黃芪對運動大鼠腎臟血管緊張素Ⅱ、尿蛋白的影響

陳振翠，汪君民

（無錫城市職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 無錫 214064）

理論與方法探索

黃芪對運動大鼠腎臟血管緊張素Ⅱ、尿蛋白的影響

陳振翠，汪君民

（無錫城市職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 無錫 214064）

研究黃芪和運動訓練對大鼠尿蛋白及血管緊張素Ⅱ的影響，為運用中藥防治運動性蛋白尿提供新方法、新思路，并為其在運動訓練和競賽中的廣泛應用提供理論依據(jù)。

黃芪；血管緊張素Ⅱ；尿蛋白

本實驗以黃芪與運動訓練對大鼠進行干預，綜合運用中醫(yī)傳統(tǒng)的腎病辯證治療經(jīng)驗，將傳統(tǒng)的中醫(yī)相關實踐與現(xiàn)代黃芪藥理研究相結(jié)合，探討黃芪對運動性蛋白尿的防治作用。

1 研究對象及實驗分組

健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，8周齡，體重180.2±15.1g。單籠飼養(yǎng)，自然光照，通風良好，室溫18 ～ 25℃，相對濕度50% ～ 55%， 國家標準嚙齒類動物干燥飼料喂養(yǎng)，自由進食飲水。實驗前先將大鼠在實驗室適應性飼養(yǎng)1周，隨機將其分為對照組、黃芪組、訓練組，每組按處死狀態(tài)又分為兩個亞組，即安靜狀態(tài)、力竭運動后即刻組。（表1）

2 研究方法

2.1 黃芪水煎劑的濃度、藥量及其制備

黃芪煎劑的制備劑量以喬玉成[1]的“實驗動物給藥量的確定及計算方法 ”確定“10ml/kg體重的黃芪煎劑，含生藥濃度約0.35g/ml，1次/天”為本實驗的常規(guī)用藥量，并連續(xù)灌胃5周。

黃芪水煎劑的制備。黃芪70g，加自來水500ml浸泡30 ～ 40min，大火燒開后微火煮沸約30min，提取濾液后將殘渣加水至500ml，微火煮沸約30min，合并兩次濾液至200ml，制成0.35g/ml的水煎劑。每天熬制一次，運動前3小時灌胃。

2.2 運動訓練方案

隨機分組后，T組進行無負重的適應性游泳，5只/桶，1次/天。3天適應性游泳時間，第1天10min，第2天20min，第3天30min。水溫30±2℃。游泳桶為圓形無毒塑料桶高80cm、直徑65cm。

適應性訓練后，每天上午M組大鼠灌服黃芪10ml/kg體重；C組、T組大鼠灌胃等量生理鹽水，下午T組大鼠訓練，訓練時間為五周。具體訓練方案如表2。

經(jīng)過5周的灌服黃芪及訓練后，C組、M組適應性游泳3天，然后休息兩天。之后各組的力竭即刻組進行大強度負重游泳，背部負重為其體重7%，直至力竭，記下力竭時間。

2.3 樣品的采集和制備

各組大鼠均在實驗前常規(guī)禁食12小時，禁食期間自由飲水。腹腔注射20%氨基甲酸乙酯麻醉，注射量約為2ml/只。血漿的制備，眼球取血3ml，放入加有抗凝劑、血管緊張素Ⅱ轉(zhuǎn)換酶抑制劑和血管緊張素酶A抑制劑的預冷試管中，離心后置-20℃保存。尿的取樣，微量注射器抽取后精確定容，分別裝入兩組試管中，-20℃保存。

2.4 測試指標

力竭時間、白蛋白（Alb）、β2微球蛋白（β2-Mg）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）。

2.5 測試方法

血管緊張素Ⅱ活性，β2-微球蛋白和尿白蛋白濃度均為放射免疫分析法測定。

2.6 主要試劑

血管緊張素Ⅱ、β2-微球蛋白、尿白蛋白試劑盒，均購于北京北方生物技術(shù)研究所。

表1 實驗大鼠分組

表2 大鼠遞增運動負荷訓練方案

表3 大鼠血漿AngⅡ及 尿液Alb、β2-Mg的變化

表4 大鼠血漿AngⅡ與 尿液ALB、β2-Mg相關系數(shù)

3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差（ ± SD）表示，統(tǒng)計分析采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，以簡單相關和偏相關分析AngⅡ與尿液Alb、β2-Mg之間的相關性。顯著性差異水平為P＜0.05，非常顯著性差異水平為P＜0.01。

