結(jié)核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

袁 偉，劉江寧，向志光，林樹柱，張麗芳，秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021)

結(jié)核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建

袁 偉，劉江寧，向志光，林樹柱，張麗芳，秦 川

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，北京 100021)

目的 構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因，并對其在體外真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。方法用PCR法從結(jié)核分枝桿菌H37Rv株基因組中分別擴(kuò)增 Ag85B、Esat6、HspX基因，插入到 pUC19-T載體，序列測定正確后，將融合基因再次克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(-)。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定并測序正確后，用MegaTran 1.0轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，并用Western-Blot檢測目的蛋白的表達(dá)。結(jié)果 Western-blot檢測到分子量大小約65 kDa的目的蛋白。結(jié)論 成功地構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表達(dá)載體，且該重組載體可在體外真核細(xì)胞中獲得特異性的表達(dá)。

結(jié)核分枝桿菌;Ag85B;Esat6;HspX

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種傳染性疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道，目前全球有近1/3的人感染了結(jié)核桿菌。隨著多重耐藥菌、極度耐藥株的出現(xiàn)，艾滋病與結(jié)核共感染人群的增加使得活動性結(jié)核病人日益增多［1］。卡介苗(BCG)是法國科學(xué)家Camille Guerin和Charles Calmette在上個世紀(jì)第一個10年中開發(fā)出來的，1921年開始應(yīng)用于人類，迄今已使用了80多年。在世界衛(wèi)生組織免疫接種擴(kuò)大方案中，卡介苗作為目前唯一的結(jié)核病疫苗正在廣泛使用。接種后可預(yù)防兒童發(fā)生結(jié)核病，但卡介苗對成人肺結(jié)核的保護(hù)效率差別很大(0-80%)?？乖?5復(fù)合體是一組具有較強(qiáng)細(xì)胞免疫及體液免疫活性的分枝桿菌分泌性蛋白。該復(fù)合體由 Ag85a、Ag85b、Ag85c構(gòu)成?？乖治霰砻?3者中以 Ag85a和 Ag85b最具有免疫原性。EAST6(6kD early secretory antigenic target)即6KD早期分泌性抗原性蛋白，是從結(jié)核桿菌短期培養(yǎng)濾液中純化分離出的一種低分子量的分泌性蛋白，具有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫活性。HspX為結(jié)核菌休眠期調(diào)控子(DosR Regulon)中的基因 hspx(Rv2301)編碼的16kD蛋白，屬于小分子熱休克蛋白家族。有研究表明HspX在結(jié)核分枝桿菌感染后短時間內(nèi)減緩其在體內(nèi)生長速度方面可能起到某種關(guān)鍵作用［2］。休眠狀態(tài)結(jié)核桿菌在人體內(nèi)是普遍存在的。感染機(jī)體的結(jié)核桿菌可能有處于休眠狀態(tài)的。結(jié)核桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，受到天然免疫物質(zhì)NO等的攻擊，可能轉(zhuǎn)入休眠狀態(tài)。同時，處在結(jié)核結(jié)節(jié)低氧環(huán)境中的細(xì)菌，也大多轉(zhuǎn)入休眠狀態(tài)?？ń槊?BCG)免疫機(jī)體后，由于休眠期抗原表達(dá)量低，不能針對休眠期細(xì)菌產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致對休眠狀態(tài)結(jié)核桿菌沒有免疫保護(hù)。然而在與結(jié)核病患者密切接觸的健康人群中，發(fā)現(xiàn)對休眠期抗原存在很強(qiáng)的免疫應(yīng)答［3］。由于HspX是結(jié)核分枝桿菌潛伏感染期機(jī)體免疫反應(yīng)的重要靶抗原，所以含有該抗原或抗原基因的疫苗可能會增強(qiáng)潛伏感染人群體內(nèi)的細(xì)胞免疫，進(jìn)而清除結(jié)核菌。本研究構(gòu)建了Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表達(dá)載體，為下一步結(jié)核新型疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞系

E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)公司。MTB H37Rv株由中國生物制品檢定所惠贈。pUC19-T載體、真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(-)由本室保存。293T細(xì)胞系凍存于本室。

1.2 試劑

Pyrobest DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH I、Hind III及DNA分子量marker均購自Takara大連公司。質(zhì)粒小量抽提試劑盒購于Promega公司。膠回收試劑盒購自Qiagen公司。脂質(zhì)體MegaTran 1.0購自O(shè)riGene Technologies公司。胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品。Ag85B、Esat6抗體為美國Abcam公司產(chǎn)品，HspX抗體購自美國Santa Cruz公司。HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體及羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 MTB基因組DNA提取

