組織化學(xué)染色的大部分步驟結(jié)束后均需充分漂洗切片,以去掉殘留的試劑和未結(jié)合的抗體。在漂洗切片時(shí),如使用吸管吹打,瓊脂糖與腦片容易分離,可將裝有組織片的平板孔放在微量振蕩器上,利用振蕩使腦片在漂洗液中緩慢旋轉(zhuǎn),起到充分漂洗的作用。

    使用一般熒光顯微鏡不能觀察免疫熒光染色的厚切片,因?yàn)榧ぐl(fā)光在標(biāo)本的表層則被消耗掉,標(biāo)本其余部分的熒光不能被激發(fā)。激光掃描共聚焦顯微鏡具有深度識(shí)別能力和縱向分辨力,可以彌補(bǔ)這一不足。激光掃描共聚焦顯微鏡逐層對(duì)腦片獲得光學(xué)橫斷面圖像,實(shí)現(xiàn)顯微“CT”功能。它提供的圖片信息甚至可能比幾百?gòu)埱衅€要多。在這些圖片信息中我們更直接地觀察到 E14大鼠端腦神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖、分化,產(chǎn)生成神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)程。如果通過(guò)電穿孔把帶有綠色熒光蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入胚胎腦側(cè)腦室,制備成腦片后在不同時(shí)間拍照,則能動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)元發(fā)生和遷移,倘若把腦片實(shí)施免疫熒光化學(xué)染色,可以鑒別神經(jīng)元類(lèi)型[14,15]。因此,熟練掌握這項(xiàng)技術(shù)是深入研究胚胎腦發(fā)育和神經(jīng)元發(fā)生不可缺少的。

    [1]Kim B.Nguyen,Michael P. Pender.A simple technique for flat osmicating and flat embedding of immunolabelled vibratome sections of the rat spinal cord for light and electron microscopy.Journal of Neuroscience Methods,1996,65(1):51-54

    [2]Evers,H.B.M. Uylings.Effects of microwave pretreatment on immunocytochemical staining of vibratome sections and tissue blocks of human cerebral cortex stored in formaldehyde fixative for long periods.Journal of Neuroscience Methods,1994,55(2):163-172

    [3]Archana Hayaran,Veena Bijlani.Polyacrylamide as an infiltrating and embedding medium for vibratome sectioning of human fetal cerebellum containing Dil-filled axons.Journal of Neuroscience Methods,1992,42(1-2):65-68

    [4]Inge Brounsa,Luc Van Nassauwa,Jeroen Van Genechtena et al.Triple Immunofluorescence Staining with Antibodies Raised in the Same Species to Study the Complex Innervation Pattern of Intrapulmonary Chemoreceptors. Journal of Histochemistry and Cytochemistry,2002,50:575-582

    [5]Jeremy K. Brown,Alan D. Pemberton,Steven H.Wright et al.Primary Antibody-Fab Fragment Complexes:A Flexible Alternative to Traditional Direct and Indirect Immunolabeling Techniques.Journal ofHistochemistry and Cytochemistry,2004,52(9):1219-1230

    [6]Inge Brouns,Jeroen Van Genechten,Hiroyuki Hayashi,et al.Dual Sensory Innervation of Pulmonary Neuroepithelial Bodies.American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology,2003,28:275-285

    [7]Qing-Shan Xue,Larry Sparks and Wolfgang J Streit.Microglial activation in the hippocampus of hypercholesterolemic rabbits occurs independent of increased amyloid production. J Neuroinflammation. 2007,4:20

    [8]Todd E Anthony,Corinna Klein and Gord Fishel et al.Radial Glia Serve as Neuronal Progenitors in All Regions of the Central Nervous System.Neuron,2004,41(6):881-890

    [9]Magdalena G?tz,Eva Hartfuss and Paolo Malatesta.Radial glial cells as neuronal precursors:a new perspective on the correlation of morphology and lineage restriction in the developing cerebral cortex of mice.Brain research bulletin,2002,57(6):777-788

    [10]Christine Y B,Michael JR,Raymaond PR and et al.Roles of the mammalian subventricular zone in brain development.Progress in Neurobiology,2003,603 1-21

    [11]Andrew C. Vendel,Mark D. Terry and Amelia R.Striegel et al.Alternative Splicing of the Voltage-Gated Ca2+Channelβ4 Subunit Creates a Uniquely Folded N-Terminal Protein Binding Domain with Cell-Specific Expression in the CerebellarCortex. Neuroscience,2006,26(10):2635-2644

