基因組改組技術(shù)選育苯基乳酸高產(chǎn)菌株

王 丹，陳 光，王立梅

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130118；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；3.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 215500）

基因組改組技術(shù)選育苯基乳酸高產(chǎn)菌株

王 丹1，陳 光1，王立梅2，3，*

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130118；2.常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇常熟215500；3.蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 215500）

以Lactobacillus paracaseiW2為出發(fā)菌株，應(yīng)用紫外誘變和亞硝基胍誘變篩選出5株突變菌株（U4、U7、U12、N3、N6），采用突變菌株進(jìn)行多母本遞推式原生質(zhì)體融合，最終篩選出一株正向突變株F8，其發(fā)酵液中苯基乳酸含量為1.92g/L，比原始菌株提高了1.37倍。并且確定了最佳破壁條件為：溶菌酶濃度20g/L，變?nèi)芫貪舛葹?5μg/mL；最佳融合條件為：常溫下，聚乙二醇的濃度為50%，作用時(shí)間為10min。

基因組改組，副干酪乳桿菌，苯基乳酸

苯基乳酸（Phenyllactic Acid，PLA）作為一種新型的天然生物防腐劑具有較高的抑菌活性，能夠抑制真菌以及金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等多種細(xì)菌污染，從而延長食品貯藏期，保持食品原有風(fēng)味[1-3]。目前苯基乳酸的制備方法主要有化學(xué)合成和生物合成[4-6]。通過微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)的苯基乳酸比傳統(tǒng)化學(xué)防腐劑更加安全、無毒害、有益于身體健康，而倍受人們青睞[7]。但與此同時(shí)生物防腐劑也存在著抑菌濃度高、用量大、價(jià)格貴等不利因素[8]，獲得高產(chǎn)并且穩(wěn)定的苯基乳酸生產(chǎn)菌株有利于降低其生產(chǎn)成本，為實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)?；蚋慕M技術(shù)（genome shuffling）是在經(jīng)典基因重組基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新的、更為有效的定向育種技術(shù)[9]。近幾年來國內(nèi)外很多學(xué)者已成功運(yùn)用基因改組技術(shù)進(jìn)行菌種改良。Patnaik等人對一株野生乳桿菌Lactobacillus（LB-WT）進(jìn)行基因改組提高其耐酸性[10]；Zhang應(yīng)用基因改組技術(shù)有效地提高泰樂菌素產(chǎn)量4倍之多[11]；林俊等人利用基因改組技術(shù)快速提高擴(kuò)展青霉堿性脂肪酶產(chǎn)量，較出發(fā)菌株提高317%[12]。關(guān)于應(yīng)用基因改組技術(shù)進(jìn)行苯基乳酸生產(chǎn)菌株的菌種改造至今還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在對苯基乳酸產(chǎn)生菌株進(jìn)行基因改組以期獲得苯乳酸高產(chǎn)菌株，為苯基乳酸的開發(fā)利用提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

副干酪乳桿菌Lactobacillus paracaseiW2 本實(shí)驗(yàn)室篩選并在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏；D-苯乳酸標(biāo)準(zhǔn)品、溶菌酶、變?nèi)芫鼐徲赟igma公司；甘氨酸、聚乙二醇PEG6000、甲醇（色譜純） 購于北京鼎國生物技術(shù)公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；MRS培養(yǎng)基（%） 蛋白胨1，肉浸膏1，酵母抽提物0.5，葡萄糖2，三水醋酸鈉晶體0.5，Tween 80 0.1，檸檬酸三銨0.2，K2HPO40.2，MgSO4·7H2O 0.02，MnSO4·2H2O 0.005，瓊脂1.5；改進(jìn)CM培養(yǎng)基（%）[13]牛肉膏0.5，蛋白胨1，葡萄糖0.5，酵母膏0.5，NaCl 0.5，甘氨酸1.5，青霉素400U/mL，pH 7.2；再生培養(yǎng)基（%）[13]MRS培養(yǎng)基中添加MgCl20.43，蔗糖6.85，小牛血清0.5。

LC-20AT島津高效液相色譜日本島津公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī)日本東京日立KoKi株式會社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原生質(zhì)體制備 將出發(fā)菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期后，接種于CM培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)2、4、6h，離心洗滌重懸于高滲溶液中，使用溶菌酶和變?nèi)芫毓餐票?，在顯微鏡下觀察原生質(zhì)體形成情況，涂于再生平板。以破壁前原始菌株作對照，計(jì)算原生質(zhì)體形成率和再生率[14]。

1.2.2 原生質(zhì)體滅活

1.2.2.1 紫外滅活 將原生質(zhì)體重懸于高滲溶液中，紫外燈下照射5、10、15、20、25s，各取1mL菌液涂平板，取滅活前原生質(zhì)體溶液做對照，計(jì)算原生質(zhì)體致死率。

