三種富含葉酸的果蔬提取物抗苯并［a］花致突變作用的實(shí)驗(yàn)研究

占才貴，宮智勇，楊 虎，方 敏，周寧菱

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023)

三種富含葉酸的果蔬提取物抗苯并［a］花致突變作用的實(shí)驗(yàn)研究

占才貴，宮智勇*，楊 虎，方 敏，周寧菱

(武漢工業(yè)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢430023)

研究了三種富含葉酸的果蔬提取物抗苯并［a］芘的致突變作用。結(jié)果表明，三種果蔬提取物的抗誘變能力不同，由強(qiáng)到弱依次為:胡蘿卜、番茄、葡萄。其中高劑量胡蘿卜、番茄提取物對(duì)苯并［a］芘誘導(dǎo)的鼠傷寒沙門氏菌TA100致突變作用的抗誘變等級(jí)達(dá)到高強(qiáng)度等級(jí)(+++)。SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析表明:與陽(yáng)性對(duì)照組比較，中、高劑量的果蔬提取物的抗誘變效果顯著(P＜0.05，P＜0.01)。

葉酸，苯并［a］芘，抗突變作用，Ames實(shí)驗(yàn)

苯并［a］芘［benzo(a)pyrene，BaP］是一類主要的多環(huán)芳烴致癌物，是重要的食品和環(huán)境污染物，廣泛存在于生產(chǎn)和生活環(huán)境中。BaP作為一種常見的食品污染物，進(jìn)入人體后一部分與蛋白質(zhì)結(jié)合，使控制細(xì)胞生長(zhǎng)的酶發(fā)生癌變;另一部分主要在體內(nèi)細(xì)胞色素 P450酶系作用下代謝分解，其代謝產(chǎn)物7，8－二羥基－9，10－環(huán)氧苯并(a)芘(BPDE)具有親電子性，可與DNA親核位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合形成加合物，導(dǎo)致DNA損傷［1－6］。BaP在燒烤食品中含量極高，經(jīng)檢測(cè)，烤焦的魚皮中BaP的含量高達(dá)53.6～70μg/kg［7］。BaP作為間接致突變物，在體外活化系統(tǒng)S－9作用下，可致鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100發(fā)生回復(fù)性突變，具有明顯的致突變作用。葉酸屬于水溶性維生素，不溶于乙醇、氯仿、苯等有機(jī)溶劑［8］。葉酸是DNA代謝活動(dòng)所必需的一種微量營(yíng)養(yǎng)素，人體不能合成，需從食物中獲取。目前，國(guó)內(nèi)外研究表明，葉酸代謝涉及DNA合成和DNA甲基化二個(gè)重要生化過程，與DNA復(fù)制、損傷修復(fù)和基因表達(dá)等過程緊密相關(guān)［9－10］。若葉酸含量較低可導(dǎo)致細(xì)胞整個(gè)DNA低甲基化和啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化，損害腫瘤抑制基因和DNA修復(fù)基因的表達(dá)，有利于誘變劑的致突變作用。我國(guó)從2005年1月，確定了“7+1”面粉營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化配方，其中葉酸為基礎(chǔ)配方中的7種微量元素之一。2009～2011年，衛(wèi)生部決定利用中央財(cái)政專項(xiàng)補(bǔ)助經(jīng)費(fèi)，對(duì)全國(guó)準(zhǔn)備懷孕的農(nóng)村婦女實(shí)施免費(fèi)增補(bǔ)葉酸預(yù)防神經(jīng)管缺陷。那么，作為食品強(qiáng)化劑的葉酸除了預(yù)防重大出生缺陷－神經(jīng)管缺陷外，是否對(duì)食品和環(huán)境中化學(xué)致突變劑具有拮抗作用，基于以上的分析考慮，本研究采用三種富含葉酸的果蔬提取物，從食品的角度探討葉酸對(duì)食品和環(huán)境中化學(xué)致突變劑具有的拮抗作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄、番茄、西紅柿 武漢市常青花園菜市場(chǎng);苯并［a］芘(benzo(a)pyrene)、輔酶－Ⅱ(β－Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate disodium salt)、葡萄糖－6－磷酸鈉鹽(D－Glucose 6－phosphate disodium salthydrat)、多氯聯(lián)苯 (polychlorinated biphenyl) Sigma公司;組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

