組胺檢測試紙的研制

王 麗，吳 強，桑宏慶，劉賢進

(1.安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽鳳陽233100;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部食品安全監(jiān)控重點實驗室，江蘇南京210014;3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350000)

組胺檢測試紙的研制

王 麗1，2，吳 強3，桑宏慶1，劉賢進2，*

(1.安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院，安徽鳳陽233100;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部食品安全監(jiān)控重點實驗室，江蘇南京210014;3.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350000)

利用比色法的原理制備了組胺檢測試紙，對顯色體系進行了篩選，對試紙制備的條件進行了研究，并制備了標準比色卡，通過與國標法進行比較對試紙進行了評價。實驗結(jié)果表明:最佳的顯色體系為對氨基苯磺酸鈉和亞硝酸鈉溶液，兩者的最佳濃度分別為40g/L和400g/L，兩者的最佳體積比為10∶0.3，最佳試紙紙材為超厚濾紙，最佳浸泡時間為20min，最佳干燥條件為60℃在干燥箱中干燥，試紙的檢出限為4μg/mL，試紙檢測結(jié)果與國標法檢測結(jié)果相吻合，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好。

試紙，組胺，檢測

組胺(Histam ine，HA)，又名組織胺，分子式C5H9N3，化學(xué)名 4(5)－(2－氨乙基) 咪唑［1］。組氨為一種生物胺，它的前體物質(zhì)是組胺酸，組氨酸是蛋白質(zhì)經(jīng)過分解后的一種氨基酸。水產(chǎn)品中組胺主要是組氨酸在莫根氏變形桿菌、組胺無色桿菌等微生物和組氨酸脫羧酶的共同作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)產(chǎn)生的［2］。組胺有毒性，可以降低血壓，當(dāng)有機體攝入組胺超過100mg(或每千克體重1.5mg)時，即可引起過敏性食物中毒［3］。在生物胺引起的食品安全問題中，組胺對人類的健康的影響最大［4］。如2002年9月，中山市某公司2004年3月1日廈門市某公司的食堂曾發(fā)生過組胺食物中毒事件［5－6］。歐美及我國對部分食品中組胺含量做了限量要求:美國FDA要求進口水產(chǎn)品組胺不得超過50mg/kg;歐盟規(guī)定鯖科魚類中組胺含量不得超過100mg/kg，其它食品中的組胺含量不得超過100～800mg/kg;我國規(guī)定鮐魚中組胺含量不得超過 300mg/kg［5，7］。目前，國內(nèi)外對組胺的測定方法有偶氮試劑比色法、熒光分光光度法、HPLC法、氣相色譜法、薄層色譜法和生物學(xué)法等。這些方法所用試劑、器皿較多，操作繁瑣、費時，大型儀器價格昂貴。試紙法是把化學(xué)反應(yīng)從試管或化學(xué)器皿里移到濾紙上進行，利用迅速產(chǎn)生明顯顏色的化學(xué)反應(yīng)進行目視定性或半定量分析［8－9］。試紙法攜帶方便、操作簡單、檢測速度快、價格便宜、對操作員要求低、檢測可在室溫下順利進行。目前亞硝酸鹽檢測試紙、重金屬Al3+檢測試紙、牛奶摻假檢驗試紙、碘鹽中碘含量試紙、轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物檢測試紙、甲醛檢測試紙已有報道［8，10，11－14］。但國內(nèi)外組胺檢驗試紙尚未見報道，因此我們通過實驗研制了檢測組胺的試紙，快速檢測食品尤其是水產(chǎn)品中組胺。

表1 不同顯色體系的顯色效果

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

定性快速濾紙101、定性中速濾紙102、定性慢速濾紙103、定量快速濾紙201、定量快速濾紙202、定量慢速濾紙203、加厚濾紙、超厚濾紙 杭州富陽特種紙業(yè)有限公司;魚 鳳陽菜市場;對氨基苯磺酸納、三氯乙酸、亞硝酸鈉、正戊醇、氫氧化鈉、鹽酸、無水碳酸納、對硝基苯胺 均為分析純;磷酸組胺 生物試劑。

721 分光光度計 上海第三分析儀器廠;HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國勝實驗儀器廠;FC204電子分析天平 上海精科儀器廠;101C－3B電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海市實驗儀器總廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 顯色體系的篩選 顯色體系A(chǔ):采用GB/T5009.45－1996 方法［15］，使用的對硝基苯胺與亞硝酸鈉為偶氮試劑，同時分別取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00m L 20μg/m L組胺標準溶液于10m L比色管中并用1mol/L HCl補足至1.0m L。各比色管中加15%碳酸鈉溶液 3m L，偶氮試劑 3m L，加水至10.0m L，混勻。