4 實驗結(jié)果

4.1.1 運動訓練和灌胃黃芪對大鼠血漿AngⅡ的影響各組大鼠血漿AngⅡ含量之間的對比（表3），與C1組的相比，M1組、T1組大鼠血漿AngⅡ含量有下降的趨勢，且P＜0.05；與C2組的相比，M2組大鼠血漿AngⅡ含量有下降的趨勢，且P＜0.01，T2組大鼠血漿AngⅡ含量明顯降低，且P＜0.01。

4.1.2 運動訓練和灌胃黃芪對大鼠尿液Alb濃度的變化與C1組的相比，M1組、T1組大鼠尿液Alb濃度有下降趨勢，但差異不顯著；與C2組的相比，M2組大鼠尿液Alb濃度有下降的趨勢，且P＜0.05，T2組大鼠尿液Alb濃度明顯降低，且P＜0.01。

4.1.3 運動訓練和灌胃黃芪對大鼠尿液β2-Mg濃度的變化與C1組的相比，M1、T1組大鼠尿液β2-Mg濃度有下降的趨勢，但差異不顯著；與C2組的相比，M2組大鼠尿液β2-Mg濃度有下降的趨勢，且P＜0.05；T2組大鼠尿液β2-Mg濃度明顯降低，且P＜0.01。

4.2 大鼠在力竭即刻狀態(tài)AngⅡ與尿液ALB、β2-Mg偏相關分析

AngⅡ同血管平滑肌上的受體結(jié)合直接導致腎組織缺血、缺氧，進而引發(fā)產(chǎn)生O2－的黃嘌呤氧化酶和中性粒細胞呼吸爆發(fā)途徑；自由基會攻擊各種酶使其活性減弱或喪失，而腎素是一種酸性蛋白酶，因此自由基和AngⅡ之間的關系較密切。對這兩種因素與ALB和β2-Mg的關系做了偏相關分析，可以探查二者更深層次的內(nèi)在聯(lián)系。參照相關系數(shù)判斷方法：相關系數(shù)在0.3以下為無相關，0.3 ～ 0.5為低度相關，0.5 ～ 0.8為中度相關，0.8以上是高度相關。由表4可以看出，C2組和M2組AngⅡ與ALB達到了高度相關（相關系數(shù)分別為0.8593、0.8829），且具有顯著性差異（P＜0.05）。C2組AngⅡ與β2-Mg也達到了中度相關（r=0.5173）。

4.3 大鼠力竭時間的變化

力竭時間變化情況，與C2組相比，M2組有上升趨勢，且P＜0.05；T2組明顯升高，且P＜0.01。

由于會展旅游屬于一種新生的旅游產(chǎn)品，所以相關的管理制度還不健全。這種情況下，會展旅游業(yè)的市場容易產(chǎn)生無序、紊亂的現(xiàn)象，影響行業(yè)的整體發(fā)展。即使成都市政府成立了專門的會展管理機構(gòu)，但是由于管理制度的不健全，仍然缺乏對會展旅游業(yè)從業(yè)人員和辦會單位的資質(zhì)審查，導致大量水平低下、浪費資源的低水平會展重復舉辦，更有甚者，某些冒用政府名號舉辦的銷售劣質(zhì)產(chǎn)品的會展或者打著車展、漫畫展等的名號舉辦的有傷風化的展會也得到審批通過，在社會上給會展旅游業(yè)造成了極大的負面影響。

5 分析討論

5.1 運動訓練與黃芪對大鼠一般情況的影響

在整個實驗過程中，所有組別大鼠活潑好動，皮毛光潔，眼睛有神。各組大鼠的體重和飲食量都呈良好的增長趨勢，提示運動大鼠未出現(xiàn)過度訓練的情況，對黃芪灌胃和訓練無不良反應。

5.2 運動、黃芪對大鼠血漿AngⅡ含量的影響

腎素是一種糖基化的單鏈蛋白酶。它能將肝臟合成并釋放的血管緊張素原水解為一個十肽的AngI，進而被組織內(nèi)的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶水解，去掉兩個氨基酸，從而生成一種八肽的AngⅡ，AngⅡ在血漿及組織內(nèi)的血管緊張素酶A的作用下，再失去一個氨基酸，變成七肽的AngIII。在這3種類型中，AngⅡ的活性最強，被公認為目前已知的縮血管最強的物質(zhì)之一，也可抑制腎素的表達。AngI對體內(nèi)大多數(shù)組織、細胞來說基本上沒有活性；AngIII的縮血管效應僅為AngⅡ的10%—20%。

