脂肪酶催化合成L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的研究進(jìn)展

蔣相軍，胡 燚，2，劉維明，黃 和，2

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

進(jìn)展與述評(píng)

脂肪酶催化合成L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的研究進(jìn)展

蔣相軍1，胡 燚1，2，劉維明1，黃 和1，2

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210009；2材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009）

為了拓寬L-抗壞血酸酯在維護(hù)人體健康中的應(yīng)用，將L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化成L-抗壞血酸酯是經(jīng)濟(jì)可行的手段。綜述了近年來酶催化L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了有機(jī)相中L-抗壞血酸飽和脂肪酸酯、不飽和脂肪酸酯、脂肪酸混合酯的酶促合成，對(duì)于酶的種類、有機(jī)溶劑的選擇及分離純化方法進(jìn)行了探討，并對(duì)酶催化L-抗壞血酸有機(jī)酸酯合成前景進(jìn)行了展望。

酶；L-抗壞血酸；有機(jī)相； L-抗壞血酸有機(jī)酸酯

L-抗壞血酸（ascorbic acid）即維生素C，是一種水溶性的維生素，分子式為C6H8O6，結(jié)構(gòu)式如圖1。由于人體缺乏合成維生素 C的酶，不能自身合成，只能依賴食物和藥物，因此，它被列為人體必需的營養(yǎng)元素之一，在膠原蛋白合成、免疫和疾病治療等均發(fā)揮著重要的作用[1-3]。然而由于其親水性強(qiáng)，不易于溶解油脂等疏水性液體，極大的限制了它的應(yīng)用，而將L-抗壞血酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-抗壞血酸有機(jī)酸酯則可比較圓滿地解決了該難題。

圖1 L-抗壞血酸結(jié)構(gòu)式

L-抗壞血酸有機(jī)酸酯特別是 L-抗壞血酸脂肪酸酯在脂肪、油和親脂性食品中被廣泛地當(dāng)作抗氧化劑使用。這是因?yàn)長(zhǎng)-抗壞血酸和脂肪酸是在自然界中存在的，無毒，易被人體消化吸收的營養(yǎng)物質(zhì)。目前，在日本、歐洲和美國已禁止叔丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）等常用抗氧化劑在嬰幼兒和兒童食品中使用，原因在于這些物質(zhì)被認(rèn)為有潛在的毒性[4]。另外，L-抗壞血酸有機(jī)酸酯在可作為藥物的載體[6]，也可保護(hù)一些參與體內(nèi)重要生理活動(dòng)的物質(zhì)被氧化，進(jìn)而起到對(duì)一些疾病治療的目的[7]。

L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成主要有兩種方法：化學(xué)法和酶催化法，目前其合成依然以化學(xué)合成為主。然而，L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的化學(xué)合成工藝存在著諸多難以克服的不足，如工藝以濃硫酸或者酰氯為催化劑時(shí)這些催化劑的腐蝕性或者嚴(yán)重的環(huán)境污染都不可避免[8]。然而，脂肪酶具有催化效率高，作用條件溫和環(huán)境污染小等特點(diǎn)而越來越受到青睞。本文就近年來脂肪酶催化合成L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的研究進(jìn)行了綜述。

2 脂肪酶催化合成 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯

在酶催化合成L-抗壞血酸有機(jī)酸酯中，飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸混合物及其它有機(jī)酸作為底物被研究（表1），再者，一些新型反應(yīng)介質(zhì)也在其合成中得到應(yīng)用。

表1 不同的脂肪酸和L-抗壞血酸在有機(jī)溶劑中的酶催化反應(yīng)

2.1 有機(jī)相中L-抗壞血酸飽和脂肪酸酯的合成

飽和脂肪酸主要是為人體提供能量，也可以增加人體內(nèi)膽固醇和中性脂肪，如果飽和脂肪酸缺乏，可能會(huì)導(dǎo)致腦出血、貧血、肺結(jié)核和神經(jīng)障礙等疾病的發(fā)生。在飽和脂肪酸中，己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸等不同碳鏈的脂肪酸都可直接或轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的酯作為?；w在酶催化下和L-抗壞血酸生成相應(yīng)的酯類。

