響應(yīng)面分析法優(yōu)化龍眼核中多酚物質(zhì)提取工藝

王淑霞，李愛梅，張俊杰，李存芝，歐仕益，張廣文*

(暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化龍眼核中多酚物質(zhì)提取工藝

王淑霞，李愛梅，張俊杰，李存芝，歐仕益，張廣文*

(暨南大學(xué)理工學(xué)院食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632)

目的：利用響應(yīng)面法對龍眼核中多酚物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選取試驗(yàn)因素與水平，根據(jù)Box-Behnken Design(BBD)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因素，以龍眼核多酚物質(zhì)含量為響應(yīng)值作響應(yīng)面和等高線圖。結(jié)果：在分析各個(gè)因素的顯著性和交互作用后，得出龍眼核多酚物質(zhì)浸提的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸提溫度77.4℃、浸提時(shí)間4h、料水比1:20(g/mL)、浸提2次，以焦性沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，龍眼核多酚物質(zhì)一次提取含量可達(dá)21.7079mg/g。結(jié)論：曲面回歸方程與實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合性好，此模型合理可靠，可用于實(shí)際預(yù)測。

龍眼核；多酚物質(zhì)；響應(yīng)面分析

中國龍眼品種資源豐富，主要集中在廣東、廣西、福建、海南等幾個(gè)省份，其中廣東省是我國龍眼生產(chǎn)和消費(fèi)大省[1]，主栽品種為石硤、儲(chǔ)良和古山2號(hào)，其中種植面積最大的石硤，因具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、核肉易分離等優(yōu)點(diǎn)，2006年為農(nóng)業(yè)部主推龍眼品種之一[2]。近年來，廣東龍眼生產(chǎn)成本逐年增加，市場價(jià)格卻持續(xù)低迷，經(jīng)濟(jì)效益日益下降。因此如何提高廣東龍眼產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益促進(jìn)龍眼產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，是當(dāng)前廣東省龍眼產(chǎn)業(yè)的亟待解決的問題。龍眼核系龍眼的種仁，質(zhì)量約占龍眼果實(shí)鮮質(zhì)量的17%，由于沒有進(jìn)行綜合利用，每年廢棄的龍眼核達(dá)幾十萬噸。龍眼核中含有豐富的多酚類物質(zhì)[3-7]，酚類物質(zhì)具有較活潑的羥基氫，能提供氫與自由基反應(yīng)，生成惰性產(chǎn)物或較穩(wěn)定的自由基，從而中斷或減慢自由基參與的連鎖反應(yīng)，因此具有清除自由基的作用，是優(yōu)良的活性氧消除劑和脂質(zhì)抗氧化劑，在人體內(nèi)發(fā)揮很好的生理作用，具有抗脂質(zhì)氧化、延緩機(jī)體衰老、預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病、防癌、抗輻射等生物活性[8-10]。因此開發(fā)利用龍眼核中的多酚物質(zhì)是提高龍眼核經(jīng)濟(jì)效益的有效途徑。本實(shí)驗(yàn)以廣州本地產(chǎn)石硤龍眼的核為原料，對其中起主要抗氧化作用的酚類物質(zhì)進(jìn)行提取，并選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度和時(shí)間三個(gè)因素通過響應(yīng)面分析法(response surfacemethodology，RSM)[12-15]優(yōu)化龍眼核多酚的最佳提取工藝參數(shù)，以期為廣州本地石硤龍眼核的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

石硤龍眼核購于廣東省。無水乙醇(分析純) 天津市化學(xué)試劑一廠。

粉碎機(jī) 廣東省連南微型電機(jī)廠；RE-AAA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海嘉鵬科技有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；Spectrum Lab 53型紫外-可見分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；EL-104電子分析天平 梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；EK-600H電子天平 日本AND公司。