顯色體系B［16］:另外取一組上述同樣的一系列組胺溶液，分別加入5g/L對氨基苯磺酸鈉溶液5.0m L，0.3m L 50g/L亞硝酸鈉溶液，混勻。

放置10m in后對比觀察顯色體系A(chǔ)和顯色體系B在比色管中顯色反應(yīng)，在兩者中選擇顯色速度快、顯色穩(wěn)定、色階變化明顯的作為試紙浸泡液。

1.2.2 試紙制備

1.2.2.1 基本實驗方法 實驗步驟:a.配制成顯色劑溶液;b.將濾紙浸泡到盛有顯色劑溶液的平皿中一定時間后取出;c.將吸附有顯色劑的試紙干燥并剪裁成規(guī)格統(tǒng)一0.5×3cm長條。

1.2.2.2 試紙制備條件的選擇 根據(jù)上述的基本實驗方法，根據(jù)組胺在試紙上反應(yīng)的速度、色階變化、顯色穩(wěn)定性、均勻性等指標來確定最佳的試紙制備條件。根據(jù)其所顯顏色深淺規(guī)定標準如下:

深紅色:+++;淺紅色:++;微紅色:+;橙黃色:－;微黃色:－ －。

1.2.3 標準比色卡的制備 將制作的試紙與系列濃度組胺溶液反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)顏色的深淺及色階的變化印刷制作標準比色卡。1.2.4 試紙的評價

1.2.4.1 試紙檢出限實驗 將制作的試紙與系列濃度組胺溶液反應(yīng)確定試紙的最低檢測限度，對試紙作出評價。

1.2.4.2 試紙的校正性實驗 試紙法同國標方法反復(fù)的檢測同一樣品來對試紙進行校正性實驗。國標法測定樣品參照 GB/T5009.45－1996［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 顯色體系的選擇

將顯色劑A和B分別與同一濃度組胺在比色管中進行反應(yīng)，通過肉眼觀察顯色效果，結(jié)果如表1所示。

從表1可看出，顯色體系A(chǔ)和顯色體系B與組胺溶液反應(yīng)顯色速度都較快，但顯色體系B顏色較深，色階變化比較明顯。因此確定對氨基苯磺酸鈉和亞硝酸鈉為試紙的浸泡溶液。

2.2 試紙制備條件的選擇

2.2.1 顯色劑濃度的選擇 將定性中速濾紙浸泡在不同濃度的對氨基苯磺酸鈉和亞硝酸鈉的混合液中，兩者體積比為10∶0.3，浸泡時間20min，室溫晾干后與50μg/m L組胺溶液反應(yīng)，通過觀察在試紙上反應(yīng)效果來確定浸泡試劑的最佳濃度，結(jié)果如表2所示。

表2 顯色劑濃度對試紙效果的影響

實驗發(fā)現(xiàn)1～3號試紙顯色為橙黃色，4～5號顯色為微紅色，但4號顯色速度、穩(wěn)定性、均勻性均優(yōu)于5號。所以選擇40g/L的對氨基苯磺酸鈉溶液和400g/L的亞硝酸鈉溶液的混合液作為試紙的浸泡液。

2.2.2 顯色劑最佳配比的選擇 分別將40g/L的對氨基苯磺酸鈉溶液和400g/L的亞硝酸鈉溶液按體積比為 10∶0.1、10∶0.3、10∶0.6 混合，分別將定性中速濾紙在其中進行浸泡20m in，取出在室溫條件晾干后與50μg/m L組胺溶液反應(yīng)，結(jié)果如表3所示。

表3 顯色劑配比對試紙的影響

實驗可以看出三種不同配比溶液中浸泡的試紙與組胺顯色反應(yīng)速度均較快，但在配比為10∶0.3的混合液中浸泡的試紙顯色程度明顯，而另外兩者與組胺反應(yīng)的顏色暗淡，不容易辨別。所以兩種顯色劑體積比例為10∶0.3為宜。

2.2.3 試紙用紙的選擇 將各類不同紙材的紙張分別浸泡到40g/L的對氨基苯磺酸鈉溶液和400g/L的亞硝酸鈉溶液的混合液中，兩者體積比為10∶0.3，浸泡時間20m in，室溫晾干后與50μg/m L組胺溶液反應(yīng)，結(jié)果如表4所示。

由表4看出，在同一浸泡時間條件下，所有不同材質(zhì)的紙張中，超厚濾紙顯色速度最快，與加厚型濾紙顯色均最明顯，其中稿紙在顯色速度、顯色均勻程度、顯色程度上均最差。所以選定超厚濾紙為檢測組胺試紙的材料，其它的濾紙由于吸附能力較弱，故不予采用。