碳鏈長(zhǎng)度不同的脂肪酸在有機(jī)溶劑的溶解度也會(huì)不同，這可能會(huì)對(duì)L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成產(chǎn)生影響。Watanabe等[9]研究了己酸、辛酸、癸酸、月桂酸等飽和脂肪酸在乙腈中以 Novozym435（南極假絲酵母脂肪酶，固定于大孔丙烯樹脂）為催化劑和L-抗壞血酸的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)度不同碳鏈脂肪酸長(zhǎng)度不會(huì)影響轉(zhuǎn)化率。而Yan等[10-12]在丙酮或者叔戊醇中合成的L-抗壞血酸及其它脂肪酸酯中，認(rèn)為脂肪酸鏈的長(zhǎng)度不僅會(huì)影響轉(zhuǎn)化率也影響產(chǎn)率，同時(shí)指出可能是因?yàn)橹炬湹拈L(zhǎng)度會(huì)影響在溶劑中的溶解度和與酶的結(jié)合效率。

不同的 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的分離純化方法對(duì)其得率和純度會(huì)產(chǎn)生很大的影響。蔡水根等[13]以Novozym435為催化劑在丙酮體系中合成L-抗壞血酸月桂酸酯，探討了有機(jī)溶劑萃取法、硅膠柱分離法和高效液相制備法3種方法的可行性、純度以及得率，純度分別達(dá)到86.5%、90.4和95.5%，相應(yīng)的得率分別為85%、80%、90%。

為了獲得 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯最大收率和探討各反應(yīng)因素對(duì)其合成的影響。Chang等[14]在乙腈中以Novozym435為催化劑將L-抗壞血酸和月桂酸直接酯化反應(yīng)，采用響應(yīng)面和中心組合設(shè)計(jì)來分析反應(yīng)參數(shù)（時(shí)間、溫度、底物摩爾比、酶量）和最大轉(zhuǎn)化率間的關(guān)系。分析得出，除反應(yīng)時(shí)間外其它4個(gè)因素對(duì)L-抗壞血酸月桂酸酯摩爾轉(zhuǎn)化率均有明顯的影響，最后分析出的最佳條件為反應(yīng)時(shí)間6.7 h，溫度30.6 ℃，酶量34.5%，底物摩爾比1∶4.3，以及在最適條件下的預(yù)計(jì)摩爾轉(zhuǎn)化率為（93.2±5.6）%。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出的實(shí)際轉(zhuǎn)化率為（92.6±3.8）%，而且反應(yīng)時(shí)間短，操作溫度也比較低。這些都說明了這種方法的可行性與精確性。

圖2 L-抗壞血酸和月桂酸酯化反應(yīng)

針對(duì)國外的固定化脂肪酶價(jià)格昂貴，很難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)這一難題。孫燕等[15]首次采用國產(chǎn)黑曲霉（Aspergillus niger）脂肪酶，以L-抗壞血酸和棕櫚酸甲酯為底物高選擇性地合成了 L-抗壞血酸棕櫚酸酯，得到的產(chǎn)品無需與底物分離，可直接作為食品添加劑，雖反應(yīng)體系溫和，但是轉(zhuǎn)化率只有23%。姜新慧等[16]從酶的重復(fù)利用上考慮來降低成本，利用洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）脂肪酶在有機(jī)相中催化合成 L-抗壞血酸棕櫚酸酯的合成，在攪拌下重復(fù)利用酶10次，前5批次產(chǎn)率都在80%以上，最高可達(dá)89.5%。其產(chǎn)率比較高的原因可能在于攪拌使反應(yīng)體系混合均勻，底物和產(chǎn)物充分?jǐn)U散，酶的活性得到釋放有關(guān)。

影響酶催化合成L-抗壞血棕櫚酸酯因素很多，如溫度、酶種類等，需系統(tǒng)地優(yōu)化反應(yīng)條件以獲得最大的轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型。Lindomer[17]采用“邊實(shí)驗(yàn)邊整理”的序貫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)以獲得最大的轉(zhuǎn)化率和動(dòng)力學(xué)模型。首先篩選合適溶劑和酶，然后以篩選得到酶和最合適的反應(yīng)介質(zhì)條件下，考察不同酶量、溫度、底物配比、反應(yīng)介質(zhì)的量比對(duì)轉(zhuǎn)化率影響，在得出了酶量和反應(yīng)介質(zhì)的量對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較小的條件下，最后又采用響應(yīng)面來分析不同溫度和底物配比影響及兩者的相互作用。通過這些實(shí)驗(yàn)，得到了最佳合成條件和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