1.2 方法

1.2.1 龍眼多酚提取工藝流程

龍眼核→干燥粉碎→恒溫振蕩提取→抽濾→脫脂→濃縮→定容備用

1.2.2 測定波長的選擇

取標(biāo)準(zhǔn)焦性沒食子酸溶液5mL及空白溶液5mL，各加酒石酸鐵液3.0mL，用磷酸緩沖液定容至10mL并搖勻，10min后在200～800nm波長范圍內(nèi)作光譜掃描；取與對照品濃度相當(dāng)?shù)凝堁酆藰悠芬?，如上同樣?00～800nm波長范圍內(nèi)作光譜掃描。結(jié)合焦性沒食子酸和龍眼核樣品液的掃描光譜圖，選擇合適的測定波長。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.7、1.4、2.1、2.8、3.5mL分別置于編號(hào)0、1、2、3、4、5的10mL容量瓶中，再各加酒石酸鐵液3.0mL，磷酸緩沖液2.0mL，蒸餾水定容后搖勻。10min后，在選定的測定波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性方程。

1.2.4 多酚含量測定

分別精密量取蒸餾水、樣品溶液各1.0mL于編號(hào)0、1、2、3的10mL容量瓶，再各加3mL酒石酸鐵液，后用pH7.5的磷酸緩沖溶液2.0mL，蒸餾水定容后搖勻。10min后在測定波長處測定吸光度。并依據(jù)線性方程求得多酚含量，并求其平均含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測定波長的選擇

圖1 焦性沒食子酸溶液和龍眼核提取物200～800nm光譜掃描Fig.1 Scanning spectra of pyrogallic acid and longan seed extract

由圖1可知，焦性沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和龍眼核提取物在220～260nm(240nm處)處有最大吸收，但其附近尖峰密集，吸光度可能會(huì)受雜質(zhì)干擾；在波長540nm附近吸收峰平滑，不會(huì)有雜質(zhì)干擾，故選540nm作為測定波長。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程：y= 10.402x－0.0156，R2=0.9993?？芍剐詻]食子酸含量和吸光度在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，且相關(guān)性顯著。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對龍眼核多酚含量的影響

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對龍眼核多酚含量的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction rate of polysaccharides from longan seeds

如圖2所示：在溫度60℃、液固比1:20(g/mL)、浸提3h的條件下，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，龍眼核多酚含量呈上升趨勢，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)龍眼核多酚含量最大，之后隨著體積分?jǐn)?shù)的增大，含量反而降低。這可能是因?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)低時(shí)，糖類等水溶性物質(zhì)大量溶出；而乙醇體積分?jǐn)?shù)過高，脂溶性物質(zhì)大量溶出，影響龍眼核多酚的溶出，從而影響龍眼核多酚的含量。綜合以上結(jié)果，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為佳。

2.3.2 浸提溫度對龍眼核多酚含量的影響

圖3 浸提溫度對龍眼核多酚含量的影響Fig.3 Effect of temperature on extraction rate of polysaccharides from longan seeds

如圖3所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液固比1:20、浸提3h的條件下，浸提溫度對浸提效果的影響很大，溫度越高，浸提效果越好，龍眼核提取液多酚含量越高。原因是：多酚物質(zhì)在乙醇水溶液中的溶解度隨著溫度的升高而增大，浸提液中多酚含量也隨之增高；另外，溫度高，則黏度減少，擴(kuò)散系數(shù)增加，使浸提速度加快，浸提量也增加。但到了90℃時(shí)溶液劇烈沸騰，容易引起溶劑的損失，給操作帶來不便，并且溫度過高可能對多酚物質(zhì)的穩(wěn)定性有影響。綜合以上結(jié)果，選擇溫度7 0℃為佳。

2.3.3 浸提時(shí)間對龍眼核多酚含量的影響

圖4 浸提時(shí)間對龍眼核多酚含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from longan seeds

