柑橘皮黃酮純化前后抗氧化性比較研究

萬利秀，肖更生*，徐玉娟，蔣愛民，陳衛(wèi)東，陳于隴，吳繼軍

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

柑橘皮黃酮純化前后抗氧化性比較研究

萬利秀1,2，肖更生1,*，徐玉娟1，蔣愛民2，陳衛(wèi)東1，陳于隴1，吳繼軍1

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

比較9個品種柑橘皮黃酮對DPPH自由基的清除作用和對Fe3+的還原力，并研究大孔樹脂純化對其抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：不同品種柑橘皮黃酮的還原力和對DPPH自由基的清除作用均存在顯著差異(P＜0.05)，無論是純化前還是純化后，還原力和對DPPH自由基的清除作用最強(qiáng)的品種都是南豐橘，純化前后對Fe3+還原力的IC50分別為(0.166±0.002)mg/mL、(45.69±1.38) μg/mL，對DPPH自由基清除作用的IC50分別為(0.38±0.03)、(0.086±0.003)mg/mL。而福建蜜柑還原力和對DPPH自由基的清除作用最弱，純化前后對Fe3+還原力的IC50分別為(0.306±0.003)mg/mL、(97.80±1.06) μg/mL，對DPPH自由基清除作用的IC50分別為(0.88±0.02)、(0.281±0.003)mg/mL。純化后柑橘皮黃酮的抗氧化性顯著提高(P＜0.05)；新會陳皮黃酮純化后對DPPH自由基的清除作用是純化前的8.3倍，而江西柳橙黃酮純化后對DPPH自由基的清除作用為純化前的2.6倍；江西臍橙純化后還原力為純化前的4.5倍，江西柳橙純化后還原力為純化前的2.8倍。

柑橘；柑橘皮；黃酮；純化；抗氧化

柑橘皮中含有豐富的黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗動脈硬化、抗癌、抑菌、降血脂等[1-6]功效。我國是橘類生產(chǎn)大國，然而，用于加工的柑橘還不到10%，而且每年占柑橘加工量50%的皮渣被廢棄。不僅浪費(fèi)了資源，而且造成了巨大的環(huán)境污染[7]。廣東是我國柑橘的主要產(chǎn)地之一，許多名優(yōu)特色品種如廉江紅江橙、梅縣金柚、四會沙糖橘、德慶貢柑、平遠(yuǎn)臍橙、潮州蕉柑、陽春馬水橘等產(chǎn)品都具備優(yōu)良的品質(zhì)，深受消費(fèi)者的喜愛。但廣東柑橘多以鮮銷為主，加工業(yè)比較落后，因此，大力發(fā)展柑橘綜合加工業(yè)，充分、合理、綜合利用柑橘資源，對促進(jìn)柑橘產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有十分重要的意義[8]。目前，大孔樹脂被廣泛用于柑橘皮黃酮的純化，但純化對黃酮抗氧化性的影響的研究主要集中于單一品種，而綜合考察大孔樹脂純化對不同柑橘品種黃酮的抗氧化性的影響的研究并不多。因此，本研究以華南地區(qū)具有代表性的9個柑橘品種為研究對象，分析不同品種柑橘皮黃酮純化前和純化后的抗氧化活性差異，為其在食品和化妝品中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德慶皇帝柑、福建蜜柑、江西柳橙、江西臍橙、南方蜜橘、南豐橘、四會沙糖橘、江西蜜柑、新會陳皮橘均購于研究所附近農(nóng)貿(mào)市場。

蘆丁、橙皮苷、柚皮苷 美國Sigma公司；川陳皮素、橘皮素、4＇-OH-5,6,7,8-四甲基黃酮 實驗室制備；二苯代苦味?；?DPPH)自由基 日本東京化成工業(yè)株式會社；X-5大孔樹脂 南開大學(xué)化工廠；乙腈(色譜純) 德國默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏試驗設(shè)備有限公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；Agilent 1100系列高效液相色譜儀(由四元低壓泵、柱溫箱、二級管陣列檢測器、自動進(jìn)樣器及Chemstation工作站等組成，色譜柱為ZORBAX C18SB反向色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)) 美國Agilent 公司；DG180型中藥材粉碎機(jī) 浙江省瑞安市春海藥材器械廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