表面活性劑包被酶的特點(diǎn)在于：制備過程簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑中溶解性高、比游離酶活性高、相比商業(yè)固定化酶，其價(jià)格較低廉。為了避免酶在有機(jī)溶劑中鈍化，通過在酶表面包被表面活性劑而進(jìn)行化學(xué)修飾在 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成中也得到了應(yīng)用。Hsieh等[18]首次采用單硬脂酸丙二醇酯包被洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）脂肪酶來催化L-抗壞血酸棕櫚酸酯的合成。通過對(duì)來源不同的酶和不同活性劑包被酶進(jìn)行分析，包被酶的穩(wěn)定性和活性本質(zhì)上與表面活性劑的類型有關(guān)，但也與包被使用緩沖液的pH值、表面活性劑的量、反應(yīng)采用的有機(jī)介質(zhì)和反應(yīng)溫度有關(guān)系。在反應(yīng)時(shí)間為24 h，溫度為50 ℃，L-抗壞血酸和棕櫚酸的摩爾比為 1∶6的條件下采用包被酶的轉(zhuǎn)化率為47%，未被修飾的僅為6%，其轉(zhuǎn)化率明顯得到極大地提高。

在L-抗壞血酸棕櫚酸酯合成中，酶時(shí)常要在有機(jī)溶劑存在、較高的溫度下進(jìn)行，因此，尋求耐有機(jī)溶劑、耐高溫的酶也成為關(guān)注的焦點(diǎn)。袁紅玲等[19]用透明圈平板法篩選出一株耐有機(jī)溶劑的產(chǎn)脂肪酶的酵母菌Yarrowiasp.A213，其產(chǎn)酶能力達(dá)到 67.8 UI/L，能直接在叔戊醇中催化合成 L-抗壞血酸棕櫚酸酯。Bradoo等[20]用耐高溫的嗜熱芽孢桿菌脂肪酶催化L-抗壞血酸棕櫚酸酯反應(yīng)，這種酶在40～100 ℃之間都能保持熱穩(wěn)定性，溫度升高不僅使反應(yīng)速率加快，而且有助于維持低的水活度，其最大轉(zhuǎn)化率可達(dá)97%。張杰平[21]通過發(fā)酵產(chǎn)生Aspergillums脂肪酶催化抗壞血酸棕櫚酸酯的合成，并考察了添加蔗糖的共固定化脂肪酶的穩(wěn)定操作，發(fā)現(xiàn)糖共固定化的脂肪酶的穩(wěn)定性大大增加。

L-抗壞血酸硬脂酸酯能抑制人卵巢癌細(xì)胞增生和腫瘤的生長(zhǎng)[22]，具有潛在的抗癌作用，是一種安全、高效、易被人體消化吸收的脂溶性抗氧化劑，同時(shí)也是一種營養(yǎng)強(qiáng)化劑，適合添加在油脂類食品中。晏日安等[23]首次研究了Novozym435催化合成L-抗壞血酸硬脂酸酯，對(duì)影響脂肪酶催化的因素如溶劑等因素進(jìn)行了研究，對(duì)正己烷、叔戊醇、叔丁醇、丙醇等溶劑進(jìn)行了篩選，在正己烷中不發(fā)生反應(yīng)，而在叔丁醇中的產(chǎn)率為59.7%，因而認(rèn)為有機(jī)溶劑的極性對(duì) L-抗壞血酸硬脂酸酯合成有重要的影響。