1.2.2.2 熱滅活 將原生質(zhì)體溶液置于60℃水浴處理10、20、30、40、50min，計(jì)算原生質(zhì)體致死率。

1.2.3 原生質(zhì)體融合 將滅活的原生質(zhì)體分別重懸于不同濃度的PEG6000中，室溫作用5、10、15、20min，經(jīng)高滲溶液離心洗滌涂布于再生培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6d后，挑取融合平板上碳酸鈣透明圈較大的菌落，通過搖瓶發(fā)酵篩選出苯基乳酸產(chǎn)量提高10%以上的菌株作為下一輪原生質(zhì)體融合的出發(fā)菌株，進(jìn)行多輪遞推式原生質(zhì)體融合。原生質(zhì)體融合率計(jì)算參照文獻(xiàn)[14]。

1.2.4 色譜條件 色譜柱：C18柱；流動(dòng)相：A為0.05%三氟乙酸甲醇溶液，B為0.05%三氟乙酸水溶液；檢測波長：210nm；柱溫：30℃；總流速:1mL/min；進(jìn)樣量為5μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 原生質(zhì)體的形成與再生條件研究

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對原生質(zhì)體形成及再生的影響

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對原生質(zhì)體形成的影響 由圖1可以看出，處于不同生長時(shí)期的菌體細(xì)胞對溶菌酶的敏感性不同，2h和4h培養(yǎng)的菌體細(xì)胞代謝旺盛，細(xì)胞壁處于新生狀態(tài)，有利于溶菌酶的滲透，易于原生質(zhì)體的形成和再生，而6h的菌體細(xì)胞壁相對變厚，肽聚糖網(wǎng)結(jié)構(gòu)更加致密，對溶菌酶抗性增強(qiáng)，此時(shí)的細(xì)胞破壁率和再生率都很低[14]。由于2h的菌體濃度低不利于細(xì)胞融合，故4h為最佳菌體培養(yǎng)時(shí)間。

2.1.2 酶濃度對原生質(zhì)體形成的影響 如表1所示，單獨(dú)使用溶菌酶不能完全破壞菌體細(xì)胞壁，原生質(zhì)體無法釋放出來。同時(shí)使用溶菌酶和變?nèi)芫靥幚?，才能得到質(zhì)壁分離的原生質(zhì)體。隨著酶濃度增加，原生質(zhì)體的形成率也在提高，當(dāng)使用最大溶菌酶濃度30g/L，變?nèi)芫貪舛葹?5μg/mL時(shí)，原生質(zhì)體形成率達(dá)到85%，但再生率只有26%。根據(jù)前人研究的結(jié)果，采用原生質(zhì)體形成率與再生率乘積達(dá)到最大值時(shí)的酶濃度作為原生質(zhì)體制備的最佳酶解濃度[15]，確定溶菌酶濃度20g/L，變?nèi)芫貪舛葹?5μg/mL。

表1 溶菌酶和變?nèi)芫貙υ|(zhì)體形成和再生的影響

2.1.3 青霉素和甘氨酸對原生質(zhì)體形成和再生的影響 青霉素和甘氨酸起到了破壞細(xì)胞壁中肽聚糖骨架的作用，增強(qiáng)了菌體細(xì)胞對溶菌酶的敏感性，易于形成原生質(zhì)體[15]。從圖2可知，對未經(jīng)前處理的菌體細(xì)胞進(jìn)行破壁原生質(zhì)體形成率很低，只有20%。在培養(yǎng)基中分別添加甘氨酸和青霉素，原生質(zhì)體形成率分別提高到57%和71%，同時(shí)加入甘氨酸和青霉素與單一添加甘氨酸或青霉素相比，細(xì)胞破壁效果更好，使原生質(zhì)體再生率提高至43%?？梢姴煌囵B(yǎng)條件和生長環(huán)境對細(xì)菌的生長代謝和形態(tài)結(jié)構(gòu)都會產(chǎn)生作用，青霉素和甘氨酸起到了破壞細(xì)胞壁中肽聚糖骨架的作用，增強(qiáng)了菌體細(xì)胞對溶菌酶的敏感性，易于形成原生質(zhì)體[15]。

圖2 青霉素和甘氨酸對原生質(zhì)體形成及再生的影響

2.2 原生質(zhì)體滅活條件研究

2.2.1 紫外滅活 如表2所示，原生質(zhì)體在紫外線照射15s仍有存活，20s以后才能將原生質(zhì)體全部滅活。

表2 紫外線照射時(shí)間與原生質(zhì)體存活率的關(guān)系

2.2.2 熱滅活 如表3所示，將原生質(zhì)體置于60℃水浴10～20min仍有不同程度的原生質(zhì)體存活，30min可將原生質(zhì)體全部滅活。