不同品種的柑橘洗滌后剝皮，于50℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎，60目過篩得柑橘皮粉末，備用。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制在蘇東林[9]的方法基礎(chǔ)上稍作修改，具體方法為：精確稱取干燥至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品11.2mg于燒杯中，加入30%的乙醇溶解后移至100mL容量瓶中，用30%的乙醇定容，即得0.112mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于7支試管中，加30%的乙醇至5mL，加5%亞硝酸鈉0.4mL，搖勻，靜置6min；加10%硝酸鋁0.4mL，搖勻，靜置6min；加4%氫氧化鈉4.0mL，30%乙醇定容至10.0mL，搖勻，靜置15min，在510nm波長處比色測定。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=11.933x－0.0011(R2=0.9999)。

1.3.3 總黃酮含量的測定

取1mL提取液按1.3.2節(jié)的方法測定510nm波長處的吸光度，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式(1)計算柑橘皮中總黃酮含量。

式中：ρ為查標(biāo)準(zhǔn)曲線所得黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)；m為樣品質(zhì)量/g。

1.3.4 柑橘皮黃酮的純化

柑橘皮黃酮的純化方法參考陳復(fù)生等[10]的方法稍作修改，準(zhǔn)確稱取柑橘皮粉200g，按料液比1:20加入95%乙醇于室溫浸泡過夜后，抽濾，減壓濃縮至無醇味，用石油醚萃取除去脂溶性成分，再用X-5大孔樹脂純化。純化工藝如下：上樣液質(zhì)量濃度0.57～1.14mg/mL，吸附和解吸速率均為1mL/min，解吸劑為50%乙醇。上樣后，先用蒸餾水洗至流出液無色，再用50%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，減壓濃縮回收乙醇，冷凍干燥后得純化后總黃酮樣品，備用。

1.3.5 對DPPH自由基清除能力的測定

對DPPH自由基的清除能力的測定在Zhang等[11]的基礎(chǔ)上稍做修改，準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品0.0039g，用無水乙醇溶解并定容至100mL，其溶液濃度為1×10-4mol/L。加樣于具塞試管中，搖勻反應(yīng)30min后，以3.5mL無水乙醇和0.5mL蒸餾水的混合液為參比，用紫外-可見分光光度計在517nm波長處分別測定吸光度。

式中：A樣品是3.5mL DPPH和0.5mL黃酮提取液在517nm波長處的吸光度；A0是3.5mL DPPH和0.5mL無水乙醇在517nm波長處的吸光度。

1.3.6 對 Fe3+還原力的測定

參照Ardestani等[12]的方法，1mL提取液加入2.5mL磷酸緩沖液(pH6.6，0.2mol/L)及2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的K3Fe(CN)6，于50℃水浴中反應(yīng)20min后迅速冷卻，并加入2.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸(TCA)溶液，以3000 r/min 離心10min后取上清液2.5mL，并加入2.5mL蒸餾水及0.5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的FeCl3溶液，混合均勻，10min后，測定波長700nm處的吸光度。

1.3.7 高效液相色譜條件

ZORBAX C18SB反向色譜柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相為2%乙酸水溶液和乙腈，梯度洗脫：0～5min，乙腈為5%～10%；5～35min，乙腈為10%～50%；35～40min，乙腈為50%～80%；40～45min，乙腈為80%；45～55min，乙腈為80%～5%。流速1.0mL/min；檢測波長為330nm；柱溫為25℃，自動進(jìn)樣器溫度為4℃，進(jìn)樣量20μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘皮黃酮純化前后對DPPH自由基的清除作用

圖1 柑橘皮黃酮純化前對DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activities of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels at varying concentrations

圖2 柑橘皮黃酮純化后對DPPH自由基的清除作用Fig.2 DPPH radical scavenging activities of purified flavonoids from different varieties of citrus peels at varying concentrations

由圖1、2可知，柑橘皮提取物對DPPH自由基的清除作用表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。以提取物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對DPPH自由基的清除率為縱坐標(biāo)，用Excel軟件處理數(shù)據(jù)得到18個線性方程，從而計算出不同品種柑橘皮黃酮對DPPH自由基的清除作用的IC50，并用SAS 8.1 Duncan 多重比較法得出各品種抗氧化作用的差異性，結(jié)果如表1、2所示。