研究表明，腎臟內(nèi)有其自身的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，血管緊張素原mRNA主要表達在近曲小管細胞，腎素mRNA的表達主要出現(xiàn)在球旁細胞，這表明腎臟能同時生成腎素和血管緊張素原。腎血管內(nèi)皮細胞能生成血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，在外系膜細胞膜、球旁細胞膜、足細胞和內(nèi)皮細胞膜、近曲小管刷狀緣上均有血管緊張素酶A。AngⅡ受體在腎內(nèi)分布廣泛，可以通過與出球小動脈、入球小動脈內(nèi)壁上受體結(jié)合而導致它們收縮，但是由于出球小動脈對AngⅡ的敏感性遠遠超過入球小動脈，故一般情況下，AngⅡ最終效應是通過出球小動脈收縮而導致腎小球球后阻力顯著增加，使腎小球濾過分數(shù)增加[2]。

腎血流減少時，腎素分泌就會增加；血漿中Na+濃度降低時，腎素分泌也會增加[3]。試驗中，T1組、M1組大鼠血漿AngⅡ含量比C1組低，且P＜0.05，顯示5周的游泳訓練或灌藥大鼠可以顯著降低大鼠安靜狀態(tài)下的血漿中AngⅡ水平。T2組大鼠血漿AngⅡ含量比C2組低，且P＜0.01，顯示5周的游泳訓練可以顯著降低大鼠或灌藥大鼠力竭狀態(tài)下的血漿中AngⅡ水平。這可能是由于運動時應激系統(tǒng)活動加強，促使AngⅡ分泌增多，經(jīng)過長時間的訓練后，應激系統(tǒng)得到適應，故運動訓練組AngⅡ水平低于非訓練組。關宇光[4]研究提示，有氧運動可以降低大鼠動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中血漿AngⅡ水平，60min和120 min的有氧運動相比無顯著差異。但60min有氧運動可以使心肌組織中AngⅡ水平顯著降低。

M2組大鼠血漿AngⅡ含量比C2組低，且P＜0.01，說明5周灌胃黃芪水煎液可以顯著降低大鼠力竭狀態(tài)下的血漿中AngⅡ水平。這表明黃芪有抑制AngⅡ的釋放，降低血壓的作用。史大卓等[5]研究復方芪丹液可干預AMI大鼠VR的病理過程，抑制AngⅡ釋放，降低ET水平，改善動物內(nèi)皮功能。孟立強等[6]研究發(fā)現(xiàn)黃芪當歸合劑對單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）模型大鼠腎臟血管活性物質(zhì)變化的影響主要表現(xiàn)為早期降低腎內(nèi)縮血管物質(zhì)AngⅡ水平、持續(xù)增強eNOS活性使舒血管物質(zhì)內(nèi)皮源性NO產(chǎn)生增加，從而可能降低血管張力、改善腎臟的缺血/缺氧狀態(tài)，對腎臟起到保護作用。

5.3 運動、黃芪對大鼠尿液Alb及β2-Mg濃度的影響

5.3.1 運動、黃芪對大鼠尿液Alb濃度的影響臨床上，若出現(xiàn)入球毛細血管壓升高、腎小球基底膜濾過孔徑增大、腎小管重吸收能力下降及血漿中、小分子量蛋白質(zhì)增多等時，就會出現(xiàn)微量或臨床白蛋白尿。

本研究中，M1組、T1組與C1組大鼠尿液白蛋白含量差異不顯著，說明大鼠在灌胃黃芪或訓練期間沒有對腎臟結(jié)構(gòu)及功能有不良的影響。T2組大鼠尿液Alb濃度低于C2組，且P＜0.01，說明訓練顯著降低大鼠力竭即刻尿液中的白蛋白濃度，其機理有可能是經(jīng)過長時間的運動訓練，引起腎臟損傷的“閾值”調(diào)高，力竭時腎小球和腎小管損傷減輕，白蛋白濾出量減少。同樣，M2組大鼠尿液Alb濃度比C2組低，且P＜0.05，說明灌胃黃芪可顯著降低運動大鼠或大鼠力竭即刻尿液中白蛋白的濃度，可能由于黃芪煎劑使大鼠在力竭時，腎小球濾過膜和/或腎小管得到一定程度的保護，白蛋白濾出量隨著減少。孫健等[7]研究發(fā)現(xiàn)EGb能清除體內(nèi)過多氧自由基，減少炎性細胞浸潤，改善腎小球基底膜通透性，減輕腎小球系膜基質(zhì)積累，防止腎小球硬化而減少尿蛋白丟失。

5.3.2 運動、黃芪對大鼠尿液β2-Mg濃度的影響β2-Mg以游離形式存在于血、尿、腦脊液等體液中。T1組、M1組與C1組大鼠尿液β2-微球蛋白含量差異不顯著，說明大鼠或運動大鼠在灌胃黃芪或訓練期間沒有出現(xiàn)對腎臟結(jié)構(gòu)及腎功能有不良的影響。

