富硒酸奶發(fā)酵劑的制備及其發(fā)酵性能研究

劉 冬，葉 明,*，葉玉娥，岳 鵬，王 瑾，胡必騰

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽曦強(qiáng)乳業(yè)集團(tuán)有限公司，安徽 淮北 235000)

富硒酸奶發(fā)酵劑的制備及其發(fā)酵性能研究

劉 冬1，葉 明1,*，葉玉娥1，岳 鵬2，王 瑾2，胡必騰1

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.安徽曦強(qiáng)乳業(yè)集團(tuán)有限公司，安徽 淮北 235000)

以青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05為原料制備富硒酸奶發(fā)酵劑。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合富硒條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳富硒條件為低聚果糖1%、Se4+質(zhì)量濃度6.83μg/mL、初始pH6.0、青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05接種比例2:1、接種量3.8%、培養(yǎng)溫度42℃、培養(yǎng)24h加硒、培養(yǎng)時(shí)間60h。在上述條件下，青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合菌體含硒量為(551±4.6)μg/g，硒轉(zhuǎn)化率為(42.2±3.6)%。利用青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05制備的富硒酸奶發(fā)酵劑具有良好的發(fā)酵性能，用其發(fā)酵制備富硒酸奶，其有機(jī)硒含量為(17±4.5)μg/kg。

青春雙歧桿菌；干酪乳桿菌；富硒；酸奶

硒(Se)是人和動(dòng)物機(jī)體必需的微量元素之一[1]，具有抗癌、防止克山病、抗氧化、延緩衰老、提高機(jī)體免疫力、改善心血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎和重金屬毒害等作用[1-2]。中國營養(yǎng)學(xué)會推薦正常人體硒攝入量為60～200μg/d，而我國13省市營養(yǎng)調(diào)查顯示，硒日攝入量普遍不足，成人硒攝入量僅為26.36μg/d[3]。硒在形態(tài)上可分為有機(jī)硒和無機(jī)硒，有機(jī)硒較無機(jī)硒吸收利用率高且副作用小，因此將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，并以有機(jī)硒改善人體硒攝入量不足具有重要意義。學(xué)者們研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有良好的富硒能力[4-5]，可作為有機(jī)硒的良好來源，對本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏的多種益生菌株進(jìn)行富硒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05具有較強(qiáng)的富硒能力。本實(shí)驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用Box-Behnken試驗(yàn)對青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合富硒條件進(jìn)行優(yōu)化，并將其制備成富硒酸奶發(fā)酵劑發(fā)酵復(fù)原乳生產(chǎn)富硒酸奶。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青春雙歧桿菌ys01、干酪乳桿菌ys05本實(shí)驗(yàn)室從市售酸奶中分離保藏；酸奶發(fā)酵劑Ⅰ 嘉吉亞太食品系統(tǒng)(北京)有限公司；酸奶發(fā)酵劑Ⅱ 北京川秀科技有限公司。

MRS培養(yǎng)基[6]；MRS改良培養(yǎng)基：于MRS培養(yǎng)基中添加0.05%半胱氨酸鹽酸鹽121℃滅菌15min；全脂乳培養(yǎng)基：復(fù)原乳92%、蔗糖6%、低聚異麥芽糖1%、酪蛋白酸鈉1%、Na2SeO340μg/kg。

5.0 μg/mL硒標(biāo)準(zhǔn)溶液、5g/L 3,3-氨基聯(lián)苯胺溶液、5g/L EDTA-2Na、2mol/L硝酸等(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

馬弗爐；752型紫外-可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；NDJ-7型黏度計(jì) 廈門中村光學(xué)儀器廠；CO2培養(yǎng)箱 日本三洋公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；CT14RD型冷凍離心機(jī) 上海天美科學(xué)儀器有限公司；MWCO 3500透析袋 合肥博美科貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌體富硒和菌體含硒量測定