2.2 有機(jī)相中L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的合成

不飽和脂肪酸在降低血液黏稠度改善血液微循環(huán)，提高腦細(xì)胞的活性，增強(qiáng)記憶力和思維能力等一些生理功能中發(fā)揮著重要的作用。在制備 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯時(shí)，飽和脂肪酸廣泛地作為?；w。然而，相比L-抗壞血酸飽和脂肪酸酯，L-抗壞血酸不飽和脂肪酸酯的溶解度高，在含油脂性物質(zhì)能夠得到應(yīng)用，因而不飽和脂肪酸作為L(zhǎng)-抗壞血酸?；w更加受到重視。自然界中比較常見的不飽和脂肪酸主要分為3大類：以油酸為代表的 ω-9系列不飽和脂肪酸，以亞油酸為代表的 ω-6 系列不飽和脂肪酸以及以二十二碳六烯酸（DHA）為代表的 ω-3系列不飽和脂肪酸。

關(guān)于以DHA為代表的 ω-3系列不飽和脂肪酸合成的研究并不多，Watanabe等[24]以ChirazymeL-2作催化劑在丙酮中催化L-抗壞血酸和DHA等多不飽和脂肪酸反應(yīng)后對(duì)其抗氧化性研究發(fā)現(xiàn)：L-抗壞血酸飽和脂肪酸酯或者不飽和脂肪酸酯和多不飽和脂肪酸的摩爾比大于0.2時(shí)，在抑制多不飽和脂肪酸的氧化性非常有效。

酶具有專一性，不同的底物分子其催化效率也會(huì)不同。Song等[25]以Novozym435在叔戊醇中催化L-抗壞血酸亞油酸中，指出同樣鏈長(zhǎng)（C18）的亞油酸和油酸的產(chǎn)率分別為21.2%和19.3%而飽和的脂肪酸的產(chǎn)率僅為9.6%。而Watanabe等[26]以南極假絲酵母的固定化脂肪酶B的ChirazymeL-2作催化劑在丙酮中將 L-抗壞血酸和 cis-9，trans-11及trans-10，cis-12的共軛亞油酸合成，比較分析后得出trans-10，cis-12共軛亞油酸比cis-9，trans-11共軛亞油酸的轉(zhuǎn)化率要高。這也就說明了底物分子的結(jié)構(gòu)（雙鍵數(shù)目、位置的不同），其轉(zhuǎn)化率也不同，這些都可能與酶的特性有關(guān)。

不同的有機(jī)溶劑對(duì)底物的溶解性不同，而且溶劑的疏水性也對(duì)酶的活性和酶對(duì)底物的特異性也會(huì)產(chǎn)生影響。Song等[27]首次報(bào)道了來南極假絲酵母固定化脂肪酶B催化L-抗壞血酸油酸酯的合成，對(duì)一系列不同極性的有機(jī)溶劑進(jìn)行了篩選，認(rèn)為叔戊醇是最合適的有機(jī)溶劑。

在控制工程領(lǐng)域，基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的過程優(yōu)化和參數(shù)預(yù)測(cè)可以取得很好的效果。應(yīng)艷杰等[28]首次采用中心組合設(shè)計(jì)和動(dòng)量梯度下的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對(duì)反應(yīng)條件（反應(yīng)溫度、脂肪酶量、油酸量）進(jìn)行優(yōu)化。在叔戊醇中采用Novozyme435作催化劑來合成L-抗壞血酸油酸酯，在優(yōu)化后的最適條件下反應(yīng)后其轉(zhuǎn)化率可達(dá)46.5%，與模型誤差在5%以內(nèi)。該方法為酶催化L抗壞血酸有機(jī)酸酯合成效果的預(yù)測(cè)提供了一條可行的途徑。Viklund等[29]在叔戊醇中以Novozym435為催化劑合成了L-抗壞血酸油酸酯，并將其和L-抗壞血酸棕櫚酸酯的氧化性進(jìn)行比較，認(rèn)為在油中的 L-抗壞血酸油酸酯的抗氧化性能強(qiáng)于L-抗壞血酸棕櫚酸酯，這可能與在油中的溶解性不同有關(guān)。