T2組大鼠尿液β2-Mg濃度比C2組低，且P＜0.01，說明運動訓練可以顯著降低大鼠力竭即刻尿液中的β2-Mg濃度，其機理是由于經(jīng)過長時間的運動訓練，引起腎臟損傷的“閾值”上調(diào)，大鼠在力竭時腎小球損傷減輕，白蛋白濾出量減少的同時，減輕了腎小管的負擔，加大了β2-Mg的吸收，所以β2-Mg濾出量減少。

M2組大鼠尿液β2-Mg濃度比C2組低，且P＜0.05，說明灌胃黃芪水煎液可以顯著降低大鼠力竭即刻尿液中β2-Mg的濃度，可能是經(jīng)過長時間的灌服黃芪使大鼠在力竭時，腎小球濾過膜和/或腎小管由于黃芪作用得到一定程度的保護，損傷程度減輕，所以β2-Mg濾出量隨著減少。

5.4 大鼠血漿AngⅡ與尿液Alb、β2-Mg的相關分析

在本實驗中，大鼠力竭后，C2、M2組的偏相關表明，Alb與AngⅡ呈現(xiàn)高度正相關（r分別為0.8593和0.8829）。而C2組的β2-Mg濃度有所增加，與AngⅡ的相關系數(shù)達到了中度相關（r=0.5173）。表明AngⅡ促進了蛋白尿中白蛋白（Alb）的產(chǎn)生，也是蛋白尿中小分子（β2-Mg）產(chǎn)生的機制之一。

馬依彤[8]認為，AngⅡ能改變腎小球濾過膜孔徑屏障，增加大孔物質(zhì)通透性。依照這種觀點，AngⅡ通過增加濾過分數(shù)而使腎小球毛細血管中血漿大分子物質(zhì)的濃度增加，從而造成大分子物質(zhì)從腎小球中濾出增加并最終形成大分子蛋白尿。從以上分析看出大量白蛋白以及更大分子量的蛋白質(zhì)的出現(xiàn)與AngⅡ的活性有很大關系。陳偉、湯長發(fā)[9]發(fā)現(xiàn)力竭游泳后Alb排泄率與AngⅡ濃度正相關，認為AngⅡ的作用位點是腎小球而非腎小管，但AngⅡ作用于腎小球而引起的血流動力學改變可能間接影響腎小管的重吸收功能，從而使β2-Mg的排泄率大大增加，與本研究結(jié)果相近。

據(jù)此，筆者認為產(chǎn)生運動性蛋白尿中大分子生成機制與腎素血管緊張素系統(tǒng)密切相關，而蛋白尿中小分子生成的機制與腎素血管緊張素相關性呈中度，但尚需要更多的實驗證明。

5.5 運動訓練與黃芪對大鼠力竭時間的影響

力竭時間是機體的抗應激能力、抗疲勞能力等多種作用的綜合體現(xiàn)，是衡量機體運動能力的重要直接指標。許多研究表明，運動訓練和黃芪制劑可以延遲疲勞產(chǎn)生，提高機體運動能力，延長運動時間。

與C2組相比，M2組大鼠的力竭時間明顯延長，且P＜0.05。張全江等[10]研究表明，耐力運動能顯著提高機體的抗疲勞能力，延長小鼠力竭游泳時間。與C2組相比，T2組上升，且P＜0.01。表明黃芪能提高大鼠的運動能力，可能與此黃芪含有抗疲勞的成分有關。周志宏等人實驗提出，服用補腎益元方小鼠游泳至力竭時間運動較對照組明顯延長（P＜0.05）[11]。

綜上所述，運動訓練和黃芪可能通過抗氧化或通過降低血漿AngⅡ的水平，降低了蛋白尿中絕大多數(shù)大分子蛋白質(zhì)和少部分小分子蛋白質(zhì)的排出，使機體處于較好的運動狀態(tài)，進而提高運動能力。

6 結(jié) 論

運動訓練和灌胃黃芪都能提高大鼠的運動能力，但單一灌胃黃芪運動能力提高不明顯。運動訓練和灌胃黃芪都能較好地降低大鼠在安靜狀態(tài)、力竭即刻狀態(tài)血漿AngⅡ含量，降低運動力竭即刻大鼠尿液Alb及β2-Mg濃度；黃芪可能參與了AngⅡ生成的調(diào)節(jié)，而AngⅡ機制參與了大分子（Alb）蛋白尿的形成，也可能參與了小分子（β2-Mg）蛋白尿的生成，但后者需要更多的實驗證明。

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1674-151X（2011）10-050-04

10.3969/j.issn.1674-151x.2011.10.022

投稿日期：2011-05-12

陳振翠（1974 ～），講師。研究方向：體育教育。