菌體富硒：將亞硒酸鈉配成一定濃度的溶液，滅菌備用。將亞硒酸鈉溶液按比例加入200mL改良MRS液體培養(yǎng)基中，搖勻，接入青春雙歧桿菌ys01、干酪乳桿菌ys05及其混合菌懸液。37℃培養(yǎng)72h，然后將培養(yǎng)物在4℃、10000r/min條件下離心10min，棄上清液用去離子水洗滌3次，于60℃干燥至質(zhì)量恒定。

菌體含硒量測定：菌體處理參考Sanchez-Segarra等[7]報(bào)道的方法進(jìn)行，菌體含硒量用3,3-氨基聯(lián)苯胺比色法[2]測定。

1.3.2 單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化菌體富硒條件

對青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05富硒進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察硒質(zhì)量濃度(3、6、9μg/mL)、加硒時(shí)間(0、8、16、24、32h)、培養(yǎng)時(shí)間(36、48、60、72、84h)、培養(yǎng)溫度(37、39、41、42、43℃)、初始pH值(5.0、6.0、7.0)、接種比例(青春雙歧桿菌ys01:干酪乳桿菌ys05=1:1、2:1、3:1、2:3、1:2)、接種量(菌懸液質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、3%、5%)、低聚糖及其含量(分別0%、0.5%、1%、1.5%的低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖、低聚異麥芽糖代替液體改良MRS培養(yǎng)基中等量葡萄糖)對菌體含硒量的影響，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，并進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)取其平均值。用Design Expert 7.0軟件對Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合求解二次多項(xiàng)式模型Y=β0＋α1A＋β1B＋γ1C＋α1β1AB＋α1γ1AC＋β1γ1BC＋α11A2＋β11B2＋γ11C2，采用F檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，評價(jià)二次多項(xiàng)式模型及其回歸系數(shù)的顯著性。

1.3.3 富硒發(fā)酵劑制備及其發(fā)酵性能測定

富硒發(fā)酵劑制備：將青春雙歧桿菌ys01及干酪乳桿菌ys05混合富硒培養(yǎng)物置于50mL無菌離心管中在4℃，10000r/min條件下冷凍離心10min，用一定體積的復(fù)原乳(108℃滅菌20min)將菌體洗下并調(diào)整至適宜濃度(約4×108CFU/mL)即得酸奶發(fā)酵劑，按2%的接種量接于全脂乳培養(yǎng)基(市售酸奶發(fā)酵劑Ⅰ、Ⅱ分別為對照1和2)42℃發(fā)酵一定時(shí)間，于4℃冰箱中冷藏12h后測其發(fā)酵性能。

發(fā)酵性能測定：酸度、pH值和黏度參考甘伯中等[8]的方法測定；活菌數(shù)參考Tabasco等[6]的報(bào)道進(jìn)行，每隔0.5h觀察凝乳情況，記錄凝乳時(shí)間，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，其結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

1.3.4 富硒酸奶感官評價(jià)和理化指標(biāo)測定

富硒酸奶感官品評和理化指標(biāo)測定參考GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)酵乳》[9]進(jìn)行。

富硒酸奶含硒量測定：取10g酸乳加入截留分子質(zhì)量為3500D透析袋中，并置于去離子水中透析至無硒析出時(shí)，將酸奶在4℃、10000r/min條件下，離心10min，棄上清液用去離子水洗滌3次，60℃干燥至質(zhì)量恒定。然后參考Sanchez-Segarra等[7]的方法(略作修改)，將樣本于460℃的馬弗爐中焚燒15h，冷卻后灰分用2mL 2mol/L的硝酸漂白，然后在電爐上干燥并在460℃馬弗爐中保持1h。以5mL 2mol/L的硝酸回收灰分，用0.1mol/L的硝酸定容至25mL，以3,3-氨基聯(lián)苯胺比色法[2]測定硒含量。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，其結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體富硒條件單因素和Box-Behnken試驗(yàn)

單因素試驗(yàn)表明，適宜的富硒條件為硒質(zhì)量濃度6μg/mL、培養(yǎng)24h時(shí)加硒、培養(yǎng)時(shí)間60h、培養(yǎng)溫度42℃、初始pH6.0、青春雙歧桿菌ys01:干酪乳桿菌ys05=2:1、接種量3%、低聚果糖1%。

