米渣谷蛋白卡拉膠糖基化改性及功能性質(zhì)

杜研學(xué)，史蘇華，熊 華*，蔣 巖，張 忠，李 捷

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

米渣谷蛋白卡拉膠糖基化改性及功能性質(zhì)

杜研學(xué)，史蘇華，熊 華*，蔣 巖，張 忠，李 捷

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

采用干法美拉德反應(yīng)，對米渣谷蛋白進行糖基化改性，考察谷蛋白-卡拉膠的質(zhì)量比和反應(yīng)時間對接枝反應(yīng)進程和接枝產(chǎn)物功能性質(zhì)的影響，并對最佳工藝共價接枝產(chǎn)物的溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性進行研究。結(jié)果表明：在谷蛋白-卡拉膠的質(zhì)量比1:2、相對濕度79%、溫度60℃條件下，反應(yīng)24h，產(chǎn)物接枝度達到28.84%；相比谷蛋白，接枝產(chǎn)物溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了2.04、4.84倍和0.63倍。經(jīng)糖基化改性后的米渣谷蛋白表面疏水性顯著降低，功能性質(zhì)在廣泛pH值范圍內(nèi)也得到顯著改善。

米渣谷蛋白；卡拉膠；溶解性；乳化性

米蛋白中75%～90%是谷蛋白，其氨基酸組成與大米蛋白基本一致。米谷蛋白的氨基酸組成平衡合理，接近FAO/WHO所推薦的營養(yǎng)配比模式。米谷蛋白中第一限制性氨基酸賴氨酸含量高于其他谷類，精氨酸含量也較高，是其他植物蛋白甚至很多動物蛋白無法比擬的[1]。大米低過敏，是唯一可免于過敏試驗的谷物[2]；米谷蛋白可以作為一種低抗原性蛋白資源，特別適合作為混合飲料、布丁、冰淇淋等食品的添加劑。盡管米谷蛋白的市場應(yīng)用前景廣泛，但它的高疏水性、低溶解性限制其在食品中的應(yīng)用，米谷蛋白的改性研究也越來越被重視。

蛋白質(zhì)與多糖的接枝改性近年來受到越來越多的關(guān)注，蛋白質(zhì)經(jīng)接枝改性后的功能性(如水溶性、乳化性)等有較大的改善，是目前蛋白改性中比較理想的方法之一[3-6]。目前，對米蛋白糖基化改性的報道較少，且較單一。研究顯示米蛋白經(jīng)美拉德接枝改性后功能性質(zhì)均得到不同程度提高[7-10]。卡拉膠是一種應(yīng)用廣泛的親水性膠體，在食品工業(yè)中常被用作乳化劑和穩(wěn)定劑等，適合制備乳化性蛋白接枝物。但是關(guān)于米渣谷蛋白-卡拉膠的接枝改性研究較少，對其接枝產(chǎn)物功能性質(zhì)的研究鮮有報道。本實驗采用卡拉膠對米渣谷蛋白進行接枝改性，在干熱條件下，利用美拉德反應(yīng)制備谷蛋白-卡拉膠共價接枝物，研究蛋白和糖的配比以及反應(yīng)時間對接枝物的接枝度、溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，確定最優(yōu)工藝，探討pH值對共價接枝物的溶解性和乳化性等功能性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米渣 江西省恒天實業(yè)有限公司；卡拉膠 天津光復(fù)精細化工有限公司；α-淀粉酶 諾維信酶制劑有限公司；大豆油 市售；鄰苯二甲醛、1-苯胺基萘-8-磺酸(ANS) 美國Sigma公司；硼砂、甲醇、賴氨酸、β-巰基乙醇、十二烷基硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、考馬斯亮藍等(均為分析純) 天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

RH basic 1型磁力攪拌器 德國IKA公司；LXJ-IIB離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；新世紀T6紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；KDY-9820凱氏定氮儀 廈門精藝興業(yè)科技有限公司；SPX-250微電腦人工氣候箱 上海博迅實業(yè)有限公司；QZP-8型噴霧干燥塔 無錫林洲干燥機廠。

