超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中6種獸藥殘留

隋 濤，付 建，李曉玉，郭海霞，婁喜山

(1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000；2.煙臺杰科檢測服務(wù)有限公司，山東 煙臺 265231)

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水產(chǎn)品中6種獸藥殘留

隋 濤1，付 建2，李曉玉1，郭海霞2，婁喜山2

(1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000；2.煙臺杰科檢測服務(wù)有限公司，山東 煙臺 265231)

采用液液萃取的前處理方式，以超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)檢測水產(chǎn)品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素和吡喹酮的殘留量。水產(chǎn)品經(jīng)過勻質(zhì)，乙腈提取并沉淀蛋白，正己烷去除脂肪，UPLC-MS/MS進行檢測，在6min內(nèi)完成分離。在5～200μg/L范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2在0.9977～0.9999之間，具有良好的線性關(guān)系。6種物質(zhì)的檢測限度均為1.0μg/kg，回收率范圍在61.2%～90.5%之間。本方法操作簡單、靈敏度高，可以滿足水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的的定性定量檢測。

萘啶酸；泰妙菌素；甲氧芐胺嘧啶；二氟沙星；氟甲砜霉素；吡喹酮；超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；多反應(yīng)監(jiān)測

萘啶酸為第一代喹諾酮類抗菌藥物，對大腸埃希菌、克雷伯菌屬、變形桿菌屬、志賀菌屬、沙門菌屬、腸桿菌屬及流感嗜血桿菌的部分菌株具抗菌活性。泰妙菌素是一種雙萜類動物專用抗生素，主要用于防治家畜家禽呼吸系統(tǒng)疾病和動物促生長，是世界十大獸用抗生素之一。甲氧芐胺嘧啶是一種抗菌藥物，抗菌譜與磺胺藥相近，具有抑制二氫葉酸還原酶的作用。二氟沙星是動物用抗菌藥，屬于氟喹諾酮類。氟甲砜霉素是獸用抗菌藥，用于敏感細(xì)菌所致的豬、雞及魚的細(xì)菌性疾病。吡喹酮為一新型廣譜抗寄生蟲藥。結(jié)構(gòu)式見圖1。

韓國國立水產(chǎn)物品質(zhì)檢查院計劃2010年增加針對水產(chǎn)品的檢測項目，新增抗生素類項目12項，其中包括萘啶酸(nalidixic acid)、吡喹酮(praziquantel)、泰妙菌素(tiamulin)、二氟沙星(difloxacin)、甲氧芐胺嘧啶(trimethoprim)、氟甲砜霉素(florfenicol)，在魚類或甲殼類中的限量分別為0.03、0.02、0.1、0.3、0.05、0.1mg/kg。

從目前文獻(xiàn)和資料方法來看，抗生素類檢測方法的對象局限于單類抗生素在一種或多種基質(zhì)中的殘留[1-5]。本實驗研究的6種獸藥檢測方法也多為單一檢測[6-14]，且所用儀器多為液相色譜，定量不夠準(zhǔn)確，靈敏度也不夠高。萘啶酸的檢測尚無相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮5種藥物雖然分別有相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但每個項目均為獨立的前處理方法和儀器檢測方法，不能同時、快速分析檢測。分析時間長，成本高，效率非常低，難以有效地對其出口安全性進行監(jiān)控。因此，建立一種可以同時、快速檢測上述藥物的標(biāo)準(zhǔn)方法對人們的身體健康和出口貿(mào)易都有十分重要的意義。

圖1 6種獸藥的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structures of six veterinary drugs

本實驗旨在建立快速萃取后進樣同時測定水產(chǎn)品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。該法具有可多種獸藥同時分析、操作簡便、測定速度快等優(yōu)點，適應(yīng)目前出口食品的快速通關(guān)檢測工作的需要，也可作為企業(yè)內(nèi)控檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法，從而提高企業(yè)出口產(chǎn)品安全性，降低企業(yè)檢測成本。

1 材料與方法

1.1 試劑

乙腈、甲醇(均為色譜純) 德國默克公司；正己烷、甲酸(均為色譜純) 天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為超純水，乙酸銨為優(yōu)級純。

6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度)：萘啶酸(99.5%)、泰妙菌素(98.5%)、甲氧芐胺嘧啶(99.5%)、二氟沙星(98.4%)、氟甲砜霉素(99.0%)、吡喹酮(99.0%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司。