    [12]Angelique C.Paulk,James Phillips-Portillo and Andrew M. Dacks et al. The Processing of Color,Motion,and Stimulus Timing Are Anatomically Segregated in the Bumblebee Brain. The Journal of Neuroscience,2008,28(25):6319-6332

    [13]Juan M.Luque,Javier Morante-Oria and Beat M.Riedererb et al.Whole-mount confocal immunofluorescence of mammalian CNS.Brain Research Protocols,2001,6(3):129-133

    [14]R. Dickie,R.M. Bachoo,M.A. Rupnick et al.Three-dimensional visualization of microvessel architecture ofwhole-mounttissueby confocalmicroscopy.Microvascular Research,2006,72(1-2):20-26

    [15]C.W. Jones,D. Smolinski,A. Keogh et al.Confocal laser scanning microscopy in orthopaedic research.Progress in Histochemistry and Cytochemistry,2005,40(1):1-11

    Application of immunofluorescence double stainning technology for embryo brain slices to the study of neurogenesis

    Ao Ran,Wu Meiyan,Zhao Hui,Zhou Li*,Chen Aijun

    (Department ofHistology and Embryology,N ormen Bethune College of J ilin University,Changchun130021,China)

    Objective To establish the double immunofluorescent staining technique for the embryonic brain slices to objectively observe the proliferation,differentiation and migration of neural progenitor cells in rat embryo brains.Methods Rat embryos of 14 days(E14)were fixed by perfusion.The brains were taken and embedded in low-melting agarose,then sliced with a vibratome,stained by double immunofluorescence and observed by using confocal laser scanning microscopy. Results Vimentin and choline acetyltransferase(ChAT)double positive cells showed yellow fluorescence their bodies located in the ventricle zone(VZ),and the radial long processes in the subventricle zone(SVZ).Only ChAT positive cells with red fluorescence were found in the cortex plate of dorsal telencephalon.Conclusion The morphology and identity of neural progenitor cells and neuroblasts are identified by using the technique,and their relationship can be analyzed by double immunofluorescent staining.

    Embryonic brain slice; Immunofluorescence histochemistry; Neurogenesis

    R329

    A

    10.3870/zgzzhx.2011.02.018

    2010-10-10

    2010-11-01

    吉林大學(xué)本科生實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目

    敖然,女(1987年),漢族,七年制學(xué)生。

    *通訊作者(To whom correspondence should be addressed)

