戴喜末,熊子文,羅麗萍*
(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西 南昌 330031)
響應(yīng)面法優(yōu)化野艾蒿多糖的超聲波提取及其抗氧化性研究
戴喜末,熊子文,羅麗萍*
(南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,江西 南昌 330031)
為確定野艾蒿多糖超聲波提取的最佳工藝條件,利用中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用三因素三水平響應(yīng)面分析法,獲得多元二次線(xiàn)性回歸方程,以多糖提取率為響應(yīng)值作響應(yīng)面和等高線(xiàn)圖,并考察野艾蒿多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:野艾蒿多糖最佳超聲波提取工藝條件為超聲時(shí)間35min、提取溫度70℃、水料比40:1(mL/g),在此工藝條件下,多糖得率6.44%與理論預(yù)測(cè)值6.71%的相對(duì)誤差為4.02%,擬合度較好。野艾蒿多糖的總抗氧化能力較強(qiáng),對(duì)DPPH自由基具有一定的清除能力。
野艾蒿;多糖;響應(yīng)面法;超聲波提??;抗氧化性
野艾蒿(Artemisia lavandulaefolia)為菊科蒿屬多年生草本植物,在全國(guó)多數(shù)省份均有分布,資源量巨大。有強(qiáng)烈的揮發(fā)性氣味,富含揮發(fā)油、有機(jī)酸、生物堿、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)及其化合物,有散寒、祛濕、溫經(jīng)、止血作用。野艾蒿的嫩苗還可鮮食或腌制醬菜,曾作救荒本草使用[1]。
超聲輔助提取技術(shù)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種方法,相比于其他傳統(tǒng)水浸提法、索氏提取法,具有選擇性高、能耗低、效率高等優(yōu)點(diǎn),已被應(yīng)用于植物活性成分的提取[2-4]。響應(yīng)面分析(response surface analysis methodology,RSM)是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)并通過(guò)試驗(yàn)得到一定的數(shù)據(jù),采用多元二次回歸的方法,將多因子試驗(yàn)中因子指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式近似擬合,通過(guò)對(duì)函數(shù)響應(yīng)面和等高線(xiàn)的分析,能夠精確地研究各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系,以最經(jīng)濟(jì)的方式對(duì)所選試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行全面的分析和研究,已越來(lái)越多地應(yīng)用于各種生物化工處理過(guò)程的優(yōu)化[5-6]。
目前有不少關(guān)于野艾蒿的同屬植物艾葉(Artemisiae argyi)的研究。沈霞等[7]研究發(fā)現(xiàn)艾葉多糖具有很好的抗氧化、抗腫瘤活性和免疫促進(jìn)作用,但關(guān)于野艾蒿多糖的提取及生物活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以我國(guó)豐富的野艾蒿資源的莖葉為實(shí)驗(yàn)材料,利用中心組合(Box-Behnken)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法,從中提取其活性多糖,獲得野艾蒿多糖的超聲波提取最佳工藝條件,并研究野艾蒿多糖的體外抗氧化活性,以期為更好地開(kāi)發(fā)野艾蒿資源提供參考。
1.1 材料與試劑
新鮮野艾蒿莖葉(由江西省杭蓮生態(tài)農(nóng)業(yè)公司提供,采收于4月中旬):在65℃烘箱中經(jīng)24h烘干后,用粉碎機(jī)粉碎,置于干燥器中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
1,1-二苯基苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) 美國(guó)Sigma公司;苯酚、無(wú)水乙醇、濃硫酸、甲醇、三氯乙酸、正丁醇、丙酮、鐵氰化鉀、葡萄糖均為國(guó)產(chǎn)分析純。
1.2 儀器與設(shè)備
JA1003N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;GZX-DH-50-55-s電熱恒溫干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠(chǎng);HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇國(guó)華電器有限公司;7200可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;SHB-IIIA型循環(huán)水式多用真空泵 河南太康教材儀器廠(chǎng);KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器公司。
1.3 方法
1.3.1 野艾蒿多糖的制備
精確稱(chēng)取野艾蒿粉末4.0g,按實(shí)驗(yàn)方法加入水后,放入超聲波清洗器中(超聲頻率40kHz,100%輸出功率),超聲一定時(shí)間后,進(jìn)行抽濾,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,稱(chēng)得干質(zhì)量,再用蒸餾水定容至25mL,得野艾蒿樣品溶液。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制[8-10]