生物潔凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;恒溫水浴箱 江蘇太倉(cāng)醫(yī)療儀器廠;低溫高速離心機(jī)Sigma公司;DHP－9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;手提式不銹鋼蒸汽消毒器上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 果蔬提取物的制備 將購(gòu)得的新鮮葡萄、番茄、胡蘿卜在自來水下沖洗干凈，在蒸餾水中浸泡半小時(shí)后撈起晾干。分別將三種果蔬置于勻漿器中勻漿(冰上操作)，勻漿后用紗布過濾除渣收集濾液，收集后的濾液經(jīng)真空抽濾3次后用0.22μm濾膜過濾除菌，將所得的濾菌液依次稀釋2倍、4倍，原液、2倍稀釋液、4倍稀釋液依次定義為高劑量組、中劑量組、低劑量組。濾液于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大鼠肝S－9的誘導(dǎo)和制備 選擇健康雄性成年Wistar大鼠，體重180g左右，周齡5～6周。將多氯聯(lián)苯溶于玉米油中，濃度為200mg/mL，按500mg/kg體重，無菌操作一次性腹腔注射，5d后斷頭處死動(dòng)物，取出肝臟稱重后，用新鮮的0.15mol/L氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟數(shù)次，以便除去能抑制微粒體酶活性的血紅蛋白。每克肝(濕重)加0.1mol/L氯化鉀溶液3mL，連同燒杯移入冰浴中，用剪刀剪碎肝臟，在勻漿器(低于4000r/min，往復(fù)1～2min)或組織勻漿器(20000r/min，1min)中制成勻漿。以上操作均在無菌和局部冷壞境中進(jìn)行。將制成的肝勻漿在低溫(0～4℃)高速離心機(jī)上以9000g離心10min，吸出上清液為S－9組分，分裝于無菌冷凍管中，每管2mL左右，干冰速凍后置－80℃低溫保存。S－9制成后，經(jīng)無菌檢查和活性鑒定合格，可用于抗誘變實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 菌株的增菌培養(yǎng)與鑒定

1.2.3.1 菌株的增菌培養(yǎng) 取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基5mL，加入無菌試管中，將冷凍保存的菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩(100次/min)培養(yǎng)10h至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，每毫升不少于1×109～2×109個(gè)活菌數(shù)，培養(yǎng)瓶用黑紙包裹，以防光線照射細(xì)菌。

1.2.3.2 組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的鑒定 加熱融化底層培養(yǎng)基兩瓶(一瓶不加組氨酸，一瓶加組氨酸)，不加組氨酸者每100mL底層培養(yǎng)基中加0.5mmol分子D－生物素0.6mL;加組氨酸者每100mL底層培養(yǎng)基中加 L－組氨酸(每100mL中含0.4043g)1mL和0.5mmol分子D－生物素0.6mL，冷卻至50℃左右，各倒兩個(gè)平皿。取有組氨酸和無組氨酸培養(yǎng)基平皿各一個(gè)，按菌株號(hào)順序劃線(直線)接種在培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)48h。1.2.3.3 脂多糖屏障缺陷的鑒定 加熱融化營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，取菌液0.1mL移入平皿，迅速將營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基(冷卻至50℃左右)適量倒入平皿，混勻，平放凝固。將圓形無菌濾紙片一片(直徑6mm)放入已凝固的培養(yǎng)基平皿中央，用移液器在濾紙片上滴加0.1%結(jié)晶紫溶液10μL，37℃培養(yǎng)24h，每個(gè)菌株做一個(gè)平皿。

1.2.3.4 R因子的鑒定 加熱融化營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基，冷卻到50℃左右，適量倒入平皿中，平放凝固，用移液器吸0.8%的氨芐青霉素10μL，在凝固的培養(yǎng)基表面依中線涂成一條帶，待氨芐青霉素溶液晾干后，用接種環(huán)與氨節(jié)青霉素帶相交叉劃線接種要鑒定的菌株，37℃培養(yǎng)24h。

1.2.3.5 uvrB修復(fù)缺陷型的鑒定 在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平皿表面用接種環(huán)劃線接種需要鑒定的菌株，接種后的平皿一半用黑紙覆蓋，在距15W紫外線滅菌燈33cm處照射8s，37℃培養(yǎng)24h。

1.2.4 抑菌實(shí)驗(yàn) 采用紙片法對(duì)不同濃度的果蔬提取物進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn):在無菌平皿內(nèi)加入已融化的2%肉湯瓊脂培養(yǎng)基20mL作為底層，待凝固后再分別加入含有培養(yǎng)16h的實(shí)驗(yàn)菌株TA98、TA100營(yíng)養(yǎng)肉湯200μL在上述底層上均勻涂布，凝固后用4個(gè)經(jīng)不同濃度果蔬提取物浸濕過的無菌圓形濾紙片均勻貼在培養(yǎng)基上，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果，若有抗菌作用，則紙片周圍出現(xiàn)無細(xì)菌生長(zhǎng)的抑菌圈。