表3 熱滅活時(shí)間與原生質(zhì)體致死率的關(guān)系

2.3 原生質(zhì)體融合條件的研究

2.3.1 PEG濃度對原生質(zhì)體融合率的影響 如圖3所示，PEG濃度在30%～50%之間時(shí)原生質(zhì)體融合率隨著濃度增加而上升，當(dāng)PEG濃度達(dá)到50%時(shí)融合率達(dá)到了0.076%，PEG可使細(xì)胞之間接觸點(diǎn)處的膜脂類分子發(fā)生側(cè)向流動(dòng)而相互親和，增加了細(xì)胞發(fā)生融合的可能[16]。繼續(xù)提高PEG濃度至60%，融合率驟然下降，因此采用50%的PEG室溫下進(jìn)行原生質(zhì)體融合較為適合。

圖3 PEG濃度對原生質(zhì)體融合的影響

2.3.2 融合時(shí)間對原生質(zhì)體融合率的影響 在細(xì)菌原生質(zhì)體融合時(shí)，PEG作用于原生質(zhì)體的時(shí)間也至關(guān)重要。由圖4可以看出，隨著融合時(shí)間的延長，融合率降低，由于延長PEG作用時(shí)間使原生質(zhì)體破裂死亡，導(dǎo)致再生率下降[17]。融合時(shí)間5min，融合率達(dá)到了0.089%，說明原生質(zhì)體融合是在PEG接觸原生質(zhì)體后立即發(fā)生的，但是要達(dá)到基因重組必須維持一定作用時(shí)間，故選用10min為原生質(zhì)體融合的最佳時(shí)間。

圖4 融合時(shí)間對原生質(zhì)體融合率的影響

2.4 原始菌株與突變株苯基乳酸產(chǎn)量的比較

將原始菌株與突變株分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，紫外誘變和亞硝基胍誘變獲得的突變株苯基乳酸產(chǎn)量僅提高10%～20%，與原始菌株差別不大。原生質(zhì)體融合篩選出四株菌F5、F7、F8、F13，經(jīng)過多輪遞推式原生質(zhì)體融合其苯基乳酸產(chǎn)量均提高了1～2倍，最高產(chǎn)量達(dá)到了1.92g/L，比原生菌株提到了1.37倍。

圖5 原始菌株與突變菌株苯基乳酸產(chǎn)量比較

3 結(jié)論

3.1 采用含有1.5%甘氨酸和400U/mL青霉素的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得菌體細(xì)胞，確定最適培養(yǎng)時(shí)間為4h。

3.2 采用溶菌酶和變?nèi)芫貙Ω备衫胰闂U菌進(jìn)行破壁，當(dāng)溶菌酶濃度為20g/L，變?nèi)芫貪舛葹?5μg/mL時(shí)，原生質(zhì)體形成率達(dá)到80%以上。

3.3 將破壁得到的原生質(zhì)體進(jìn)行融合，最佳融合條件為室溫下PEG6000濃度為50%，作用時(shí)間為10min，在該條件下原生質(zhì)體融合率達(dá)到0.089%。多輪融合后最終篩選出一株苯基乳酸高產(chǎn)菌株，其發(fā)酵液中苯基乳酸產(chǎn)量為1.92g/L，比出發(fā)菌株提高了1.37倍。

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Breeding of strain highly producing phenyllactic acid by genome shuffling

WANG Dan1,CHEN Guang1,WANG Li-mei2,3,*

（1.College of Food Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118，China；2.Department of Biotechnology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500，China；3.The Key Laboratory of Food and Biotechnology,Suzhou 215500，China）

The genome shuffing was used to improve the production of phenyllactic acid by Lactobacillus paracasei W2.The mutants （U4，U7，U12，N3，N6）obtained by ultraviolet irradiation and nitrosoguanidine were used to the parental strains of protoplast fusion.After several rounds of genome shuffling，a forward mutant strain F8 was screened，its phenyllactic acid production was 1.92g/L，which increased 1.37 times more than the parental strain.The optimum concentration of mutanolysin and lysozyme were 15μg/mL and 20g/L，respectively.The optimum conditions of protoplast fusion were 50%PEG6000 and 10min at room temperature.

genome shuffling； Lactobacillus paracasei； phenyllactic acid

TS201.3

A

1002-0306（2011）10-0208-04

2010－10－11 * 通訊聯(lián)系人

王丹（1984-），女，碩士研究生，研究方向：酶工程。

江蘇省科學(xué)技術(shù)廳（BE2008391）；常熟市科技局（CN200921）。