1.3 方法

1.3.1 米渣谷蛋白的制備及純化

稱取150g脫脂米渣以液固比(10mL/g)于0.1mol/L NaOH溶液中，并置于50℃水浴中浸提1h，將浸提液在4800r/min離心分離10min，沉淀按上述方法重復(fù)提取2次，合并3次上清液，得到米渣谷蛋白粗提液。將米渣谷蛋白粗提液于水浴鍋中保溫至65℃，調(diào)pH值至6.3 (淀粉酶生產(chǎn)廠家推薦的最佳值)。加入0.25mg/mLα-淀粉酶，水解3h后調(diào)pH4.8進行酸沉，將沉淀分別用5% NaCl溶液、70%乙醇溶液和蒸餾水洗滌3次，除去堿提過程中提取出的球蛋白、醇溶蛋白、清蛋白以及殘留的無機鹽。再用0.1mol/L NaOH溶液調(diào)pH值至中性，然后進行冷凍干燥，最后得米渣谷蛋白粉。采用全自動凱氏定氮儀測得谷蛋白粉的蛋白含量為90.53%。

1.3.2 米渣谷蛋白-卡拉膠共價復(fù)合物的制備工藝

稱取一定質(zhì)量比例的米渣谷蛋白和卡拉膠，考察谷蛋白與卡拉膠以不同質(zhì)量比(1:3、1:2、1:1、2:1、3:1)，反應(yīng)不同時間(0、6、12、24、36h)對接枝反應(yīng)的影響。兩者溶于去離子水中，調(diào)節(jié)pH8.5，配成蛋白質(zhì)量濃度為20mg/mL的懸浮液，攪拌30min。

將米渣谷蛋白和卡拉膠的混合溶液進行噴霧干燥，將得到的樣品置入一容器中，然后保存在恒溫恒濕箱中反應(yīng)，參照Kato等[11]的干熱反應(yīng)方法。反應(yīng)條件控制為溫度60℃、相對濕度79%。在不同反應(yīng)時間分別取樣，測定共價復(fù)合物的性質(zhì)。

1.3.3 共價接枝物接枝度的測定

采用OPA法[12]。準確稱量40mg OPA溶解于1mL甲醇中，分別加入2.5mL 質(zhì)量分數(shù)20%的SDS、25mL 0.1mol/L硼砂及100μLβ-巰基乙醇，最后用蒸餾水定容至50mL，此為OPA試劑，每次使用前即時配制。測定時，取4mL OPA試劑于試管中，注入200μL樣品液(5mg/mL)，混勻后于35℃反應(yīng)2min，在340nm測其吸光度A340，以在OPA試劑中加入200μL水為空白。接枝度(degree of graft，DG)計算公式：

式中：C0為未反應(yīng)時蛋白質(zhì)自由氨基總量；Ct為反應(yīng)t時刻蛋白質(zhì)自由氨基的含量。

1.3.4 米渣谷蛋白及共價接枝物溶解性的測定

稱取一定質(zhì)量的樣品于去離子水中，配制成蛋白質(zhì)量濃度1mg/mL溶液，在常溫攪拌1h后，在4800r/min離心10min，收集上清液，用考馬斯亮藍法測定其中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以谷蛋白的氮溶解指數(shù)(nitrogen soluble index，NSI)表示蛋白質(zhì)的溶解度。

1.3.5 米渣谷蛋白及共價接枝物乳化性的測定

稱取一定量共價接枝物，溶解到于去離子水中，配成蛋白質(zhì)量濃度1mg/mL的溶液。在常溫攪拌1h后，取9mL蛋白溶液與1mL大豆油混合，放入40mL離心管中。機械乳化機12000r/min乳化1min，將乳化液迅速倒入25mL小燒杯中，取樣點固定在離燒杯底部0.5cm處，取50μL的乳化液與5mL 0.1% SDS混合，在500nm處測定，用0.1% SDS做空白對照[13]。以乳化活力指數(shù)(emulsification activity index，EAI)表示谷蛋白乳化活性：

式中：D為稀釋倍數(shù)；C為乳化液形成前蛋白質(zhì)水溶液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度；θ為乳化液中油的體積分數(shù)。

乳化穩(wěn)定性用乳化穩(wěn)定指數(shù)(emulsifying stability index，ESI)表示如下：

式中：A0為0min時取樣測定的吸光度；Δt為10min；A10為靜置10min后重新取樣測定的吸光度。

1.3.6 最優(yōu)工藝共價接枝物的制備與純化

以最優(yōu)質(zhì)量比稱取米渣谷蛋白和卡拉膠制備共價接枝物，后續(xù)方法同1.3.2節(jié)。采用超濾法對接枝物進行純化，由于卡拉膠的的分子質(zhì)量約為200kD，故選擇分子質(zhì)量為200kD的超濾膜進行超濾，收集濃縮物并進行冷凍干燥。