由表1、2可知，純化前，除福建蜜柑與江西臍橙；江西蜜柑、江西柳橙和四會沙糖橘之間不存在顯著性差異外，不同品種柑橘皮黃酮對DPPH自由基的清除作用差異顯著(P＜0.05)，南豐橘對DPPH自由基的清除作用的IC50最小，僅為(0.38±0.03)mg/mL，福建蜜柑對DPPH自由基的清除作用的IC50最大，為(0.88±0.02)mg/mL，是南豐橘的2.3倍，即南豐橘對DPPH自由基的清除作用是福建蜜柑的2.3倍；純化后，除福建蜜柑和其他品種之間存在差異外，其他品種柑橘皮黃酮對DPPH自由基的清除作用均無明顯差異；無論是純化前還是純化后，南豐橘黃酮對DPPH自由基的清除作用都最大，福建蜜柑黃酮最小。食物的抗氧化能力，主要取決于食物中的抗氧化物含量[13]。不同品種柑橘皮中黃酮含量不同，因此表現(xiàn)出來的抗氧化能力差別比較大。對于同一種柑橘品種，柑橘皮黃酮純化前后對DPPH自由基的清除作用差異顯著(P＜0.05)，新會陳皮黃酮純化前對DPPH自由基的清除作用的IC50是純化后的8.3倍，即純化后新會陳皮黃酮對DPPH自由基的清除作用增加為純化前的8.3倍；而江西柳橙黃酮純化前對DPPH自由基的清除作用的IC50僅為純化后的2.6倍，即純化后江西柳橙黃酮對DPPH自由基的清除作用增加為純化前的2.6倍。陸英等[14]比較了紅薯葉黃酮純化前后的抗氧化性差異，紅薯葉黃酮粗提產(chǎn)品與純化產(chǎn)品的IC50分別為3.06×10-2、3.58×10-3mg/mL，純化產(chǎn)品清除DPPH自由基明顯強(qiáng)于粗提產(chǎn)品，與本研究結(jié)果一致。大孔樹脂吸附后可以除去初提物中大量的糖類、無機(jī)鹽、黏液質(zhì)等吸潮成分，不僅增加了產(chǎn)品的穩(wěn)定性，還可使藥效成分高度富集，雜質(zhì)少，從而抗氧化活性增強(qiáng)[15]。

表1 柑橘皮黃酮純化前對DPPH自由基清除作用的IC50Table 1 IC50 for DPPH radical scavenging activity of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels

表2 柑橘皮黃酮純化后對DPPH自由基清除作用的IC50Table 2 IC50 for DPPH radical scavenging activity of purified flavonoids from different varieties of citrus peels

2.2 柑橘皮黃酮純化前后的高效液相色譜圖

6種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品及純化前后黃酮溶液(1mg/mL)分別用1.3.7節(jié)方法進(jìn)行測定，得到其液相色譜圖如圖3、4所示。

圖3 9種柑橘品種柑橘皮中黃酮類化合物純化前的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels

圖4 9種柑橘品種柑橘皮中黃酮類化合物純化后的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of purified flavonoids from different varieties of citrus peels

由圖3可知，不同品種柑橘皮中，不僅黃酮含量不同，黃酮種類也存在差異。黃酮含量較高的品種有德慶皇帝柑、南豐橘、四會沙糖橘和新會陳皮；德慶皇帝苷中主要黃酮為川陳皮素和橘皮素，福建蜜柑中主要黃酮為柚皮苷，江西柳橙中主要黃酮為橙皮苷、柚皮苷、4＇-OH-5,6,7,8-四甲基黃酮和川陳皮素，江西臍橙中主要黃酮為橙皮苷、柚皮苷、4＇-OH-5,6,7,8-四甲基黃酮和川陳皮素，南方蜜橘中主要黃酮為橙皮苷、柚皮苷和川陳皮素，南豐橘中主要黃酮為川陳皮素和橘皮素，四會沙糖橘中主要黃酮為川陳皮素和橘皮素，江西蜜柑中主要黃酮為柚皮苷、橙皮苷和川陳皮素，新會陳皮中主要黃酮為川陳皮素和橘皮素。

通過比較純化前后柑橘皮黃酮的液相圖3和圖4可以看出，大孔樹脂純化后雜質(zhì)少，有效成分高度富集，因此，用大孔樹脂對柑橘皮黃酮進(jìn)行純化是提高產(chǎn)品純度及其抗氧化性的有效途徑之一。

2.3 柑橘皮黃酮純化前后還原力

由圖5、6可知，柑橘皮提取物還原力表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。以提取物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，還原力為縱坐標(biāo)，用Excel 軟件處理數(shù)據(jù)得到18個線性方程，從而計算出不同品種柑橘皮黃酮對Fe3+的IC50，并用SAS 8.1 Duncan 多重比較法得出各品種抗氧化作用的差異性，結(jié)果如表3、4所示。