參考單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇接種量、硒質(zhì)量濃度及pH值為主要影響因素，以菌體含硒量為指標(biāo)進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。利用Design Expert 7.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果如表2所示。對菌體含硒量的影響程度從大到小依次為接種量、硒質(zhì)量濃度和p H值，回歸方程為：

Y=543.80＋14.00A＋10.75B＋2.0C＋14.00AB＋19.00AC－20.50BC－45.40A2－29.90B2－24.90C2(1)

對二次多項(xiàng)式模型回歸系數(shù)和試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(表2)，F(xiàn)model＝78.34，概率Pmodel＜0.0001，表明方程(1)顯著；失擬項(xiàng)概率Plose=0.2722＞0.05，即無失擬因素存在；決定系數(shù)R2=0.9902，說明方程(1)能較好地反映所選參數(shù)與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系[10]。此外，變異系數(shù)(CV)為1.15%＜5%即方程(1)具有良好的重現(xiàn)性[10]，R2Pred=0.9014與R2Adj=0.9775較好的吻合。根據(jù)方程(1)選其中兩因素為變量，另一因素位于中心點(diǎn)作圖1和2。由圖1可見，無論是隨著硒質(zhì)量濃度的增加，還是隨著接種量的增加，菌體含硒量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。類似的隨pH值增加，菌體含硒量也呈現(xiàn)同樣的趨勢(圖2)。由表2可知，硒質(zhì)量濃度、接種量和pH值3因素的交互項(xiàng)對菌體含硒量均具有極顯著(PAB＜0.01，PBC＜0.01，PAC＜0.01)的影響。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

表2 二次多項(xiàng)式模型回歸系數(shù)估計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 2 Estimation of regression coefficients for the quadratic polynomial model and variance analysis of experimental results

圖1 接種量和硒質(zhì)量濃度交互作用響應(yīng)面Fig.1 Response surface plot illustrating the interative effects of inoculation amount and selenium concentration on the content of selenium in yogurt

圖2 硒質(zhì)量濃度和初始pH值交互作用響應(yīng)面Fig.2 Response surface plot illustrating the interative effects of selenium concentration and initial pH on the content of selenium in yogurt

此外，由圖1、2還可以看出，方程(1)存在最大值點(diǎn)。利用方程(1)計(jì)算得到菌體最高含硒量為546.337 μg/g，此時(shí)接種量、硒質(zhì)量質(zhì)量濃度和pH值分別為3.79%、6.83μg/mL和6.02。在上述條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合菌體含硒量為(551±4.6)μg/g，硒轉(zhuǎn)化率為(42.2±3.6)%。

2.2 富硒酸奶與發(fā)酵劑性能

表3 發(fā)酵劑的發(fā)酵性能(n=3)Table 3 Fermentation performance of yogurt starter (n=3)

以上述富硒發(fā)酵劑發(fā)酵復(fù)原乳制備富硒酸奶，發(fā)酵劑主要性能見表3，富硒酸奶發(fā)酵劑的凝乳時(shí)間(7.5±0.5)h，酸度、pH值、黏度和活菌數(shù)分別為(80±3)°T、(4.6±0.3)、(119±8)mPa·s和(4.0±0.3)×108CFU/mL，與市售酸奶發(fā)酵劑(對照1和2)相比，富硒酸奶發(fā)酵劑的酸度和黏度性能稍低，pH值、凝乳時(shí)間和活菌數(shù)基本一致，表明該酸奶發(fā)酵劑具有良好的發(fā)酵性能，可作為一種新型酸奶發(fā)酵劑使用。

2.3 富硒酸奶感官和理化指標(biāo)

富硒酸奶的感官評價(jià)和理化指標(biāo)見表4和5。富硒酸奶呈乳白色有光澤、奶香純正、酸甜可口、組織細(xì)膩均一且無乳清析出(表4)。此外，富硒酸奶脂肪、非脂乳固體、蛋白質(zhì)等主要理化指標(biāo)(表5)均符合GB 19302—2010[9]的相關(guān)規(guī)定，其有機(jī)硒含量為(17±4.5)μg/kg。