1.3.7 表面疏水性測定

采用熒光探針劑ANS法[14]。將樣品用0.01mol/L、pH8.5磷酸緩沖液稀釋至0.002%、0.004%、0.008%、0.016%，取20μL 1-苯胺基-8-萘磺酸(1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid，ANS)溶液(8mmol/L ANS 溶于0.01mol/L磷酸鹽緩沖液)加入至4mL蛋白溶液中，立即漩渦混勻，在熒光分光光度計中于390nm激發(fā)470nm檢測發(fā)射熒光強度，用熒光強度對蛋白溶液質(zhì)量濃度作圖并進行線性回歸，以線性回歸斜率作為表面疏水性的指標。

1.3.8 pH值對最優(yōu)工藝共價接枝物功能性質(zhì)的影響

1.3.8.1 pH值對接枝物溶解性的影響

測定方法同1.3.4節(jié)。將樣品溶于去離子水中，用0.1mol/L HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為3、4、5、6、7、8、9、10，4800r/min離心10min，收集上清液，測定其溶解性隨pH值的變化。

1.3.8.2 pH值對接枝物乳化性能的影響

測定方法同1.3.5節(jié)。將樣品溶于去離子水中，用0.1mol/L HCl溶液或NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為3、4、5、6、7、8、9、10，常溫攪拌1h后，測定其乳化性及乳化穩(wěn)定性隨pH值的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷蛋白與卡拉膠的糖基化反應(yīng)

2.1.1 糖基化反應(yīng)對接枝度的影響

G.谷蛋白；C.卡拉膠。下同。

由圖1可知，隨著卡拉膠與谷蛋白接枝反應(yīng)時間的增長，其產(chǎn)物的接枝度均增大，且谷蛋白與卡拉膠的質(zhì)量比越小，接枝反應(yīng)的速率越快。質(zhì)量比為1:3的卡拉膠與谷蛋白在反應(yīng)前期，接枝度快速增大，反應(yīng)12h，接枝度即達到21%，隨著反應(yīng)的進行，反應(yīng)速率放緩，接枝度平穩(wěn)增大，當反應(yīng)進行72h之后，接枝反應(yīng)進入后期，產(chǎn)物的接枝度不再增加。而隨著谷蛋白與卡拉膠質(zhì)量比的提高，反應(yīng)物的羰基減少，接枝反應(yīng)較為緩慢，質(zhì)量比3:1的谷蛋白與卡拉膠在反應(yīng)96h，接枝度才達到42%。

2.1.2 糖基化反應(yīng)對接枝物溶解性的影響

圖2 不同反應(yīng)時間下谷蛋白-卡拉膠接枝物的溶解性變化Fig.2 Effect of reaction time and RDG-to-Car ratio on solubility of glutelin-carrageenan conjugates

如圖2所示，隨著反應(yīng)的進行，接枝產(chǎn)物的溶解度呈現(xiàn)下降趨勢，但不同糖配比的接枝產(chǎn)物的溶解性均優(yōu)于未接枝的谷蛋白，質(zhì)量比為1:2和1:3的谷蛋白與卡拉膠反應(yīng)12h的接枝產(chǎn)物的溶解度是谷蛋白的4倍多。但谷蛋白與卡拉膠的混合物的溶解性均優(yōu)于接枝產(chǎn)物的溶解性，因為卡拉膠作為一種陰離子多糖，當?shù)鞍踪|(zhì)也帶凈的負電荷時，卡拉膠能與蛋白質(zhì)分子片段上帶正電荷的區(qū)域發(fā)生靜電吸引，形成可溶性復(fù)合物，所以在接枝前，卡拉膠的加入顯著提高了谷蛋白的溶解性，且卡拉膠添加量越大，對谷蛋白溶解性的改善也越大。谷蛋白與卡拉膠在60℃干熱條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)，其溶解性反而下降的原因可能是由于糖基引起的主要構(gòu)象的改變導(dǎo)致溶解性的下降。

2.1.3 糖基化反應(yīng)對接枝物乳化性能的影響

研究表明，不同的蛋白與多糖的質(zhì)量配比進行糖基化反應(yīng)，會影響到接枝物產(chǎn)物的乳化性能：穆利霞等[15]將大豆分離蛋白與阿拉伯膠以1:2、1:1、2:1等配比進行接枝反應(yīng)，當大豆分離蛋白與阿拉伯膠配比為1:2時，接枝物乳化活性最高，而在大豆分離蛋白與阿拉伯膠質(zhì)量比2:1、反應(yīng)時間16h條件下大豆分離蛋白-阿拉伯膠接枝物的乳化穩(wěn)定性達到最大。