如圖4所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、溫度70℃、液固比1:20的條件下，浸提1～5h內(nèi)龍眼核多酚含量呈上升趨勢，然后隨時(shí)間的延長多酚物質(zhì)含量增加極少。由Fick擴(kuò)散定律可知得率與提取時(shí)間呈正比，在一定條件下，浸提時(shí)間越長得率越高，即龍眼核多酚物質(zhì)含量越高；但時(shí)間太長會(huì)使擴(kuò)散次數(shù)降低，反而影響多酚物質(zhì)的提取，同時(shí)可能是龍眼核經(jīng)粉碎后過40目篩網(wǎng)，顆粒度合適，溶劑易滲入，3h后原料細(xì)胞內(nèi)外濃度已接近達(dá)到平衡，3h后隨著浸提時(shí)間延長，多酚物質(zhì)含量增加不明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇浸提時(shí)間為3h。

2.3.4 液料比對龍眼核多酚提取的影響

圖5 液料比對龍眼核多酚含量的影響Fig.5 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides from longan seeds

如圖5所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、溫度70℃、浸提3h的條件下，龍眼核多酚物質(zhì)含量隨著溶劑量的增加而增加，當(dāng)液料比達(dá)到1:20后，龍眼核多酚物質(zhì)含量的增加不明顯。為降低成本，提高效率，節(jié)約能源，本實(shí)驗(yàn)液料比采用20:1。

2.3.5 浸提次數(shù)對龍眼核多酚提取的影響

圖6 浸提次數(shù)對龍眼核多酚含量的影響Fig.6 Effect of extraction number on extraction rate of polysaccharides from longan seeds

如圖6所示，在乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、溫度70℃、浸提3h、液固比1:20的條件下，第1次浸提就有20.71mg/g的多酚物質(zhì)溶出，并且前兩次提取占4次提取總量的90%，因此從降低成本，提高效率的角度考慮提取兩次為佳。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化龍眼核多酚物質(zhì)提取工藝條件

表1 響應(yīng)面3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in response surface analysis

綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Design Expert 7.0.0軟件，采用Box-Behnken Design建立數(shù)學(xué)模型，以乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、浸提溫度(B)、浸提時(shí)間(C)為自變量，以多酚含量(Y)為因變量共設(shè)立了17個(gè)處理組。因子編碼及水平見表1，由Box-Behnken Design設(shè)計(jì)方案所得的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

2.5 數(shù)學(xué)模型的建立

按照Design Expert軟件中的Box-Behnken Design模型對試驗(yàn)獲得的多酚含量響應(yīng)值進(jìn)行回歸，建立二次回歸模型。初步回歸方程為：

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression equation with polysaccharide yield as a function

對回歸方程進(jìn)行檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9877，P＜0.0001，表明回歸模型顯著，擬合程度好，有實(shí)際應(yīng)用意義。對回歸方程系數(shù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(表3)，表明浸提溫度B及其二次項(xiàng)B2對龍眼核浸提液多酚含量有極顯著影響；乙醇體積分?jǐn)?shù)A、浸提時(shí)間C、乙醇體積分?jǐn)?shù)和浸提溫度的交互項(xiàng)AB對眼核浸提液多酚含量的影響高度顯著；乙醇體積分?jǐn)?shù)的二次項(xiàng)A2、浸提溫度和時(shí)間的交互項(xiàng)BC對眼核浸提液多酚含量的影響顯著；其他變量的影響均不顯著(P＞0.05)。依據(jù)系數(shù)估計(jì)值A(chǔ)=0.24、B=1.00、C=0.31可知因素的主效應(yīng)關(guān)系為浸提溫度＞浸提時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。在α=0.05顯著水平下剔除不顯著項(xiàng)后，對模型(2)進(jìn)行優(yōu)化可得：

2.6 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對各因素所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，圖7為乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、浸提溫度(B)、浸提時(shí)間(C)在其中一個(gè)固定時(shí)，另外兩個(gè)對龍眼核浸提液多酚含量的交互影響曲面圖。比較圖7的曲面圖可知，浸提溫度B對龍眼核浸提液多酚含量的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，而浸提時(shí)間C和乙醇體積分?jǐn)?shù)A次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響最小，可能是多酚物質(zhì)在乙醇-水混合液中溶解性都很好，故乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化對浸提液多酚的含量影響不顯著；比較圖7的等高線圖可以看出浸提溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度和時(shí)間對龍眼核浸提液多酚含量的交互影響最為顯著，表現(xiàn)為等高線最密集，結(jié)果與方差分析相似。

