均勻設計優(yōu)化堿法提取銀杏蛋白工藝

賈韶千，吳彩娥*，范龔健，李婷婷，彭方仁

(南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037)

均勻設計優(yōu)化堿法提取銀杏蛋白工藝

賈韶千，吳彩娥*，范龔健，李婷婷，彭方仁

(南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037)

為提高銀杏蛋白的提取率，通過堿法提取銀杏種仁中的蛋白質(zhì)，以蛋白質(zhì)的提取量為指標，采取混合水平均勻設計研究提取時間、料液比和NaOH溶液質(zhì)量分數(shù)3個因素對銀杏蛋白提取效果的影響，通過二次多項式逐步回歸分析獲得最佳組合。結(jié)果表明：最佳工藝條件為：提取時間12h、料液比1:26、NaOH溶液質(zhì)量分數(shù)0.2%，提取量為99.99mg/g，提取率達到了89.14%。超氧陰離子自由基清除率為38.83%，還原能力A700為0.807，表明堿法提取的銀杏蛋白具有良好的抗氧化性，可進一步加工利用。

均勻設計；提取；銀杏；蛋白

銀杏(Ginkgo biloba L.)為銀杏科銀杏屬多年生落葉喬木，在我國種植相當廣泛，而且品種很多，《中國果樹志·銀杏卷》記載了46個品種[1]。銀杏種仁(俗稱白果)營養(yǎng)豐富，碳水化合物含量約為38.2%、蛋白質(zhì)13%、脂肪2.4%、粗纖維1.2%，此外還含有黃酮類、多糖類、酚類、氨基酸、白果酸、銀杏內(nèi)酯、微量元素等成分[1-3]。銀杏種仁中蛋白質(zhì)以清蛋白和球蛋白為主，而且具有許多功能作用，如抗氧化[4-6]、抑菌[7-8]、抗腫瘤[9]、抗衰老[10]和免疫調(diào)節(jié)[11-12]等。因此，從銀杏種仁中提取蛋白質(zhì)并進一步開發(fā)利用，可以有效利用銀杏資源，帶來更高的產(chǎn)品附加值，從而帶動銀杏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

制備蛋白的方法有堿法制備、酶法制備、以及有機溶劑法制備等。堿法制備得到的蛋白具有良好的起泡性、持水性等功能特性，更適合應用于食品加工中[13]。黃文等[4,8,14]主要研究了白果蛋白的功能性質(zhì)，均未對提取工藝進行研究。李瑩瑩等[15]通過Tris-HCl法對白果蛋白進行提取，得到了Tris-HCl法提取白果蛋白的工藝，但提取率較低，僅為75.01%。因此，通過合理的試驗方法優(yōu)化銀杏蛋白的提取工藝十分必要。

均勻設計是基于試驗點在整個試驗范圍內(nèi)均勻散布的從均勻性角度出發(fā)的一種試驗設計方法，特別適合于多因素、多水平的試驗，其試驗次數(shù)比正交設計明顯減少。均勻設計現(xiàn)已成功應用于國防科技和國民經(jīng)濟的諸多領域，如航天、船舶、化工、電子、機械、建筑、食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等[16-17]。

本實驗將均勻設計應用于堿法提取銀杏種仁蛋白，確定堿法提取銀杏種仁蛋白的最佳工藝。試驗獲得的銀杏蛋白可進一步加工利用，如酶解制得生物活性多肽等，為銀杏的深加工產(chǎn)業(yè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀杏：采自江蘇泰興市，品種為大佛指。

氫氧化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯高鐵、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉等均為分析純。

1.2 儀器與設備

LGJ25冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠；BS 210S型天平 賽多利斯科學儀器有限公司；TU-1800PC型紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；電熱鼓風干燥箱 南京盈鑫實驗儀器有限公司；PB-21型酸度計 北京賽多利斯天平有限公司；2-16K型冷凍高速離心機 德國Sigma公司。