單標(biāo)儲備液制備：用天平準(zhǔn)確稱取0.0100g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用乙腈配制成100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：準(zhǔn)確移取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于容量瓶中，用乙腈與水混合溶液(4:6，V/V)定容至刻度線，逐級稀釋成2、5、10、25、50、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作混合液，于4℃條件下保存。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀UPLC、Premier四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Waters公司；Rios 8超純水儀 美國Millipore公司；T18均質(zhì)器 德國IKA公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會社；DL-5C離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；孔徑0.22μm 的濾膜。

1.3 樣品處理

稱取5.00g勻質(zhì)后的樣品、5g無水硫酸鈉，置于50mL離心管中，加入20mL乙腈，振蕩提取10min，4000r/min離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至125mL分液漏斗中，殘渣中加入20mL乙腈，再次提取1次，合并上清液至分液漏斗中。向分液漏斗中20mL乙腈飽和的正己烷溶液，混合均勻，靜置分層，分取乙腈層至茄形瓶中。40℃水浴條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入1mL乙腈-水(4:6，V/V)混合溶液和1mL乙腈飽和正己烷，超聲使其完全溶解，將溶液轉(zhuǎn)移至2.0mL小離心管中，12000r/min高速離心10min。吸取下層過0.22μm的濾膜。待檢測。

1.4 超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

1.4.1 色譜條件

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μm)；流動相：甲醇-5mmol/L 乙酸銨溶液(0.1%甲酸)，梯度洗脫程序見表1； 流速：0.25mL/min；柱溫35℃；進樣量：3μL。首先用一個等梯度洗脫程序，觀察每一種化合物出峰的出峰順序，后確定一個較為粗略的梯度洗脫程序，通過不斷優(yōu)化和實驗最終確定一個最佳的梯度洗脫程序。

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源；掃描方式：由于氟甲砜霉素含有電負(fù)性較強的氯基團，因此確定為負(fù)離子掃描，萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、吡喹酮為正離子掃描；正離子模式下毛細(xì)管電壓：3.0kV，負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓為2.6kV；離子源溫度：110℃；脫溶劑溫度：350℃。首先對每一種標(biāo)準(zhǔn)品的單標(biāo)進行蠕動進樣，通過分別界定母離子和子離子的掃描范圍進行全掃描以確定母離子和子離子對的準(zhǔn)確值，然后分別通過改變不同的錐孔電壓和碰撞能值使化合物的出峰靈敏度達(dá)到最高以使錐孔電壓和碰撞能值達(dá)到最優(yōu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜分析與方法定性

分別將6種5mg/L的單獨標(biāo)準(zhǔn)溶液以蠕動泵進樣的方式注入到質(zhì)譜中，萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、吡喹酮在ESI+方式下進行一級質(zhì)譜全掃描分析，可以找到準(zhǔn)確的[M+H]+分子離子峰。氟甲砜霉素在ESI+方式下離子化強度遠(yuǎn)弱于ESI-，因此氟甲砜霉素選擇在ESI-方式下進行MRM分析。用daughterscan 方式對子離子及碰撞能量進行優(yōu)化。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

本研究選用適用于Acquity UPLC的3種專用反相色譜柱，在其他質(zhì)譜與液相條件相同的情況下，比較各色譜柱對6種物質(zhì)的保留情況、靈敏度、峰形等。3種色譜柱規(guī)格為：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column(2.1mm×100mm，1.8μm) (簡寫：T3)；Waters ACQUITY SHIELD RP18 Column(2.1mm×100mm，1.7μm)(簡寫：RP)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18Column (2.1mm×100mm，1.7μm) (簡寫：C18) 。

表2 6種獸藥的UPLC-MS/MS儀器參數(shù)Table 2 LC-ESIMS/MS parameters for 6 veterinary drugs

圖2 6種獸藥不同色譜柱下的色譜圖Fig.2 Chromatographic plots of six veterinary drugs separated by column

從圖2可以看出，RP柱與C18柱的分離度相似，T3柱對甲氧芐胺嘧啶、吡喹酮的保留性要明顯優(yōu)于RP柱和C18柱。靈敏度由大到小排序為：T3＞RP＞C18。所以最終選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column為樣品分析柱。

2.2.2 流動相的選擇

流動相中使用緩沖鹽(乙酸銨)可以增加6種物質(zhì)的保留性；加入適當(dāng)?shù)募姿峥梢源偈够衔镫婋x，提高靈敏度。甲醇與乙腈相比，極性較弱，同樣流動相梯度條件下，使用甲醇時，目標(biāo)物的保留時間靠后；同時甲醇為質(zhì)子化試劑，用甲醇做流動相，目標(biāo)物的離子化程度高，靈敏度相對也高，記過顯示：用甲醇做流動相目標(biāo)物的峰面積是乙腈做流動相時的2倍。因此選擇甲醇-5mmol/L乙酸銨溶液(含體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸)作為流動相。