表4紙材對試紙效果的影響

試紙紙張的選擇需要滿足容易吸附顯色劑，干燥時間短等要求，另外各種物質(zhì)在不同試紙上的擴散速度、吸附程度是不同的［17］。實驗證明用超厚濾紙作為組胺試紙的材料，因為該試紙材質(zhì)致密，容易吸附顯色劑，且吸附量較大而均勻，需要干燥時間短，顯色穩(wěn)定快速。而且在浸泡時間長的條件下不容易變形。而采用普通紙張，由于吸附能力較弱，紙質(zhì)差，容易破碎，烘干后藥品殘留量低，使用后，其顯色能力不明顯。

2.2.4 浸泡時間的選擇 將超厚濾紙浸泡到40g/L的對氨基苯磺酸鈉溶液和400g/L的亞硝酸鈉溶液的混合液中，兩者體積比為10∶0.3，浸泡時間范圍選擇在10～30min，室溫晾干后與50μg/m L組胺溶液反應(yīng)，結(jié)果如表5所示。

表5 浸泡時間對試紙效果影響

由表5看出不同浸泡時間的試紙與組胺反應(yīng)速度大體相同，但是顯色程度有差異，浸泡時間在10m in左右時，顯色效果不好，試紙上顯色班駁不均勻;當(dāng)浸泡時間為15m in時，試紙顯色效果同樣不好，但顯色比較均勻;當(dāng)浸泡20m in時顯色各項指標均最佳;25m in以上，浸泡時間太長，紙張在平皿中不易取出，且紙張易破，不易晾干操作，并且晾干后試紙的形狀保持不好。綜合考慮，浸泡時間選擇為20m in左右。

2.2.5 試紙干燥環(huán)境對試紙的影響 將超厚濾紙浸泡到40g/L的對氨基苯磺酸鈉溶液和400g/L的亞硝酸鈉溶液的混合液中，兩者體積比為10∶0.3，浸泡20m in，不同干燥條件后與50μg/m L組胺溶液反應(yīng)，結(jié)果如表6所示。

結(jié)果顯示不同干燥條件的試紙的顯色速度和顯色程度差異不大，但室溫、干燥器干燥所需時間均較長，而且有微黃底色。干燥箱30、40、50、60℃干燥的試紙均較好，且?guī)缀鯖]有微黃底色，但60℃干燥所需時間更短，所以干燥條件選擇干燥箱60℃為宜。

表6 干燥條件對試紙效果影響

2.2.6 顯色條件對試紙的影響 在實驗中，反應(yīng)的酸堿度很重要。有文獻記載重氮偶合反應(yīng)需在酸性條件下進行，過量鹽酸會使結(jié)果偏低，靈敏度降低，甚至檢測不出來［9，18－19］。通過實驗發(fā)現(xiàn)，試紙先浸泡到未加鹽酸的顯色體系中，臨時用1mol/L鹽酸把組胺溶液pH調(diào)至1～2后與試紙反應(yīng)顯色比較明顯。同時發(fā)現(xiàn)，溫度在反應(yīng)過程中也很重要。在室溫、30、40、50、60、70、80℃水浴后的組胺處理液調(diào)節(jié) pH后與試紙反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)30℃水浴后的組胺處理液與試紙顯色效果最佳。

2.3 標準比色卡的制備

將試紙分別與一系列濃度為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25、30、35、40、45、50、60、70、75、80、85、90、100、125、150、175、200μg/m L 的組胺溶液根據(jù)顯色深淺、色階的變化制作標準比色卡。

2.4 試紙的使用方法

將含有樣品處理液于30℃水浴用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至1～2，用玻璃棒蘸取與試紙接觸，反應(yīng)便在試紙上進行。然后與標準比色卡進行對照，即可估計出樣液中組胺的濃度。

2.5 試紙效果評價

2.5.1 試紙檢出限的確定 將制作的試紙與系列濃度組胺溶液反應(yīng)，確定試紙的最低檢測限度，結(jié)果如表7所示。

表7 組胺檢測試紙最低限檢測結(jié)果

由表7可見，當(dāng)組胺達到4μg/m L時，試紙已經(jīng)有顯示，則試紙的檢出限為4μg/m L。

2.5.2 試紙精確性校驗 以冰箱中長期儲藏的魚進行應(yīng)用實驗。參照標準比色卡，用試紙測定樣品中組胺，并與國標法測定相比較，結(jié)果如表8所示。

表8 樣品中測定結(jié)果(μg/mL)

從實驗結(jié)果看出，試紙的顏色所對應(yīng)的濃度范圍與真實濃度符合度較好。多次重復(fù)實驗結(jié)果表明，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性較好，試紙檢測的濃度范圍與國標方法檢測的精確濃度相吻合。

3 結(jié)論

3.1 顯色體系篩選結(jié)果表明:對氨基苯磺酸鈉和亞硝酸鈉混合色階變化明顯，適合作為試紙制備的浸泡溶液。

3.2 試紙制備條件選擇結(jié)果表明:顯色劑為40g/L的對氨基苯磺酸鈉溶液和400g/L的亞硝酸鈉溶液，兩者的最佳體積比為10∶0.3，最佳紙材是超厚濾紙，最佳浸泡時間是20min，最佳干燥條件是在60℃干燥箱中干燥。試紙在塑料袋內(nèi)密封置于陰涼干燥處保存。

3.3 通過應(yīng)用實驗，確定試紙的檢出限為4μg/m L，試紙檢測結(jié)果與國標法檢測結(jié)果相吻合。

［1］李偉榮，姚麗梅，王寧生.5－羥色胺、組胺檢測方法概述［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2003，1(7):409－412.