將生長3～4周L-J培養(yǎng)的結(jié)核桿菌刮下，90℃水浴15 min滅活細(xì)菌。4 000 r/min離心10 min。棄上清液，1×TE溶液重懸細(xì)菌。加入溶菌酶37℃振蕩2 h，再加入蛋白酶 K，37℃振蕩過夜。加入等體積Tris飽和酚，8 000 r/min離心10 min。取上清液，加入等體積酚：氯仿：異戊醇，再次離心后，無水乙醇沉淀，溶于100 μL TE中。

1.4 融合基因的擴(kuò)增及序列測定

根據(jù)已公布的 Ag85B、Esat6和 HspX基因的序列，設(shè)計引物，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為：

10 × buffer 2 μL，dNTP 2 μL，DNA 模板 1 μL，P1、P2 引物各 1 μL，高保真酶 0.2 μL，加水至 20 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 變性 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 3 min，共 30 個循環(huán)，再 72℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，回收DNA條帶，按說明用凝膠DNA純化試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物。取純化的 PCR產(chǎn)物與 pUC19-T載體，在T4 DNA連接酶催化下，于室溫連接2 h，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB平板(含氨芐青霉素100 mg/L)。用菌落PCR法挑選陽性克隆，接種于5 mL含氨芐青霉素的 LB中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，小量提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)酶切鑒定后，進(jìn)行序列測定，由Invitrogen公司完成。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用BamH I和 Hind III雙酶切 pUC19-Ag85BEsat6-HspX質(zhì)粒，獲得 Ag85B-Esat6-HspX融合基因，凝膠回收目的基因片段后再次克隆至同樣雙酶切的真核表達(dá)載體 pcDNA3.1(-)，轉(zhuǎn)化至 DH5a感受態(tài)細(xì)胞。用菌落PCR法挑選陽性克隆，接種于5 mL含100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取質(zhì)粒 DNA，用 BamHI和 HindIII雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定重組質(zhì)粒，并再次送Invitrogen公司進(jìn)行序列測定。

表1 H37Rv基因組中擴(kuò)增目的基因所需引物Tab.1 Primers for amplification of the genes from M.tuberculosis H37Rv

圖1 PCR擴(kuò)增融合基因Fig.1 Amplification of fusion gene by PCR

圖2 雙酶切鑒定重組質(zhì)粒Fig.2 Identification of recombinant plasmid by restriction enzyme digestion

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將2×105個/孔細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞數(shù)量達(dá)孔底60%～70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前用不含抗生素的DMEM培養(yǎng)液洗2次。取1 μg/μL的重組質(zhì)粒6 μL和2 μL MegaTran 1.0脂質(zhì)體混勻后緩慢加入到細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測。同時設(shè)不加任何處理的293T細(xì)胞作陰性對照。

1.7 Western blot檢測融合基因的表達(dá)

收集轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，PBS洗滌后，加入裂解緩沖液充分裂解，離心后收集上清液，行免疫印跡分析。

一抗分別為抗Ag85B的多克隆抗體、抗 Esat6的單克隆抗體和抗HspX的單克隆抗體。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體及羊抗兔IgG抗體(稀釋比例為 1∶10 000)。

2 結(jié)果

2.1 融合基因的擴(kuò)增

以MTB H37Rv基因組為模版，用合成的融合基因引物PCR擴(kuò)增，經(jīng)30個循環(huán)，可擴(kuò)增出與預(yù)計長度相等的1 800 bp左右片段(圖1)。將目的基因片段回收后再克隆入 pUC19-T載體，酶切鑒定后測序。測序結(jié)果證明所擴(kuò)增的融合基因序列完全正確(資料未顯示)。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將測序正確的pUC19-Ag85B-Esat6-HspX質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后與同樣處理的 pcDNA3.1(-)連接轉(zhuǎn)化，菌落PCR挑選陽性克隆，用BamHI和HindIII雙酶切后，可切出約1800 bp的片段(圖2)，再次測序結(jié)果證明克隆正確。陽性克隆命名為pcDNAAg85B-Esat6-HspX。

2.3 Western blot檢測融合蛋白表達(dá)

分別用抗Ag85B抗體、抗Esat6抗體和抗HspX的抗體與SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移的PVDF膜雜交。結(jié)果顯示：每個抗體均能檢測到大小為65 kDa的蛋白，與預(yù)期的蛋白大小一致。證明重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)(圖3)。

圖3 Western blot檢測融合蛋白的表達(dá)WT： wild type group，Mo： empty vector group，F(xiàn)U：Fusion protein groupFig.3 The expression of fusion protein by determined by Western blot