    猜你喜歡
    腦片放射狀瓊脂糖
    基于膠原-瓊脂糖的組織工程表皮替代物構(gòu)建研究
    相愛(ài)的日子
    都市(2020年8期)2020-09-06 13:24:35
    水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?
    一大波燒腦片來(lái)襲
    水乳化法制備羅丹明B接枝瓊脂糖熒光微球?
    水晶燈耳飾
    5例乳腺放射狀瘢痕患者的影像學(xué)表現(xiàn)
    瓊脂糖以及高分辨率瓊脂糖制備方法研究進(jìn)展*
    廣州化工(2016年11期)2016-09-02 00:42:59
    不同時(shí)間點(diǎn)的氧糖剝奪對(duì)器官型海馬腦片的影響
    二甲雙胍對(duì)過(guò)氧化氫所致腦片損傷的作用研究*
    88av欧美| 香蕉av资源在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产久久久一区二区三区| 99在线视频只有这里精品首页| 国产黄色小视频在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲国产精品合色在线| 成人欧美大片| 99久久综合精品五月天人人| 午夜免费激情av| 亚洲精品色激情综合| av天堂在线播放| 国产一级毛片七仙女欲春2| 一级毛片高清免费大全| 成人三级做爰电影| 久久亚洲真实| 国产精品日韩av在线免费观看| 一区福利在线观看| 波多野结衣高清无吗| 午夜两性在线视频| 麻豆一二三区av精品| 两个人看的免费小视频| 中出人妻视频一区二区| 禁无遮挡网站| 久久中文字幕一级| 在线免费观看的www视频| 成年女人看的毛片在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 久久精品国产清高在天天线| 不卡一级毛片| 99久久精品一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 成年人黄色毛片网站| 亚洲黑人精品在线| 黄频高清免费视频| 亚洲国产欧美人成| 成人三级黄色视频| av天堂中文字幕网| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品久久久久久久末码| 成在线人永久免费视频| 亚洲av美国av| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产三级中文精品| 999精品在线视频| 小说图片视频综合网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 午夜成年电影在线免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美zozozo另类| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产精品久久久人人做人人爽| 欧美性猛交黑人性爽| 悠悠久久av| 黄色成人免费大全| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美日韩国产亚洲二区| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品一及| 久久中文字幕人妻熟女| 日本 欧美在线| 99在线视频只有这里精品首页| 美女高潮的动态| 欧美国产日韩亚洲一区| 无限看片的www在线观看| 黄色日韩在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 精品国产美女av久久久久小说| 午夜免费观看网址| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产亚洲欧美在线一区二区| 搡老妇女老女人老熟妇| 青草久久国产| 久9热在线精品视频| 久久久色成人| 真人一进一出gif抽搐免费| 久久性视频一级片| 国产亚洲精品久久久com| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲一区高清亚洲精品| xxxwww97欧美| 又爽又黄无遮挡网站| 91麻豆av在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 成人18禁在线播放| 中文字幕久久专区| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 成年版毛片免费区| 欧美日韩精品网址| 1000部很黄的大片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日韩欧美精品v在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久亚洲av毛片大全| 一区二区三区高清视频在线| 成人国产一区最新在线观看| av天堂在线播放| 国产不卡一卡二| 久久天堂一区二区三区四区| 深夜精品福利| 成在线人永久免费视频| www.www免费av| 无人区码免费观看不卡| 1024手机看黄色片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲欧美日韩高清专用| 最近在线观看免费完整版| 国产亚洲精品久久久com| 99在线视频只有这里精品首页| 99热6这里只有精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 又爽又黄无遮挡网站| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 国产精品一及| 岛国视频午夜一区免费看| 香蕉丝袜av| 国产成人影院久久av| 久99久视频精品免费| 成人性生交大片免费视频hd| 国产欧美日韩一区二区精品| 十八禁人妻一区二区| 1024手机看黄色片| 亚洲国产色片| 久久久国产成人免费| 国产亚洲av嫩草精品影院| 免费看十八禁软件| 久久精品91无色码中文字幕| 国产成人av教育| 午夜精品久久久久久毛片777| 一级作爱视频免费观看| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美色欧美亚洲另类二区| 又爽又黄无遮挡网站| 国产成人啪精品午夜网站| 日韩欧美国产在线观看| 天堂网av新在线| 色尼玛亚洲综合影院| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜日韩欧美国产| 日韩国内少妇激情av| 天天一区二区日本电影三级| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 12—13女人毛片做爰片一| 久久欧美精品欧美久久欧美| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产又色又爽无遮挡免费看| 亚洲,欧美精品.| 亚洲熟妇熟女久久| 色在线成人网| 日韩欧美国产一区二区入口| 黄片大片在线免费观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99国产综合亚洲精品| 欧美在线一区亚洲| 亚洲精品久久国产高清桃花| 99久久精品国产亚洲精品| 国产激情久久老熟女| xxx96com| 天堂网av新在线| netflix在线观看网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 精品国产亚洲在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜a级毛片| 1024香蕉在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 18禁美女被吸乳视频| 美女cb高潮喷水在线观看 | 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色av中文字幕| 欧美国产日韩亚洲一区| 丁香六月欧美| 国产精品国产高清国产av| 国产视频一区二区在线看| 99re在线观看精品视频| 1024香蕉在线观看| 午夜福利免费观看在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 在线看三级毛片| 欧美成人免费av一区二区三区| 日本三级黄在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| av福利片在线观看| 