精密稱(chēng)取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖10.00mg,置100mL容量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,配得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL,分別置于10mL容量瓶中,加入蒸餾水補(bǔ)至2mL,然后再加入5%苯酚溶液1.0mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5.0mL。搖勻,沸水浴20min后,在冷水中冷卻至室溫。在490nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。同時(shí)用2.0mL蒸餾水做空白對(duì)照。得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程:C=0.0645A-0.0008,r2=0.9995。說(shuō)明葡萄糖在所取的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),其質(zhì)量濃度和吸光度呈良好線(xiàn)性關(guān)系。
1.3.3 野艾蒿多糖的測(cè)定[11]
準(zhǔn)確吸取0.6mL野艾蒿樣品溶液于50mL容量瓶中,用蒸餾水定容,取2.0mL該溶液,采用苯酚-硫酸法,用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,通過(guò)所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出多糖的含量,根據(jù)下式計(jì)算多糖得率:
式中:比色皿測(cè)定的多糖質(zhì)量濃度/(mg/mL);樣品溶液稀釋倍數(shù)為125;樣品溶液體積為25mL;實(shí)驗(yàn)樣品質(zhì)量為4.0g。
1.3.4 提取工藝優(yōu)化
根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理(Box-Behnken),采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,自變量的試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼,設(shè)計(jì)15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn),試驗(yàn)因素安排見(jiàn)表1。
表1 野艾蒿多糖提取試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels in response surface design
1.3.5 野艾蒿多糖的精制
采用Sevag法脫蛋白:上清液濃縮至一定體積后,用4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉,于冰箱冷藏24h后抽濾取沉淀,得野艾蒿粗多糖。野艾蒿粗多糖加水溶解,配制Sevag溶液(氯仿:正丁醇=4:1(V/V)),按粗多糖溶液:Sevag溶液=4:1(V/V)搖勻20min,5000r/min離心10min,取上清液,重復(fù)操作3次,上清液用4倍體積的無(wú)水乙醇醇沉,置于冰箱中24h,高速離心去上清溶液,沉淀復(fù)溶。
采用活性炭脫色:已脫蛋白的粗多糖提取液加入2g/100mL活性炭,加熱70℃脫色50min,趁熱過(guò)濾,濾液濃縮至15mL體積后加4倍體積的乙醇沉淀,靜置后抽濾,沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次,凍干得野艾蒿多糖粉末。用于抗氧化活性測(cè)定。
1.3.6 野艾蒿多糖的總抗氧化能力測(cè)定
采用普魯士蘭法。取一定質(zhì)量濃度的樣品溶液1mL,加入0.2mol/L、pH6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的K3Fe(CN)6溶液各2.5mL并混合均勻,50℃水浴20min后加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液,混合后靜置10min。取上清液7.5mL,加7.5mL雙蒸水和1mL 0.1% FeCl3混合均勻,10min后700nm處測(cè)定吸光度,以蘆丁做陽(yáng)性對(duì)照。野艾蒿多糖的總抗氧化能力以多糖質(zhì)量濃度-吸光度線(xiàn)性回歸方程斜率K表示[12]。
1.3.7 野艾蒿多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用
取0.0049g DPPH用甲醇定容至100mL容量瓶中,配成濃度為0.124mmol/L DPPH甲醇溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)。取0.1mL質(zhì)量濃度分別20、10、5、2.5、1.25、0.625mg/mL多糖溶液分別加入試管中,再加入3.9mL DPPH溶液,室溫黑暗中反應(yīng)90min,以蒸餾水做空白對(duì)照,在517nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。
I/%=[(A0- As)/A0]× 100
式中:I為DPPH自由基清除率/%;A0為空白樣品的吸光度;AS為不同質(zhì)量濃度的被測(cè)混合物的吸光度。
50%抑制濃度IC50可通過(guò)自由基清除活性-樣品濃度的線(xiàn)性關(guān)系求出[13]。
2.1 野艾蒿多糖得率回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)
按照Box-Behnken試驗(yàn)方案進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。將所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行多元回歸擬合,得到以多糖得率(Y)為目標(biāo)函數(shù)的二次回歸方程:多糖得率對(duì)超聲時(shí)間(X1)、提取溫度(X2)和水料比(X3)的二次多項(xiàng)回歸方程:
式中的超聲時(shí)間X1、提取溫度X2和水料比X3在設(shè)計(jì)中均經(jīng)量綱線(xiàn)性編碼處理,因此方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映了各因素對(duì)指標(biāo)值的影響程度,系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。
表2 野艾蒿多糖得率提取Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Scheme and experimental results of response surface design
為了檢驗(yàn)方程的有效性,對(duì)野艾蒿多糖提取的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,一次項(xiàng)中X1、X2、X3的影響極顯著,其中提取溫度對(duì)野艾蒿多糖得率的影響最顯著,其次是水料比,最后是提取時(shí)間。交互項(xiàng)X1X2的影響極顯著,說(shuō)明超聲時(shí)間與提取溫度對(duì)多糖得率有顯著影響;二次項(xiàng)中X12、X22的影響均達(dá)極顯著水平。多糖得率顯著性檢驗(yàn)F=131.08>F0.01(14,15),表明失擬項(xiàng)影響很小,方程高度顯著。模型的R2Adj為0.9882,說(shuō)明該模型能反映98.82%響應(yīng)值的變化,因而該模型擬合程度較好,實(shí)驗(yàn)誤差小,較好地反映了野艾蒿多糖得率與超聲時(shí)間、提取溫度和水料比關(guān)系,因此可以用此模型對(duì)野艾蒿多糖提取進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。
表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation
2.2 野艾蒿多糖的響應(yīng)面分析與優(yōu)化
圖1 野艾蒿多糖超聲提取的響應(yīng)曲面圖Fig.1 Response surface plots showing the pairwise effects of extraction time, temperature and ratio of water to material on the extraction rate of polysaccharides
從圖1a可知,多糖得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度的提高呈先上升后下降的趨勢(shì),且二者有明顯的交互作用。根據(jù)提取動(dòng)力學(xué)理論,時(shí)間的延長(zhǎng)有助于多糖的充分?jǐn)U散析出,同時(shí)溫度的升高使得分子解附和擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度加快,多糖的析出速率和得率提高,因此適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間和提高溫度有助于提高多糖得率。
從圖1b可知,多糖得率隨著水料比和溫度的增加也呈先升后降的趨勢(shì)。水料比一定時(shí),在高溫區(qū)和低溫區(qū)的多糖得率較低,這主要是因?yàn)闇囟鹊纳呤沟梅肿咏飧胶蛿U(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度加快,從而提高了多糖的析出速率和得率,而溫度過(guò)高可能會(huì)影響破壞多糖結(jié)構(gòu),降低得率。水料比的增大,使得多糖的濃度更低,更容易從細(xì)胞中溶出。
從圖1c可知,超聲時(shí)間較長(zhǎng)、較高條件下,多糖得率隨著水料比的增加而升高,隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)而先增加后減小。分析其主要原因是,超聲波可以使得野艾蒿的細(xì)胞破碎,使得野艾蒿多糖從細(xì)胞膜中析出,而超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)破壞多糖,從而影響提取率。2.3 野艾蒿多糖最佳提取條件的確定和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
在選取的各因素范圍內(nèi),根據(jù)回歸模型通過(guò)Design Expert軟件分析得出,野艾蒿多糖最佳提取條件為超聲時(shí)間35.3min、提取溫度70.46℃、水料比40:1(mL/g),多糖得率的預(yù)測(cè)值為6.71%??紤]到實(shí)際操作的便利,確定野艾蒿多糖的超聲波提取工藝條件為提取時(shí)間35min、提取溫度70℃、水料比40:1(mL/g)。為了證實(shí)預(yù)測(cè)結(jié)果,在最佳提取工藝條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,結(jié)果野艾蒿多糖平均得率為6.44%,與預(yù)測(cè)值為6.71%相差不大,說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合較好,充分驗(yàn)證了所建模型的正確性,說(shuō)明響應(yīng)曲面法適用于對(duì)野艾蒿多糖的超聲波提取工藝進(jìn)行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。
2.4 野艾蒿多糖總抗氧化性的測(cè)定
根據(jù)Atmani等[12]所述,利用普魯士蘭法測(cè)定抗氧化劑活性時(shí),反應(yīng)液吸光度越大,抗氧化活性越強(qiáng),即抗氧化劑濃度與吸光度線(xiàn)性關(guān)系斜率越大,其抗氧化能力越強(qiáng)。野艾蒿多糖抗氧化性曲線(xiàn)的斜率為0.2626,麗艷等[14]研究不同地區(qū)的蜂膠時(shí)發(fā)現(xiàn)黑龍江蜂膠總抗氧化能力最強(qiáng),斜率為2.47,云南蜂膠總抗氧化能力最低,斜率為0.44,沈明花等[15]研究榛蘑多糖的斜率是0.6943。由此可見(jiàn),野艾蒿多糖抗氧化性雖不及蜂膠等強(qiáng)抗氧化劑,但和榛蘑多糖相比,具有一定的抗氧化性。
2.5 野艾蒿多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用