3 討論

DNA疫苗是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種新型疫苗。自1996年WHO將結(jié)核病DNA疫苗研究列為資助項目以來，其發(fā)展十分迅速。該疫苗有如下特點：①細(xì)胞內(nèi)生成的抗原易于被MHCI類和II類分子呈遞，可激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和輔助T淋巴細(xì)胞;②在一段時間里持續(xù)表達(dá)抗原，具有較強(qiáng)的免疫刺激作用;③操作技術(shù)簡單。結(jié)核DNA疫苗能夠很好地激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，是理想的結(jié)核疫苗形式。一些結(jié)核保護(hù)性抗原的DNA疫苗如Mtb8.4，Ag85B，ESAT6，Hsp65 和 MPT83 等都能誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

范雄林等［4］在小鼠模型上將不同結(jié)核保護(hù)性抗原的DNA疫苗進(jìn)行了免疫原性及保護(hù)效力的比較，發(fā)現(xiàn)Ag85B是比較理想的候選抗原。王清民等［5］對融合泛素的 Esat6核酸疫苗進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)該DNA疫苗不僅增強(qiáng)了細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且對結(jié)核感染提供了很好保護(hù)。此外，細(xì)胞因子不僅可作為免疫佐劑增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性還可以誘導(dǎo)DNA疫苗刺激機(jī)體后所產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方向。將細(xì)胞因子和抗原嵌合表達(dá)或共同導(dǎo)入體內(nèi)表達(dá)被證實有增強(qiáng)結(jié)核疫苗保護(hù)力的作用。師長宏等［6］構(gòu)建的人 IL-2與 Hsp65融合基因的 DNA疫苗，對感染結(jié)核的小鼠有很好的預(yù)防保護(hù)效果。

結(jié)核病疫苗目標(biāo)人群大體分為三類：正常人群(未感染結(jié)核分枝桿菌)、潛伏感染人群(已感染結(jié)核桿菌但未發(fā)病)、免疫低下人群(由于各種原因免疫功能低下)。隨著人們對潛伏感染的認(rèn)識，休眠期結(jié)核桿菌開始受到重視。休眠期結(jié)核桿菌為了適應(yīng)缺氧等惡劣生存環(huán)境部分基因表達(dá)上調(diào)。Leyten EM等［7］用 25種 DosR Regulon編碼的休眠期抗原進(jìn)行實驗，發(fā)現(xiàn)與結(jié)核病人相比，健康的結(jié)核菌素實驗陽性者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)能識別更多的休眠期抗原，并產(chǎn)生更強(qiáng)烈的IFN-γ反應(yīng)。HspX抗原可以被致敏的T細(xì)胞識別，刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ，具有細(xì)胞免疫和體液免疫原性。在健康的與肺結(jié)核患者密切接觸的家人(80%)和醫(yī)務(wù)工作者(90%)中，HspX具有明顯的T細(xì)胞刺激活性，比例明顯高于普通人群(50%)，提示HspX抗原具有免疫保護(hù)作用。

本研究將休眠期抗原與對數(shù)生長期抗原聯(lián)合使用，成功構(gòu)建了能夠在真核細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的重組質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究該融合蛋白的免疫原性及保護(hù)作用奠定了基礎(chǔ)。

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Construction of an Eukaryotic Expression Vector Encoding the Ag85B-Esat6-HspX Fusion Protein against Mycobacterium Tuberculosis

YUAN Wei，LIU Jiang-ning，XIANG Zhi-guang，ZHANG Li-fang，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

Objective To construct fused gene Ag85B-Esat6-HspX of Mycobacterium tuberculosis and investigate its expression in eukaryotic cells in vitro.Methods The gene encoding Ag85B，ESAT6 and HspX protein was amplified by PCR from genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv strain，and was inserted into cloning vector pUC19-T.After the sequence was confirmed，the fused gene was subcloned to eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-).After identified by restriction enzymec digestion and verified by DNA sequencing again，the recombinant plasmid pcDNA-Ag85B-Esat6-HspX was transfected into 293T cells with MegaTran 1.0.Western blot was used to detect the expression of goal protein.Result A 65 kDa protein was detected with specific antibodies.Conclusion The eukaryotic expression vector pcDNAAg85B-Esat6-HspX has been constructed successfully and the fusion protein could be expressed specifically in 293T cells.

Mycobacterium tuberculosis;Ag85B;Esat6;HspX

R521;R33

A

1671-7856(2011)04-0052-04

2010-09-28

10.3969/j.issn.1671-7856.2011.04.012

十一五重大專項支持(2009ZX1004-402)。

袁偉(1977-)，博士研究生。Email：docyw@sohu.com。

秦川，教授，博士生導(dǎo)師。Email：chuanqin@vip.sina.com。