国产乱人视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 麻豆国产97在线/欧美| 欧美日韩乱码在线| 日本一二三区视频观看| 91麻豆av在线| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久精品国产综合久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲专区字幕在线| 一二三四在线观看免费中文在| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产精品一区二区三区四区久久| av视频在线观看入口| 午夜福利18| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日韩精品青青久久久久久| 热99在线观看视频| or卡值多少钱| 国产黄色小视频在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲一区高清亚洲精品| 最新美女视频免费是黄的| 国产毛片a区久久久久| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 男插女下体视频免费在线播放| 国产日本99.免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 不卡av一区二区三区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产男靠女视频免费网站| 久久久久久久久久黄片| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品欧美国产一区二区三| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 99热这里只有精品一区 | 国产精品99久久久久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 一进一出抽搐gif免费好疼| 在线视频色国产色| 亚洲av美国av| 亚洲九九香蕉| 99热6这里只有精品| 精品久久久久久久久久免费视频| 午夜日韩欧美国产| 国产午夜福利久久久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av | 在线观看66精品国产| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 1024香蕉在线观看| 欧美zozozo另类| 精品一区二区三区视频在线 | 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲在线自拍视频| 日本熟妇午夜| 999精品在线视频| 午夜a级毛片| 观看美女的网站| 后天国语完整版免费观看| 精品久久蜜臀av无| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品久久久久久久电影 | 亚洲电影在线观看av| 无遮挡黄片免费观看| 中文字幕熟女人妻在线| 亚洲成av人片免费观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品国产高清国产av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 一进一出好大好爽视频| 亚洲国产欧美人成| 男女视频在线观看网站免费| 亚洲成a人片在线一区二区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 小说图片视频综合网站| 一进一出好大好爽视频| 91在线精品国自产拍蜜月 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久久国产成人精品二区| 丁香六月欧美| 亚洲一区二区三区色噜噜| 色综合亚洲欧美另类图片| 岛国在线免费视频观看| 国产美女午夜福利| 真实男女啪啪啪动态图| 91九色精品人成在线观看| 国内精品美女久久久久久| 国产91精品成人一区二区三区| 男女视频在线观看网站免费| 色视频www国产| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久香蕉精品热| 欧美在线黄色| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产精品久久电影中文字幕| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲成人久久性| 在线免费观看的www视频| 欧美在线一区亚洲| 国产单亲对白刺激| 国产亚洲精品一区二区www| 日韩人妻高清精品专区| 男女床上黄色一级片免费看| 18美女黄网站色大片免费观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 天天一区二区日本电影三级| 日本与韩国留学比较| 国产三级黄色录像| 日本一二三区视频观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 不卡av一区二区三区| 午夜福利欧美成人| a级毛片在线看网站| 在线播放国产精品三级| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产男靠女视频免费网站| 国产一区二区激情短视频| 亚洲成人久久爱视频| 99久久精品一区二区三区| 国产99白浆流出| 99热只有精品国产| 男女视频在线观看网站免费| 成年女人毛片免费观看观看9| 一级毛片高清免费大全| 1000部很黄的大片| 欧美性猛交黑人性爽| 日本黄色片子视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 色哟哟哟哟哟哟| 在线免费观看的www视频| 男人的好看免费观看在线视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 亚洲男人的天堂狠狠| 国产毛片a区久久久久| 午夜免费成人在线视频| 一个人免费在线观看电影 | 91字幕亚洲| 淫秽高清视频在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲精品在线美女| 色吧在线观看| 嫩草影院入口| 脱女人内裤的视频| 午夜福利高清视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产精品电影一区二区三区| 国产高清视频在线播放一区| 床上黄色一级片| bbb黄色大片| 欧美乱码精品一区二区三区| 搡老岳熟女国产| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲av电影不卡..在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 两个人视频免费观看高清| 色av中文字幕| 国产精品1区2区在线观看.| 久久久水蜜桃国产精品网| 好男人在线观看高清免费视频| 免费在线观看日本一区| 国产高清视频在线播放一区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 亚洲真实伦在线观看| 一夜夜www| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲精品在线美女| 亚洲国产欧美人成| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美乱码精品一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 一夜夜www| 高清在线国产一区| 久久香蕉精品热| 97超视频在线观看视频| tocl精华| 99久久综合精品五月天人人| 色老头精品视频在线观看| 一a级毛片在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 成年女人看的毛片在线观看| x7x7x7水蜜桃| 国产欧美日韩精品一区二区| av天堂在线播放| 欧美成狂野欧美在线观看| 成年版毛片免费区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 色尼玛亚洲综合影院| 在线视频色国产色| 黄色片一级片一级黄色片| 在线观看免费视频日本深夜| 日本a在线网址| 国产1区2区3区精品| 欧美午夜高清在线| 色综合欧美亚洲国产小说| 婷婷精品国产亚洲av在线| 