圖3 谷蛋白與卡拉膠質(zhì)量比及反應(yīng)時間對接枝物乳化性(A)和乳化穩(wěn)定性(B)的影響Fig.3 Effect of reaction time and RDG-to-Car ratio on emulsification activity and stability index of glutelin-carrageenan conjugates

從圖3可以看出，在反應(yīng)初期，隨著谷蛋白與卡拉膠的質(zhì)量比降低，即卡拉膠含量增加，乳化活性和乳化穩(wěn)定性均得到顯著提高。谷蛋白與卡拉膠通過美拉德反應(yīng)共價結(jié)合后，親水基團的接入使得谷蛋白可以更有效地吸附到油-水界面，降低界面張力，提高乳化活性，谷蛋白與卡拉膠以1:3的質(zhì)量比反應(yīng)24h的乳化活性最高，達到22.19m2/g；當反應(yīng)進行到后期，接枝度的增大，更多親水基團的接入反而會破壞油-水界面的平衡，導(dǎo)致乳化活性和乳化穩(wěn)定性的降低。谷蛋白與卡拉膠的結(jié)合，也使得界面蛋白膜加厚，其乳化穩(wěn)定性也大大提高，但繼續(xù)增加卡拉膠，過量的未與谷蛋白共價交聯(lián)的卡拉膠也會因滲透壓的差異造成乳液的排斥絮凝[16]，從而破壞蛋白質(zhì)的乳化穩(wěn)定性，故當?shù)鞍着c卡拉膠的質(zhì)量比為1:1時，反應(yīng)12h的接枝產(chǎn)物乳化穩(wěn)定性達到最大，為134.76min。

但考慮到成本，且過多的卡拉膠會增加乳液的黏度，不利于食品中的應(yīng)用，蛋白與卡拉膠以1:2的質(zhì)量比反應(yīng)24h的接枝物也有較高的乳化活性，ESI達到19.28m2/g，乳化穩(wěn)定性雖不及質(zhì)量比1:1的接枝產(chǎn)物，但也優(yōu)于谷蛋白，EAI為59.79min。相比谷蛋白，乳化活性及乳化穩(wěn)定性分別提高了4.84倍和63.39%。

2.2 表面疏水性分析

從圖4結(jié)果可知，米渣谷蛋白的表面疏水性很高，表面疏水性指數(shù)達到1627，高疏水性限制了米渣谷蛋白的溶解性，也限制了它在食品中的應(yīng)用。當具有多羥基的卡拉膠與米渣谷蛋白發(fā)生共價交聯(lián)，表面疏水性降低了66.5%。隨著卡拉膠接枝到米渣谷蛋白上，谷蛋白的表面疏水性降低，整個體系的親水性增強，米渣谷蛋白更易于在體系中分散，故糖基化改性能改善米渣谷蛋白的溶解性。較大的溶解性不僅有利于蛋白質(zhì)在水相中的分散，也有利于蛋白質(zhì)分子向氣-水或油-水界面的擴散，故也有利于其他功能性質(zhì)的改善，如乳化性質(zhì)[17]。

圖4 米渣谷蛋白及谷蛋白-卡拉膠接枝物的表面疏水性Fig.4 Surface hydrophobicity of glutelin and glutelin-carrageenan conjugates

2.3 pH值對谷蛋白-卡拉膠共價接枝物的功能性質(zhì)的影響

圖5 不同pH值條件下谷蛋白與谷蛋白-卡拉膠共價接枝物的溶解(A)、乳化(B)和穩(wěn)定(C)性質(zhì)Fig.5 Effect of pH on solubility, emulsification activity and stability index of glutelin and glutelin-carrageenan conjugates

蛋白質(zhì)隨著pH值的變化，表面的帶電情況及溶解度隨之變化，乳化與乳化穩(wěn)定性同樣也發(fā)生變化。米渣谷蛋白及其與卡拉膠共價接枝物的功能性質(zhì)(溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性)見圖5。

由圖5A可知，谷蛋白及共價接枝物的溶解度均在pH5.0(等電點附近)時最小，在低于或高于pH5.0時，蛋白質(zhì)分別帶凈的正電荷和凈的負電荷，帶電氨基酸殘基的靜電推斥和水合作用促進了蛋白質(zhì)溶解，溶解度增加，且堿性條件下的溶解度明顯高于酸性條件下的溶解度。但谷蛋白經(jīng)糖基化改性后，溶解性明顯得到改善，谷蛋白在pH7.0的NSI僅為7.59%，而谷蛋白-卡拉膠共價接枝物的NSI提高至61.57%，當pH值增至9.0時，接枝物幾乎全溶。隨著具有親水性羥基的多糖鏈的接入，一方面促進了蛋白質(zhì)的水合作用，另一方面也抑制了蛋白質(zhì)相互間的疏水作用。