1.3 銀杏蛋白的提取

銀杏種仁經(jīng)過冷凍干燥，粉碎，超臨界CO2流體萃取法脫脂，得到銀杏種仁粉末。分別稱取銀杏粉末15.0g，置于500mL燒杯中，配制不同質(zhì)量分數(shù)的NaOH溶液，按一定的料液比與銀杏種仁粉末混合，置于4℃冰箱中提取，每30min攪拌1次(以保證提取液與物料充分接觸，達到較好的提取效果)。提取完成后，3000r/min離心15min，取上清液，調(diào)整pH值到4.62(等電點)，5000r/min離心20min，沉淀即為銀杏蛋白。

實驗中,節(jié)點數(shù)2、3、4時的平均精度分別為98.82%、90.29%、76.72%,可見,隨著預測節(jié)點數(shù)增多,預測精度降低,預測結(jié)果的穩(wěn)定性也開始下滑.這是因為,當預測的節(jié)點數(shù)增多時,所有節(jié)點組成區(qū)域內(nèi)的鏈路組合數(shù)量呈指數(shù)倍增長,而組合數(shù)越多,使得預測結(jié)果的搜索空間越大,模型越難準確地命中真實的情況,從而導致其預測穩(wěn)定性的下滑;同時,當數(shù)據(jù)集大小有限時,對于每種組合下的輸入數(shù)據(jù)就會更少,即每種標簽下對應的訓練樣本變少,使得各標簽的訓練過程不充分,模型出現(xiàn)欠擬合現(xiàn)象,從而導致其預測精度變低.

1.4 均勻試驗設計

試驗選取料液比、提取時間和NaOH溶液質(zhì)量分數(shù)3個因素，采用U12(122×6)均勻設計試驗法，對銀杏蛋白的最佳提取工藝進行優(yōu)化。

1.5 驗證實驗

通過回歸方程分析，得出最佳的工藝條件，根據(jù)最優(yōu)條件進行實驗，重復3次，實驗結(jié)果與最佳理論值進行對比。

1.6 蛋白質(zhì)含量的測定

微量凱氏定氮法[18]，用于測定試驗原料的總蛋白質(zhì)含量。

考馬斯亮藍法[19]：牛血清蛋白為標準蛋白，考馬斯亮藍G250染色，做標準曲線方程為Y=7.8286X＋0.0119，R2=0.9991。

1.7 蛋白質(zhì)活性驗證

采用超氧陰離子自由基清除率[20]和還原能力[21]測定蛋白質(zhì)的抗氧化性，以Tris-HCl法[18]提取的蛋白質(zhì)做對照。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用DPS統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻設計對提取工藝的優(yōu)化

以蛋白提取量為指標進行均勻試驗設計，蛋白提取量為每克銀杏種仁粉末提取所得到的蛋白質(zhì)質(zhì)量。堿法提取銀杏蛋白的均勻試驗結(jié)果見表1。

表1 U12(122×6)均勻試驗設計與結(jié)果(CD2=0.1604)Table 1 Uniform design matrix and experimental results

通過DPS軟件建立多元回歸模型，采用二次多項式逐步回歸，獲得提取銀杏蛋白的回歸方程：Y=20.880＋2.423X2＋16.293X3－1.573X32＋0.199X1X2－0.312X1X3。

回歸方程相關系數(shù)R=0.974，F(xiàn)=22.087(P=0.0008＜0.01)；Durbin-Watson統(tǒng)計量d為2.061，接近2。對回歸方程各因素進行通徑分析，決定系數(shù)為0.948、剩余通徑系數(shù)為0.227，說明通徑分析成立。綜合分析結(jié)果表明上述回歸方程可以反映多元線性回歸模型，回歸分析有效。

表2 各因素的顯著性檢驗Table 2 Significance of each variable term in the fitted regression equation for the yield of protein extract