圖7 各兩因素交互作用對龍眼核多酚含量的影響Fig.7 Response surface of the effect of any two factors on extraction rate of polysaccharides from longan seeds

2.7 優(yōu)化與驗(yàn)證

從上述回歸模型中求得最優(yōu)工藝條件為A=0.021、B=1.329、C=0.392，即最佳浸提條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70.00%、浸提溫度77.43℃、浸提時(shí)間4.00h，龍眼核浸提液多酚含量的理論值為21.7328mg/g。由于以上最佳條件未包括在響應(yīng)面優(yōu)化的17組試驗(yàn)中，需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了操作方便，將以上條件修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸提溫度77.4℃、浸提時(shí)間4h。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在最佳提取條件下，龍眼核浸提液多酚含量為21.7079mg/g(RSD=0.32%)與預(yù)測值相差不大，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面法適用于龍眼核多酚物質(zhì)浸提工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

3 結(jié) 論

3.1 利用試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design Expert，采用Box-Behnken Design建立了乙醇體積分?jǐn)?shù)A、浸提溫度B和浸提時(shí)間C與龍眼核浸提液多酚含量之間的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)模型：Y =20.97＋0.24A＋1.00B＋0.31C＋0.32AB＋0.22BC－0.19A2－1.04B2，回歸分析表明，相關(guān)系數(shù)R2=0.9877，P＜0.0001，表明回歸模型顯著，擬合程度好，有實(shí)際應(yīng)用意義；通過模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到因素的主效應(yīng)關(guān)系為：浸提溫度＞浸提時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

3.2 利用模型的響應(yīng)面對影響龍眼核浸提液多酚含量的關(guān)鍵因子及其相互作用進(jìn)行探討，優(yōu)化出龍眼核浸提液多酚浸提工藝的最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸提溫度77.4℃、浸提時(shí)間4h。龍眼核浸提液多酚含量的預(yù)測值為21.7328mg/g，驗(yàn)證值為21.7079mg/g。調(diào)整確定系數(shù)R2=0.9718，證明此模型是合理可靠的，可用于實(shí)際預(yù)測。

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Optimization of Extraction Process for Polysaccharides from Longan Seeds by Response Surface Methodology

WANG Shu-xia，LI Ai-mei，ZHANG Jun-jie，LI Cun-zhi，OU Shi-yi，ZHANG Guang-wen*
(Department of Food Science and Engineering, College of Science and Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China)

Objective: To optimize conditions for the extraction of polysaccharides from longan seeds. Methods: Based on single factor experiments, the optimal conditions for polysaccharide extraction were explored by Box-Behnken design (BBD) in combination with response surface methodology (RSM). Results: The optimal extraction conditions of polysaccharides were ethanol concentration of 70% (V/V), extraction temperature of 77.4 ℃, extraction time of 4 h, solid-to-liquid ratio of 1:20 (g/mL)and extraction number of 2. Temperature was the most important affecting factor of polysaccharide extraction, followed by extraction time and ethanol concentration. Under such extraction conditions, the experimental yield of polysaccharides obtained after the first extraction was up to 21.7079 mg/g, which was close to the model-predicted value. Conclusion: The established regression equation for polysaccharide yield has an excellent goodness of fit. Therefore it is credible and can be used for practical prediction

longan seed；polysaccharides；response surface methodology

TS202.3

A

1002-6630(2011)10-0035-05

2010-07-24

暨南大學(xué)引進(jìn)優(yōu)秀人才科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(51208045)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2007B020712005)

王淑霞(1983—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称诽砑觿-mail：prettysuxia2008@163.com

*通信作者：張廣文(1975—)，男，副教授，博士后，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：zgwzsu@163.com