水活度是影響酶催化合成 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的重要因素之一。Adamczak等[30]在L-抗壞血酸油酸酯合成中發(fā)現(xiàn)酶的類型、固定化的載體、水活度和有機(jī)溶劑均會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響，而其中以水活度影響最為明顯。在水活度為0.11時(shí)，轉(zhuǎn)化率為58%，而在0.75時(shí)反應(yīng)幾乎不進(jìn)行。分子篩的加入可以有效地控制水活度。同時(shí)也指出將油酸轉(zhuǎn)化為油酸甲酯是控制水活度的一種有效方法。但是，過量的分子篩又導(dǎo)致反應(yīng)速率和轉(zhuǎn)化率的下降，而Kuwabara等[31]在其報(bào)道中認(rèn)為這是由于過量的分子篩吸附和降解L-抗壞血酸油酸酯而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率下降。

2.3 有機(jī)相中L-抗壞血酸混合酯的合成

在L-抗壞血酸有機(jī)酸酯合成中，為了獲得廉價(jià)的L-抗壞血酸有機(jī)酸酯，一些混合物（棕櫚油、豆油等）也作為反應(yīng)底物與L-抗壞血酸在酶的催化下發(fā)生酯化反應(yīng)。

袁紅玲等[32]首次以食用油脂（氫化棕櫚油、大豆色拉油、納米比亞產(chǎn)海狗油）為脂肪酸基團(tuán)的供體，探討了以Novozym435為催化劑和L-抗壞血酸合成，并對(duì)叔戊醇和丙酮兩種反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在叔戊醇中所得產(chǎn)物質(zhì)量濃度均比在丙酮中要高。Burham等[33]首次在叔戊醇中以 Novozym435催化棕櫚油和L-抗壞血酸合成，認(rèn)為不同量的叔戊醇所得反應(yīng)產(chǎn)率也會(huì)不同。Hsieh等[34]將棕櫚油甲酯和大豆油甲酯在丙酮中以Novozym435為催化劑合成，認(rèn)為丙酮有較低的細(xì)胞毒性而將在食用油脂和L-抗壞血酸合成中有潛在的應(yīng)用。Hsieh等將棕櫚油甲酯和 L-抗壞血酸酯化，所得的混合酯包括45.89%的 L-抗壞血酸棕櫚酸酯、42.59%的 L-抗壞血酸油酸酯、10.1%的 L-抗壞血酸亞油酸酯。Burnham等得到的L-抗壞血酸單酯的混合物組成為61%的L-抗壞血酸單油酸酯、30%的L-抗壞血酸單棕櫚酸酯和9%的L-抗壞血酸單硬脂酸酯。雖然使用的是同樣的酶（Novzym435），但是兩者得到的混合物組成含量還是有差別的，這可能與所用的溶劑等因素有關(guān)。

2.4 有機(jī)相中其它L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成

隨著酶催化L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的深入研究，一些新型的抗氧化劑或者兼有抗氧化、抗菌等多功能L-抗壞血酸有機(jī)酸酯也層出不窮。

在工業(yè)上，胭脂素作為色素的一種，常用于食品、藥物、化妝品的著色，但是其抗氧化能力比較差，Humeau等[35]報(bào)道了在叔戊醇中用南極假絲酵母固定化脂肪酶B作催化劑將胭脂素和L-抗壞血酸反應(yīng)，在65 ℃、反應(yīng)144 h后的產(chǎn)率為25%。

L-抗壞血酸苯甲酸酯和 L-抗壞血酸蘋果酸酯是新型雙功能食品添加劑，因其具有獨(dú)特的抗氧化性和抑菌性而具有潛在的應(yīng)用。Lü等[36-37]以Novozym435為催化劑研究了L-抗壞血酸苯甲酸酯的合成，對(duì)一系列反應(yīng)介質(zhì)篩選后得出環(huán)己酮是最合適的，并對(duì)其抗氧化和抗菌特性進(jìn)行了分析，認(rèn)為它是一種雙功能的試劑。而后他又采用響應(yīng)面法對(duì)影響其合成的重要因素（酶濃度、底物濃度、水活度、溫度、反應(yīng)時(shí)間）進(jìn)行了優(yōu)化，首次采用偏導(dǎo)數(shù)從數(shù)量上闡述了所研究各因素最佳條件和單因素實(shí)驗(yàn)中常數(shù)間的關(guān)系。

高明俠等[38]采用殼聚糖固定化的脂肪酶在丙酮體系中催化L-抗壞血酸和檸檬酸乙酯反應(yīng)，并對(duì)其抗氧化性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn) L-抗壞血酸檸檬酸酯是一種具有開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用潛力的新型抗氧化劑。