從回歸方程可以看出，X1項未被選入方程，說明該因素(提取時間)對蛋白的提取量無顯著性影響。表2的顯著水平檢驗表明X2(料液比)、X3(NaOH溶液質(zhì)量分數(shù))兩個因素對蛋白的提取量影響顯著，且料液比的影響大于NaOH溶液質(zhì)量分數(shù)。提取時間和料液比的交互影響達到了顯著水平，提取時間和NaOH溶液質(zhì)量分數(shù)之間也存在交互作用，但影響不顯著。

2.2 最佳提取條件的驗證

通過回歸方程模擬，獲得堿法提取銀杏蛋白的最佳理論組合為X1=9、X2=12、X3=4.034，即提取時間12h、料液比1:26、NaOH溶液質(zhì)量分數(shù)0.2%。在此工藝條件下，銀杏蛋白提取量為103.61mg/g。

為進一步驗證最佳理論組合的有效性，根據(jù)優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取銀杏蛋白，實驗重復3次，蛋白提取量為99.99mg/g，提取率達到了89.14%。結(jié)果與回歸方程計算結(jié)果相近，且高于均勻設計各組合。試驗結(jié)果說明由均勻設計經(jīng)多元回歸分析所獲得的最佳理論組合可以應用于堿法提取銀杏蛋白。

2.3 蛋白質(zhì)活性驗證

分別采用堿法和Tris-HCl法[18]從銀杏種仁中提取蛋白，通過清除超氧陰離子自由基和還原能力測定比較這兩種方法所提取蛋白的抗氧化性，結(jié)果見圖1、2。從圖1、2可以看出，堿法提取的蛋白清除超氧陰離子的能力略高于Tris-HCl法，但還原能力卻略低于Tris-HCl法，兩種方法提取的銀杏蛋白的抗氧化性沒有顯著性差異。

圖1 清除超氧陰離子自由基活性比較Fig.1 Comparison of superoxide anion scavenging activity of G. biloba L. seed proteins extracted by the method and Tris-HCl

圖2 還原能力比較Fig.2 Comparison of reducing power of G. biloba L. seed proteins extracted the method and Tris-HCl

3 結(jié) 論

采用U12(122×6)均勻設計表，用12次試驗對2個因素的12個水平和1個因素的6個水平進行考察，最終通過二次多項式逐步回歸分析得到了最佳的工藝參數(shù)。試驗確定的堿法提取銀杏蛋白的最佳工藝為提取時間12h、料液比1:26、NaOH溶液質(zhì)量分數(shù)0.2%，在此條件下，蛋白質(zhì)的提取量為99.99mg/g，提取率達到了89.14%。堿法提取的銀杏蛋白保留了良好的抗氧化性，為進一步酶解制備銀杏抗氧化肽提供了實驗基礎。

[1] 曹福亮. 中國銀杏志[M]. 北京: 中國林業(yè)出版社, 2007.

[2] 王琴, 溫其標. 銀杏種仁中活性成分及其藥理作用的研究進展[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2006, 22(1): 164-167.

[3] SMITH V J, LUO Y. Studies on molecular mechanisms of Ginkgo biloba extract[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64(3): 465-472.

[4] 黃文, 謝筆鈞, 王益, 等. 白果蛋白質(zhì)的分離, 純化理化特性及其抗氧化活性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學, 2004, 37(10): 1537-1543.

[5] HUANG Wen, DENG Qianchun, XIE Bijun. Purification and characterization of an antioxidant protein from Ginkgo biloba seeds[J]. Food Research International, 2010, 43(1): 86-94.

[6] 黃文, 謝筆鈞, 姚平, 等. 白果活性蛋白的抗生物氧化作用研究[J].營養(yǎng)學報, 2002, 24(2): 192-194.

[7] 牛衛(wèi)寧, 郭藹光. 銀杏種仁中抗菌蛋白的純化及性質(zhì)[J]. 西北植物學報, 2003, 23(9): 1545-1549.

[8] 黃小炯, 區(qū)子弁, 王琴. 銀杏抗菌蛋白的提取及其抗菌性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(10): 139-145.