圖5 柑橘皮黃酮純化前還原力Fig.5 Reducing power of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels

圖6 柑橘皮黃酮純化后還原力Fig.6 Reducing power of purified flavonoids from different varieties of citrus peels

表3 柑橘皮黃酮純化前對Fe3+的IC50Table 3 IC50 for reducing power of unpurified flavonoids from different varieties of citrus peels

表4 柑橘皮黃酮純化后對Fe3+的IC50Table 4 IC50 for reducing power of purified flavonoids from different varieties of citrus peels

由表3、4可以看出，純化前，除福建蜜柑和江西臍橙還原力與其他品種之間存在差異外，其他品種之間差異不顯著；而純化后，福建蜜柑和所有品種之間均存在顯著差異(P＜0.05)；無論是純化前還是純化后，還原力最高的品種都是南豐橘，還原力最低的品種是福建蜜柑；黃酮純化前后還原力也存在顯著差異，江西臍橙純化前還原力的IC50為純化后的4.5倍，即純化后江西臍橙黃酮還原力為純化前的4.5倍，江西柳橙還原力的IC50為純化后的2.8倍，純化后江西柳橙黃酮還原力為純化前的2.8倍。

3 結(jié) 論

3.1 不同品種柑橘皮黃酮的抗氧化活性不同，無論是純化前還是純化后，抗氧化性最強(qiáng)的品種均為南豐橘，而抗氧化性最低的品種為福建蜜柑。

3.2 大孔樹脂純化前后黃酮的抗氧化性也存在差異，純化后黃酮的抗氧化性明顯高于純化前, 新會陳皮黃酮純化后對DPPH自由基的清除作用是純化前的8.3倍，而江西柳橙黃酮純化后對DPPH自由基的清除作用為純化前的2.6倍；江西臍橙純化后還原力為純化前的4.5倍，江西柳橙純化后還原力為純化前的2.8倍。

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A Comparative Study of Antioxidant Activity of Flavonoids from Citrus Peel before and after Purification

WAN Li-xiu1,2，XIAO Geng-sheng1,*，XU Yu-juan1，JIANG Ai-min2，CHEN Wei-dong1，CHEN Yu-long1，WU Ji-jun1
(1. Sericulture and Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China；2. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

In this study, DPPH radical scavenging activities and reducing powers of flavonoids from 9 different varieties of citrus peel were compared. Meanwhile, the effect of macroporous resin purification on these antioxidant activities was studied. The results indicated that both DPPH radical scavenging activities and reducing powers of flavonoids differed significantly among 9 varieties of citrus peel (P < 0.05). Both crude and purified flavonoids from Nanfeng citrus peel revealed the strongest DPPH radical scavenging activity and reducing power, with median inhibitory concentrations (IC50) of (0.38 ± 0.03) mg/mL and (0.086 ±0.003) mg/mL for scavenging DPPH radicals, respectively and reducing powers of for flavonoids from Nanfengju before and after purification were (0.166 ± 0.002) mg/mL and (45.69 ± 1.38)μg/mL, respectively. On the other hand, flavonoids from Fujian sweet mandarin peel revealed the weakest DPPH radical scavenging activity and reducing power. The IC50 values for DPPH radical scavenging activity of flavonids from Fujian sweet mandarin peel before and after purification were (0.88 ± 0.02) mg/mL and (0.281 ± 0.003) mg/mL, and those for reducing ferric ion before and after purification were (0.306±0.003) mg/mL and(97.80 ± 1.06)μg/mL, respectively. Therefore, macroporous resin purification could result in a significant enhancement in antioxidant activities of flavonoids from citrus peel. The DPPH radical scavenging activities of flavonoids from Xinhui mandarin peel and Jiangxi navel orange peel revealed 8.3- and 2.6-fold enhancement after purification, and the reducing powers of flavonoids from Jiangxi navel orange peel and Jiangxi Liucheng orange peel exhibited 4.5- and 2.8-fold increase after purification,respectively.

citrus；citrus peel；flavonoids；purification；antioxidation

O623.54

A

1002-6630(2011)05-0087-05

2010-05-21

廣東省關(guān)鍵領(lǐng)域重點突破項目(2007A020901004)

萬利秀(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：mo_wlx2000@yahoo.com.cn

*通信作者：肖更生(1965—)，男，研究員，碩士，研究方向為農(nóng)產(chǎn)品深加工。E-mail：gshxiao@yahoo.com.cn