通常蛋白質(zhì)乳化性或乳化穩(wěn)定性和溶解度呈正相關(guān)[18]，同樣米渣谷蛋白及接枝物乳化性及乳化穩(wěn)定性變化趨勢與溶解性有相似之處，圖5B、5C顯示，在pH5.0處，乳化活力最小且乳化穩(wěn)定性也最低。這是因為在等電點附近，蛋白質(zhì)溶解度最低，吸附在油-水界面的蛋白質(zhì)減少，界面面積小[19]；且在等電點處，蛋白質(zhì)表面凈電荷為零，蛋白質(zhì)的親水性降低，因而導(dǎo)致其乳化活力及乳化穩(wěn)定性在該點時最低；而隨著pH值高于或低于5.0，蛋白質(zhì)溶解度增大，更多的蛋白質(zhì)移動到油-水界面，溶液界面蛋白膜加厚，使得蛋白質(zhì)的乳化性增大，同時當pH值遠離等電點，蛋白質(zhì)的凈電荷增多，增加了分子間的靜電斥力，使離散雙電層加厚，避免了液滴的聚集，因此乳化穩(wěn)定性能得到提高。同時谷蛋白與卡拉膠發(fā)生美拉德接枝反應(yīng)后，一方面提高了谷蛋白的溶解性，從而大大提高了接枝產(chǎn)物的乳化性；另一方面谷蛋白與卡拉膠的結(jié)合，使得界面蛋白膜加厚，其乳化穩(wěn)定性也顯著提高。

3 結(jié) 論

研究蛋白-多糖質(zhì)量比、反應(yīng)時間等因素對米渣谷蛋白-卡拉膠干熱接枝反應(yīng)的進程及接枝產(chǎn)物功能性質(zhì)的影響，并從多方面因素考慮，確定最佳的反應(yīng)條件為谷蛋白-卡拉膠質(zhì)量比1:2、相對濕度79%、60℃干熱反應(yīng)24h，此條件下，接枝產(chǎn)物接枝度達到28.84%，相比谷蛋白，在去離子水中的溶解性、乳化性和乳化穩(wěn)定性分別提高了2.04、4.84倍和0.63倍。米渣谷蛋白經(jīng)糖基化改性后，其與卡拉膠共價接枝產(chǎn)物在廣泛pH值范圍內(nèi)的功能性質(zhì)得到顯著改善。采用ANS熒光探針法測定米渣谷蛋白及谷蛋白-卡拉膠接枝物的表面疏水性，結(jié)果表明，糖基化改性顯著降低了谷蛋白的表面疏水性。

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Glycosylation of Rice Dregs Glutelin and Functional Properties of Glutelin-Carrageenan Conjugates

DU Yan-xue，SHI Su-hua，XIONG Hua*，JIANG Yan，ZHANG Zhong，LI Jie
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Rice dregs glutelin (RDG) was glycosylated with carrageenan (Car) by dry-heated Maillard reaction. The effects of mass ratio of RDG to Car and reaction time on degree of graft reaction and functional properties of RDG-Car conjugates were investigated. The results showed that the degree of graft reaction was 28.84% under the optimal conditions: RDG-to-Car mass ratio 1:2, temperature 60 ℃, relative humidity 79% and reaction time 24 h. The solubility, emulsifying property and emulsion stability of the resulting RDG-Car conjugate were improved obviously, which were increased by 2.04, 4.84 and 0.63 times,respectively when compared with those of RDG. Meanwhile, we found that the surface hydrophobicity of glutelin was reduced dramatically after glycosylation with Car. Compared with RDG, its conjugate with Car exhibited much higher solubility,emulsifying capacity and emulsion stability in a wide pH range.

rice dregs glutelin；carrageenan；solubility；emulsifying properties

TS201.1

A

1002-6630(2011)16-0011-05

2011-04-26

國家發(fā)展與改革委員會項目(發(fā)改投資[2009]2825號)；南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室目標導(dǎo)向項目

(SKLF-MB-201005)；江西省高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化重大項目(贛財教{2008}212號)

杜研學(xué)(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為糧食、油脂及植物蛋白工程。E-mail：oduyanxue@163.com

*通信作者：熊華(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為蛋白質(zhì)、微膠囊與功能性食品。E-mail：huaxiong100@yahoo.com.cn