[9] 鄧乾春, 黃文, 謝筆鈞. 白果清蛋白抑制腫瘤活性及其機制的初步研究[J]．營養(yǎng)學報, 2006, 28(3): 259-262．

[10] 鄧乾春, 汪蘭, 吳佳, 等. 一種白果清蛋白的抗衰老活性研究[J]. 中國藥理學通報, 2006, 22(3): 352-357.

[11] 鄧乾春, 段會軻, 謝筆鈞, 等. 白果清蛋白對免疫功能低下小鼠的調(diào)節(jié)作用[J]. 食品科學, 2006, 27(6): 195-199.

[12] 鄧乾春, 唐瑛, 黃文, 等. 白果清蛋白的免疫調(diào)節(jié)活性研究[J]. 食品科學, 2006, 27(3): 219-223.

[13] 孫雁, 任發(fā)政, 范金波, 等．堿法制備蠶蛹蛋白浸提條件的優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)工程學報, 2009, 25(2): 285-289.

[14] DENG Qianchun, WANG Lan, WEI Fang, et al. Functional properties of protein isolates,globulin and albumin extracted from Ginkgo biloba seeds[J]. Food Chemistry, 2011, 124(4): 1458-1465.

[15] 李瑩瑩, 吳彩娥, 楊劍婷, 等. 白果蛋白質(zhì)提取及SDS-PAGE分析[J].食品科學, 2010, 31(22): 36-40.

[16] 方開泰, 王元. 數(shù)論方法在統(tǒng)計中的應用[M]. 北京: 科學出版社, 1996:5-36.

[17] 方開泰. 均勻設計與均勻設計表[M]. 北京: 科學出版社, 1994: 1-30.

[18] GB/T 5009.5—2003 食品中蛋白質(zhì)的測定[S].

[19] BRADFORD M M. A rapaid and sensitive method for the quantitation of microgram quatities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Ana Biochem, 1976, 72(1/2): 248-254.

[20] 李艷紅. 鷹嘴豆蛋白酶解物的制備及其抗抗氧化肽的研究[D]. 無錫:江南大學, 2008.

[21] ZHU Kexue, ZHOU Huiming, QIAN Haifeng, et al. Antioxidant and free radical-scavenging activities of wheat germ protein hydrolysates (WGPH)prepared with alcalase[J]. Process Biochem. 2006, 41(6): 1296-1302.

Uniform Design Optimization of Alkali Extraction of Protein from Ginkgo biloba L. Seeds

JIA Shao-qian，WU Cai-e*，F(xiàn)AN Gong-jian，LI Ting-ting，PENG Fang-ren
(College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

In order to maximize protein extraction from Ginkgo biloba L. seeds with NaOH solution, a mixed-level uniform design was employed to investigate the effects of time, solid-to-liquid ratio and NaOH concentration on the yield of protein extract. Through quadratic polynomial stepwise regression analysis, the optimum extraction conditions were determined as follows: extraction time 12 h, solid-to-liquid ratio 1:26, NaOH concentration 0.2%. Under such conditions, the yield of protein extract obtained from Ginkgo biloba L. seeds was 99.99 mg/g, and the recovery of protein was 89.14%. The extract obtained showed a superoxide anion free radical scavenging rate of 38.83% and a reducing power A700 of 0.807, thereby having excellent antioxidant effect and being worth further processing and utilizing.

uniform design；extraction；Ginkgo biloba L.；protein

S664.3；TS255.6

A

1002-6630(2011)10-0018-03

2010-10-28

教育部博士點基金項目(200802980004)；國家自然科學基金項目(30872055)；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計劃項目(CX10B_244Z)

賈韶千(1983—)，男，博士，研究方向為林產(chǎn)食品資源加工與利用。E-mail：qian12358@163.com

*通信作者：吳彩娥(1963—)，女，教授，博士，研究方向為食品活性物質(zhì)分離純化。E-mail：sxwucaie@163.com