將L-抗壞血酸和乳酸在酶催化下發(fā)生酯化反應(yīng)，可以解決乳酸迅速進(jìn)入內(nèi)表皮細(xì)胞而刺激皮膚的難題，又能發(fā)揮乳酸在緩解皮膚衰老，可使皮膚變得光滑細(xì)膩。Maugard等[39]報(bào)道了叔戊醇中 Novozym435催化 L-乳酸甲酯和L-抗壞血酸的反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜锉壤箟难帷肔-乳酸甲酯）從1∶1升到1∶16時(shí)，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率從5%升到45%，說明了底物比例的提高有利于平衡向著產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行。此外，己二酸二乙烯酯[40]、苯基丁酸[41]也可與 L-抗壞血酸在脂肪酶的催化下發(fā)生反應(yīng)，以達(dá)到克服L-抗壞血酸脂溶性差的性能。

2.5 新型反應(yīng)介質(zhì)中L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成

近年來新型反應(yīng)介質(zhì)（離子液體等）和反應(yīng)體系（固-氣體系）的涌現(xiàn)，為 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成開拓了新的道路。

2.5.1 離子液體中酶催化 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成

離子液體作為一種新型溶劑應(yīng)用于生物催化，比傳統(tǒng)有機(jī)溶劑表現(xiàn)出了更大的優(yōu)越性，如酶的穩(wěn)定性和選擇性比較高[42-43]。Park等[44-45]認(rèn)為離子液體能像極性有機(jī)溶劑一樣溶解極性底物（L-抗壞血酸）而又不至于使酶失活，因而使用離子液體的反應(yīng)速度快、產(chǎn)率高。由于離子液體不易揮發(fā)，這樣既可以避免有毒有機(jī)溶劑的蒸發(fā)問題，又可以使用真空驅(qū)動(dòng)反應(yīng)向產(chǎn)物生成的方向進(jìn)行。由固定化脂肪酶 B 催化 L-抗壞血酸與油酸在離子液體中[PentMIM][BF4]的直接酯化反應(yīng)后得到83%的轉(zhuǎn)化率，對(duì)其進(jìn)行簡(jiǎn)單的分離后其產(chǎn)率可達(dá) 61%。Adamczak等[46]也研究了以離子液體[BMIM][BF4]做溶劑，南極假絲酵母固定化脂肪酶B催化下合成L-抗壞血酸油酸酯，并且用鹽對(duì)NaI 2/0來控制水活度，其最高產(chǎn)率可達(dá)72%。

2.5.2 微波作用下L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成

隨著綠色化學(xué)和微波技術(shù)的發(fā)展，微波下的生物催化也逐漸嶄露頭角。Lamare等[47]首次報(bào)道了在來源于Bulkholderia multivorans的固定化脂肪酶在微波的作用下合成L-抗壞血酸脂肪酸酯，不僅反應(yīng)速度得到提高，而且產(chǎn)率也高達(dá)80%。微波輻射并沒有使酶失活，而且有助于脂肪酶活性的發(fā)揮。

2.5.3 其它體系中酶催化 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成

時(shí)至今日，固/氣生物催化[48]也已成為對(duì)基礎(chǔ)研究和新的清潔工業(yè)工程的發(fā)展很有前途的一項(xiàng)技術(shù)。由于整個(gè)系統(tǒng)的熱動(dòng)力學(xué)很容易實(shí)現(xiàn)控制，產(chǎn)率很高，下游的處理簡(jiǎn)單。Yan等[49]在將L-抗壞血酸、酶、分子篩混合的固相中，用南極假絲酵母固定化的脂肪酶B催化L-抗壞血酸和脂肪酸乙烯酯合成了L-抗壞血酸脂肪酸酯，并對(duì)脂肪酸鏈的長(zhǎng)度和底物的比例對(duì)反應(yīng)的影響進(jìn)行了分析，基于L-抗壞血酸及其酯對(duì)空氣和氧的敏感性提出了一種采用水和正己烷進(jìn)行抽提的溫和的分離方法。其純度可達(dá)98%，最高分離率可達(dá)91%。