按照1.3.7節(jié)步驟,得出野艾蒿多糖對(duì)DPPH自由基清除率的線(xiàn)性方程為:y=0.0491x+0.0364,R2=0.9906,說(shuō)明自由基的清除率與樣品多糖的濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。由該方程可知,當(dāng)抑制率50%時(shí),IC50為9.44mg/mL,在多糖質(zhì)量濃度0~10mg/mL時(shí),抑制率隨著多糖質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。
賀亮等[16]研究表明,苦楝子多糖IC50為5.02mg/mL;馬惠玲等[17]對(duì)蘋(píng)果渣果膠多糖研究發(fā)現(xiàn),其中0.1mol/L鹽洗組IC50為11.5mg/mL。由此可知,雖然野艾蒿多糖的IC50略低于蘋(píng)果渣果膠多糖,但比苦楝子多糖的IC50高,說(shuō)明野艾蒿多糖有一定的清除DPPH自由基能力。
利用軟件Design Expert進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),采用響應(yīng)曲面法建立野艾蒿多糖提取工藝條件的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型,對(duì)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響進(jìn)行分析。結(jié)果表明,模型擬合程度高,試驗(yàn)誤差小,最佳的提取工藝條件為超聲時(shí)間35min、提取溫度70℃、水料比40:1(mL/g),此工藝條件的多糖得率為6.44%,與預(yù)測(cè)值相差較小。對(duì)野艾蒿多糖的抗氧化性表明,野艾蒿多糖具有一定的總抗氧化能力,具有較強(qiáng)清除自由基的能力。因此,野艾蒿多糖可作為潛在天然抗氧化劑應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中,具有廣泛的開(kāi)發(fā)價(jià)值。
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Response Surface Methodology for Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction and Antioxidant Evaluation of Polysaccharides from Artemisia lavandulaefolia Leaves and Stems
DAI Xi-mo,XIONG Zi-wen,LUO Li-ping*
(College of Life Science and Food Engineering, Nanchang University, Nanchang 330031, China)
To optimize the ultrasound-assisted extraction of polysaccharides from Artemisia lavandulaefolia leaves and stems,a multiple quadratic regression describing the relationship between the extraction rate of polysaccharides and extraction parameters such as extraction time, temperature and ratio of water to material was established using a 3-factor, 3-level Box-Behnken statistical design, and response surface and contour plots with the extraction rate of polysaccharides as the response were drawn based on the model. The optimum conditions for extracting polysaccharides from Artemisia lavandulaefolia leaves and stems were determined as follows: ultrasound treatment time 35 min, temperature 70 ℃ and ratio of water to raw material 40 mL/g. Under such conditions, the relative error between the experimental and theoretical extraction rates of polysaccharides was 4.02%,indicating that the goodness of fit of the established regression model is quiet good. Polysaccharides from Artemisia lavandulaefolia leaves and stems had strong total antioxidant capacity and showed scavenging ability towards DPPH free radicals.
Artemisia lavandulaefolia;polysaccharides;response surface analysis methodology (RSM);ultrasoundassisted extraction;antioxidant activity
R284.2
A
1002-6630(2011)08-0093-05
2010-07-11
江西省科技廳攻關(guān)重大項(xiàng)目(S00343)
戴喜末(1985—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)。E-mail:dai8905@126.com
*通信作者:羅麗萍(1972—),女,教授,博士,研究方向?yàn)橹参锷锘瘜W(xué)。E-mail:lluo2@126.com