表4 酸奶感官評價(jià)Table 4 Sensory evaluation of yogurt

表5 酸奶理化指標(biāo)(n=3)Table 5 Physical and chemical indexes of yogurt (n=3)

3 結(jié)論與討論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合富硒條件進(jìn)行優(yōu)化，菌體含硒量回歸方程：Y=543.80＋14.00A＋10.75B＋2.0C＋14.00AB＋19.00AC－20.50BC－45.40A2－29.90B2－24.90C2，其最佳富硒條件為改良MRS培養(yǎng)基中Se4+質(zhì)量濃度6.83μg/mL、低聚果糖1%、初始pH6.0、青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05接種比例2:1、接種量3.8%、培養(yǎng)24h加硒、培養(yǎng)溫度42℃、培養(yǎng)時(shí)間60h。在此條件下，青春雙歧桿菌ys01和干酪乳桿菌ys05混合菌體含硒量(551±4.6)μg/g，硒轉(zhuǎn)化率(42.2±3.6)%，與副干酪乳桿菌[4]相比菌體含硒量約提高144μg/g，較動(dòng)物雙歧桿菌01[5]硒轉(zhuǎn)化率約提高14.1%，但較其菌體含硒量[(898±74)μg/g]低。

本研究制備的富硒酸奶發(fā)酵劑，具有良好的發(fā)酵性能，用其發(fā)酵復(fù)原乳制得有機(jī)硒含量(17±4.5)μg/kg的優(yōu)質(zhì)富硒酸奶。與魏小雁等[11]研制的直投式酸奶發(fā)酵劑相比，該富硒酸奶發(fā)酵劑有機(jī)硒含量高且發(fā)酵性能較好，但其酸度和黏度比市售酸奶發(fā)酵劑Ⅰ和Ⅱ稍低，原因可能是市售酸奶發(fā)酵劑中的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌產(chǎn)酸量高，同時(shí)其胞外多糖具有增稠和膠凝作用，因此增加了酸奶的黏度[11-13]。本研究制備的富硒酸奶，奶香純正、酸甜可口、細(xì)膩均一，主要理化指標(biāo)均符合GB 19302—2010[9]的相關(guān)規(guī)定，且富含有機(jī)硒，是補(bǔ)充有機(jī)硒的良好食源。本研究為富硒酸奶的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定參考。

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Development and Fermentation Performance Evaluation of A Selenium-enriched Yogurt Starter and Evaluation

LIU Dong1，YE Ming1,*，YE Yu-e1，YUE Peng2，WANG Jin2，HU Bi-teng1
(1. College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Anhui Xiqiang Dairy Group Co. Ltd., Huaibei 235000, China)

Bifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 were used as the materials to prepare a seleniumenriched yogurt starter. The optimal conditions for selenium enrichment withBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 were explored by single-factor and Box-Behnken design methods. The optimal conditions for selenium enrichment were fructooligosaccharide of 1%, Se4+concentration of 6.83 μg/mL, initial pH 6.0, inoculation ratio betweenBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 of 2:1, inoculation amount of 3.8%, incubation temperature of 42 ℃, selenium addition time point at the 24 h of cultivation, and cultivation period of 60 h. Under the optimal conditions, the content of selenium in the mixture ofBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 was (551 ± 4.6)μg/g and the conversion rate of selenium was (42.2 ± 3.6)%. In addition, an excellent fermentation performance of selenium-enriched yogurt starter prepared byBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 was achieved. The content of organic selenium in the yogurt prepared by this starter was (17 ± 4.5)μg/kg.

Bifidobacterium adolescentis；Lactobacillus casei；selenium enrichment；yogurt

TS252.54

A

1002-6630(2011)06-0076-04

2010-05-23

安徽省年度科研計(jì)劃項(xiàng)目(09020303079)；安徽省產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目(09-92432227)

劉冬(1982—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：liudong1595693@163.com

*通信作者：葉明(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與應(yīng)用。E-mail：yeming123@sina.com