［2］李立，李金強，鐘響.反相分配離子對色譜法快速測定魚肉中的 HA［J］.檢驗檢疫科學(xué)，2001，11(4):44－45.

［3］楊文軍，馬丹，張麗英，等.魚粉中的有毒有害物質(zhì)組胺HPLC 檢測方法初探［J］.飼料廣角，2004(4):28－29.

［4］Bodmer S，Imark C，Kneubuhl M.Biogenic amnines in foods:Histamine and food processing［J］.Inflammation Research，1999，48(2):296－300.

［5］李志軍，吳永寧，薛長湖.生物胺與食品安全［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(10):84－91.

［6］徐金德.一起秋刀魚引起組胺食物中毒事件的調(diào)查［J］.海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2004，10(5):41.

［7］Shalaby A R.Significance of biogenic amines to food safely and human health［J］.Food Reaearch International，1996，29(7):675－690.

［8］周煥英，高志賢，崔曉亮.試紙法在食品、水質(zhì)及其它快速檢測中的應(yīng)用［J］.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2003，21(2):148－151.

［9］吳愛芳，曾丹.試紙對肉類熟食制品中亞硝酸鹽的快速檢測［J］.中國食物與營養(yǎng)，2005(6):34－36.

［10］O Yu Nadzhafova，S V Lagodzinskaya，V V Sukhan.Test Paper for the Determination of Aluminum in Solution［J］.Journal of Analytical Chemistry，2001，56(2):178－181.

［11］李喆，王詩哲，吳也平.牛奶摻假檢驗試紙的研制［J］.高師理科學(xué)刊，2004，24(2):38－40.

［12］李珊，吳迪，徐偉，等.碘鹽中碘含量檢測試紙的制備與應(yīng)用［J］.河北省科學(xué)院學(xué)報，2003，20(4):240－242.

［13］袁鐵琰，張大兵，王全喜.試紙條技術(shù)在轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物檢測中的應(yīng)用［J］.生物技術(shù)通報，2004(5):37－39.

［14］吳翠玲，肖鳳英，徐金瑞.甲醛的試紙化測定研究［J］.福建化工，2003(2):24－26.

［15］黃偉坤.食品檢驗與分析［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1995:501－502.

［16］郝宏蘭.水產(chǎn)品中組胺的測定方法研究［J］.食品科學(xué)，2000，21(8):46－49.

［17］屈智慧，鄒東雷，張思相，等.亞硝酸根試紙的開發(fā)與研制［J］.化學(xué)工程師，2005，7(7):1－4.

［18］王麗玲，白艷玲.水產(chǎn)品組胺測定中鹽酸量對結(jié)果影響的探討［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2001(5):55.

［19］高鶴娟.食品衛(wèi)生方法(理化部分注解)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1987:357.

Preparation for the detected paper of histam ine

WANG Li1，2，WU Qiang3，SANG Hong－qing1，LIU Xian－jin2，*
(1.College of Food and Medical Science，Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China;2.Key Laboratory of Agro－food Safety and Quality Ministry of Agriculture，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China;3.College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350000，China)

This text introduced a new preparation m ethod of a detected paper for detecting the histam ine by the colorim etry princip les，screening the color system and researching the conditions of the papers.The standard color card was prepared.The detected paper was evaluated through com paring the national standard method.The results of the experiment showed that:the best color system was hybrid solution which was compsed by the sodium pam inobenzenesulfonate and sodium nitrite，the best concentration respectively was40g/L and 400g/L，the best volume ratio was 10∶0.3，the best paper m aterial was the thick filter paper，the best soaking time was 20m inutes，the best drying conditionswas 60℃ in the oven，the paper detected lim it was 4μg/m L.Practical experiment indicated that the detected resultsof the detected paper were in accordancew ith the detected results of the national standard method，the re－emergence of the date was better.

detected paper;histam ine;detection

TS201.2

A

1002－0306(2011)06－0410－04

2010－05－31 *通訊聯(lián)系人

王麗(1977－)，女，碩士，講師，研究方向:食品安全與檢測。

安徽科技學(xué)院自然科學(xué)研究項目(ZRC2010257);江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目［CX(10)236］。