3 結(jié)論與展望

以上綜述了 L-抗壞血酸和不同種類有機(jī)酸在酶催化下的最新研究，可以看到飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸的混合物以及其它的有機(jī)酸在酶的催化下都可以和L-抗壞血酸進(jìn)行反應(yīng)，而諸如酶濃度、反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、水活度、底物的比例等都會(huì)對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物產(chǎn)量產(chǎn)生影響，而不飽和脂肪酸因具有獨(dú)特的生理特性和良好的脂溶性而成為關(guān)注的焦點(diǎn)。

隨著酶工程技術(shù)發(fā)展，也促進(jìn)了酶催合成 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的研究，固定化酶[50]、有機(jī)相[51]和新型反應(yīng)介質(zhì)[52]（如離子液體）中酶催化反應(yīng)的報(bào)道進(jìn)一步拓寬了酶的應(yīng)用范圍，也為L(zhǎng)-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成奠定了基礎(chǔ)，但高性能的酶依然是制約其發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。尋求能夠用于大規(guī)模生產(chǎn)或者工業(yè)化生產(chǎn)的酶將成為一種趨勢(shì)，科學(xué)家們主要從兩條途徑出發(fā)[53]，其一是分子定向進(jìn)化的手段開發(fā)高性能生物催化劑；其二是利用極端微生物開發(fā)高性能的生物催化劑。雖然一些新型的反應(yīng)介質(zhì)和反應(yīng)體系應(yīng)用到了 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯的合成中，但如何充分發(fā)揮這些新的反應(yīng)體系在抗壞血酸有機(jī)酸酯中的重要作用仍需進(jìn)一步探索。在分離純化過程中，需要耗費(fèi)大量的有機(jī)溶劑，因此，獲得低成本、環(huán)境友好、能夠滿足工業(yè)化生產(chǎn)的分離純化方法依然是一個(gè)難題。近年來，離子液體/二氧化碳兩相體系[54]在有機(jī)合成中迅猛發(fā)展，這種體系集中了離子液體和超臨界二氧化碳的優(yōu)點(diǎn)，使整個(gè)過程實(shí)現(xiàn)綠色化，將在酶催化合成和分離 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯中得到應(yīng)用。

已經(jīng)開發(fā)的新型的 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯大多數(shù)處于實(shí)驗(yàn)階段，但其作為具有多種生物功能或治療某種疾病的藥物的應(yīng)用前景是不可估量的。例如：Choi等[55]合成的L-抗壞血酸五肽，這種L-抗壞血酸衍生物不僅溶解性高而且在抑制酪氨酸和黑色素形成都可以和L-抗壞血酸相媲美，對(duì)膠原蛋白的合成比兩者單獨(dú)使用效果都要明顯。因而把已經(jīng)開發(fā)的 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)和尋求新的具有特有或多種功能的 L-抗壞血酸有機(jī)酸酯仍然有待于發(fā)展。

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Research progress of lipase-catalyzed synthesis of L-ascorbyl organic acid ester

JIANG Xiangjun1，HU Yi1，2，LIU Weiming1，HUANG He1，2（1School of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，Jiangsu，China；2State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing 210009，Jiangsu，China）

To broaden the applications of L-ascorbic acid，it is an economical and feasible way to convert L-ascorbic acid into L-ascorbyl organic acid ester. The recent research progress of enzymatic synthesis of L-ascorbyl organic acid ester is summarized，by focusing on enzymatic synthesis of L-ascorbyl saturated fatty acid ester，unsaturated fatty acid ester and mixed fatty acid ester in organic solvents. The types of lipase，organic solvents and methods of separation and purification in the synthesis are discussed. Furthermore，the prospect of enzymatic synthesis of L-ascorbyl organic acid ester is also presented.

TQ 645.6

A

1000–6613（2011）07–1570–07

2011-01-09；修改稿日期：2011-02-21。

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)基金項(xiàng)目（20936002）、國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（20906049）及南京工業(yè)大學(xué)學(xué)科基金項(xiàng)目。第一作者：蔣相軍（1987—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：胡燚，博士，副教授，主要從事酶催化及固定化方面的研究。E-mail huyi@njut.edu.cn。