2.2.3 前處理條件的選擇

本研究旨在快速同時分析這6種物質(zhì)，因此前處理時間也是一個重要的控制點。本研究舍棄了SPE凈化手段，選擇了耗時少、分析成分低的液液萃取凈化方式。用乙腈提取樣本中的目標(biāo)物，同時達(dá)到沉淀蛋白的目的；采用正己烷與乙腈液液分配去除脂肪和脂溶性雜質(zhì)；定容后再用乙腈飽和正己烷去一次油脂，同時12000r/min以上高速離心，去除大分子雜質(zhì)。

實驗結(jié)果表明，定溶液中加入甲酸會影響氟甲砜霉素的靈敏度，響應(yīng)面積約降低1倍，最終定容液未加酸。

2.3 方法性考察

表3 6種獸藥的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear ranges, regression equations and related coefficients for 6 veterinary drugs

6種獸藥線性考察見表3。在6min內(nèi)完成分離。在5～200μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R2在0.9977～0.9999之間，具有良好的線性關(guān)系。

向馬哈魚、鲅魚、海鋪蝦空白樣品中添加3個水平的6種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)方法做回收率實驗。每個添加水平重復(fù)6次，計算添加回收率和結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表4。根據(jù)RSN≥10作為檢出限，6種物質(zhì)的檢測限度均為1.0μg/kg，回收率范圍在61.2%～90.5%之間。

表4 方法的加標(biāo)回收率Table 4 Recovery rates of spiked samples

3 結(jié) 論

本研究采用乙腈提取目標(biāo)物并沉淀蛋白、正己烷去除脂溶性雜質(zhì)，可基本排除水產(chǎn)品基質(zhì)對離子化的影響；采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，靈敏度高、定性定量準(zhǔn)確。與普通液相色譜相比，定性和定量更加準(zhǔn)確，通過不同檢測人員對陽性結(jié)果進行復(fù)檢基本可以排除假陽性的錯誤結(jié)果。而且大大提高了檢測靈敏度，使得檢測結(jié)果由幾十、幾百ng/g甚至μg/g級提高到1.0ng/g，可以更好的應(yīng)對國外的技術(shù)壁壘。另外，超高效液相色譜(UPLC)與高效液相色譜(HPLC)相比由于具有小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等技術(shù)，增加了分析的通量及色譜峰容量，與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。本實驗在5～200 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，6種分析物質(zhì)的檢測限度均為1.0μg/kg，回收率范圍在61.2%～90.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于12.5%。本研究能夠滿足快速同時分析水產(chǎn)品中萘啶酸、泰妙菌素、甲氧芐胺嘧啶、二氟沙星、氟甲砜霉素、吡喹酮檢測的需求。

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Simultaneous Determination of Veterinary Drug Residues in Aquatic Products by UPLC-MS/MS

SUI Tao1，F(xiàn)U Jian2，LI Xiao-yu1，GUO Hai-xia2，LOU Xi-shan2
(1. Yantai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Yantai 264000, China；
2. Yantai Jieke Inspection Service Co. Ltd., Yantai 265231, China)

A method for detecting residues of nalidixic acid, tiamulin, trimethoprim, difloxacin, florfenicol and praziquantel in aquatic products by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)after liquidliquid extraction approach was established. The samples were extracted using acetonitrile as the solvent, purified by hexane and detected by UPLC-MS/MS within 6 minutes. The linear regression coefficients corresponding to 6 spiked levels in the range of 5 to 200 μg/L were between 0.9977 and 0.9999. The detection limit for each of the six substances was 1.0 μg/kg, and their recoveries were in the range of 61.2% to 90.5%. The developed method is simple and sensitive and can meet the requirements for qualitative and quantitative analysis of aquatic products.

nalidixic acid；tiamulin；trimethoprim；difloxacin；florfenicol；praziquantel；ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)；multiple-reaction monitoring (MRM)

O657.63；S859.84

A

1002-6630(2011)10-0203-05

2010-07-15

2010年度山東檢驗檢疫局科研項目(SK201030)

隋濤(1966—)，男，工程師，本科，研究方向為食品中的藥物殘留檢測。E-mail：ytst2009@163.com