又大又爽又粗| 看黄色毛片网站| 丰满的人妻完整版| 欧美成人免费av一区二区三区| 97碰自拍视频| 国产亚洲精品久久久com| 欧美日韩精品网址| 免费大片18禁| 午夜日韩欧美国产| 国产精品九九99| 观看免费一级毛片| 亚洲真实伦在线观看| 成人午夜高清在线视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 脱女人内裤的视频| 搡老岳熟女国产| 高清毛片免费观看视频网站| 99热精品在线国产| 一a级毛片在线观看| 国内精品久久久久久久电影| 国内精品美女久久久久久| 性色avwww在线观看| 91九色精品人成在线观看| 他把我摸到了高潮在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 欧美一区二区国产精品久久精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 搡老岳熟女国产| 国产麻豆成人av免费视频| 日本黄大片高清| 日韩高清综合在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品免费一区二区三区在线| 十八禁人妻一区二区| 欧美乱色亚洲激情| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 久久人妻av系列| 亚洲国产精品sss在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 中文亚洲av片在线观看爽| 亚洲黑人精品在线| 欧美乱码精品一区二区三区| 桃红色精品国产亚洲av| 黄片大片在线免费观看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 脱女人内裤的视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 久久久久久大精品| 天堂网av新在线| 久久精品国产清高在天天线| 欧美中文综合在线视频| 波多野结衣高清无吗| 精品一区二区三区视频在线 | 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 免费大片18禁| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲美女视频黄频| 成年免费大片在线观看| 三级国产精品欧美在线观看 | 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 亚洲精品美女久久av网站| 精品无人区乱码1区二区| 99国产精品一区二区三区| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产真实乱freesex| 看黄色毛片网站| 啦啦啦免费观看视频1| 高清毛片免费观看视频网站| 搡老熟女国产l中国老女人| 日韩三级视频一区二区三区| 欧美大码av| 国产主播在线观看一区二区| av国产免费在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 在线观看免费午夜福利视频| 在线国产一区二区在线| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 俺也久久电影网| 波多野结衣巨乳人妻| 巨乳人妻的诱惑在线观看| a级毛片在线看网站| xxx96com| 久久久久亚洲av毛片大全| 嫩草影院入口| 日韩大尺度精品在线看网址| 一区二区三区高清视频在线| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产免费av片在线观看野外av| 99在线视频只有这里精品首页| 国产av麻豆久久久久久久| 久久国产乱子伦精品免费另类| 69av精品久久久久久| 99热这里只有是精品50| ponron亚洲| 免费人成视频x8x8入口观看| 99热精品在线国产| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产私拍福利视频在线观看| bbb黄色大片| 在线a可以看的网站| 黄色视频,在线免费观看| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲精品在线观看二区| 99riav亚洲国产免费| 久久精品国产综合久久久| 91麻豆精品激情在线观看国产| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲电影在线观看av| 黄频高清免费视频| 免费在线观看日本一区| 黄片小视频在线播放| av黄色大香蕉| 国产精品av视频在线免费观看| 在线看三级毛片| 日韩欧美 国产精品| 久9热在线精品视频| 女同久久另类99精品国产91| 国产黄色小视频在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 久久精品综合一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲成人久久性| 99riav亚洲国产免费| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美黑人巨大hd| 一二三四在线观看免费中文在| 成人午夜高清在线视频| 亚洲色图av天堂| a级毛片在线看网站| 国产视频一区二区在线看| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 制服丝袜大香蕉在线| 国产免费男女视频| 欧美成人性av电影在线观看| 国产午夜精品论理片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久热在线av| 久久99热这里只有精品18| 欧美一级毛片孕妇| av天堂在线播放| 在线观看日韩欧美| 国产极品精品免费视频能看的| 免费搜索国产男女视频| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 变态另类丝袜制服| 一本精品99久久精品77| 最新中文字幕久久久久 | 久久久精品大字幕| 91麻豆精品激情在线观看国产| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品亚洲一级av第二区| 一夜夜www| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美三级三区| 亚洲第一电影网av| av欧美777| 精品久久蜜臀av无| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 九九在线视频观看精品| 免费大片18禁| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久精品综合一区二区三区| 中文字幕久久专区| 在线免费观看的www视频| 亚洲第一电影网av| 他把我摸到了高潮在线观看| 成熟少妇高潮喷水视频| 91av网一区二区| 久久久国产成人精品二区| 亚洲美女黄片视频| 久久草成人影院| 美女免费视频网站| 久久久久国产一级毛片高清牌| 神马国产精品三级电影在线观看| 欧美3d第一页| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产单亲对白刺激| 久久人人精品亚洲av| 国产亚洲欧美98| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产成人av教育| 老熟妇仑乱视频hdxx| 免费观看的影片在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 欧美三级亚洲精品| 亚洲精华国产精华精| 黄色成人免费大全| cao死你这个sao货| 国产精品一区二区精品视频观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 免费av不卡在线播放| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 黄色成人免费大全| 免费搜索国产男女视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品一区二区精品视频观看| 一本久久中文字幕| 久久精品91蜜桃| av女优亚洲男人天堂 | 亚洲av第一区精品v没综合| 成人永久免费在线观看视频| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲av熟女|