1.2.5 抗誘變實(shí)驗(yàn)［11］向無菌帶塞試管中依次加入0.5mL S－9混合液、0.1mLBaP(用DMSO溶解)溶液、0.1mL不同濃度果蔬提取物溶液、0.1mL菌液，在37℃水浴鍋中輕輕振蕩預(yù)培養(yǎng)30min。然后加入2mL頂層培養(yǎng)基(含0.05mol/L L－組氨酸和D－生物素)于試管中振蕩3s后倒在底層培養(yǎng)基平皿上，凝固后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，計(jì)數(shù)生長(zhǎng)菌落數(shù)。每個(gè)果蔬提取物濃度均做4個(gè)平皿。實(shí)驗(yàn)設(shè)立三個(gè)對(duì)照組:空白組(自發(fā)突變)、溶劑對(duì)照組(DMSO)、陽(yáng)性對(duì)照組。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)下式計(jì)算誘變性抑制率(%):

誘變性抑制率(%)=(M－MS)/M×100%

式中:M為陽(yáng)性誘變物每皿回變菌落數(shù);MS為誘變物和葉酸聯(lián)合應(yīng)用每皿回變菌落數(shù)。

各組間數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±S)表示，用SPSS 17.0分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

判定抗致突變強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)參考表1所示［12］。

表1 抗突變效果的判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定結(jié)果

2.1.1 組氨酸缺陷型的鑒定結(jié)果 兩株菌在有組氨酸培養(yǎng)基平皿表面各長(zhǎng)出一條菌膜，無組氨酸培養(yǎng)基平皿上除了自發(fā)回變菌株外無菌膜，說明受試菌株確為組氨酸缺陷型。

表2 不同濃度葡萄汁提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100致突變作用的影響

表3 不同濃度番茄汁提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100致突變作用的影響

表4 不同濃度胡蘿卜汁提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100致突變作用的影響

2.1.2 脂多糖屏障缺陷的鑒定結(jié)果 兩種菌株周圍均出現(xiàn)一個(gè)透明的抑制帶，說明存在rfa(深粗型)突變。這種變化允許某些大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)并抑制其生長(zhǎng)。

2.1.3 R因子的鑒定結(jié)果 2個(gè)菌株經(jīng)過24h培養(yǎng)，在氨芐青霉素帶的周圍的生長(zhǎng)依然不受抑制，即有抗氨芐青霉素效應(yīng)，證明它們都帶有R因子。

2.1.4 uvrB修復(fù)缺陷型的鑒定結(jié)果 對(duì)紫外線敏感的兩個(gè)菌株(TA98，TA100)僅在沒有照射過的一半生長(zhǎng)，照過的一半沒有菌落生長(zhǎng)。說明菌株是uvrB修復(fù)缺陷型。

2.2 果蔬提取物的抑菌作用

分別用各濃度的果蔬提取物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明在該濃度條件下均無抑菌作用。故可認(rèn)為在此濃度條件下進(jìn)行的抗誘變實(shí)驗(yàn)是有意義的。

2.3 果蔬提取物的抗誘變作用結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)用低劑量、中劑量、高劑量三個(gè)濃度梯度的果蔬提取物進(jìn)行抗誘變實(shí)驗(yàn)。在加S－9的條件下，用間接誘導(dǎo)物BaP誘導(dǎo)鼠傷寒沙門氏菌TA98、TA100產(chǎn)生突變。三種果蔬提取物的抗誘變作用效果如表2～表4所示。

由表2可見，不同濃度的葡萄汁提取液對(duì)BaP的誘變作用均有不同程度的抑制，但劑量－效應(yīng)關(guān)系不明顯。低劑量葡萄汁提取液對(duì)BaP的誘變作用無明顯抑制，且與陽(yáng)性對(duì)照組比較無顯著性差異(P>0.05)。高劑量的葡萄汁提取液對(duì)BaP誘導(dǎo)的TA100菌株的致突變作用明顯，抑制率為36.22%，達(dá)到中等抗誘變強(qiáng)度等級(jí)。

由表3可見，低劑量的番茄汁提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的TA98菌株無抗誘變作用，中高劑量卻達(dá)到中等抑制強(qiáng)度，抑制率分別為38.57%、48.57%。番茄汁提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的TA100菌株有較明顯的抗誘變作用，且劑量－效應(yīng)關(guān)系明顯，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，抑制效果顯著。其高劑量的抗誘變抑制率為55.13%，達(dá)到高強(qiáng)度抑制等級(jí)。

由表4可見，低劑量胡蘿卜汁提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的TA98菌株抗誘變作用不明顯。胡蘿卜汁提取物BaP誘導(dǎo)的TA100菌株抗誘變作用效果顯著，與陽(yáng)性對(duì)照組比較存在顯著性差異。最高抑菌率達(dá)到54.73%，達(dá)到高強(qiáng)度抑制等級(jí)。

3 討論

現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)中，在維生素與疾病關(guān)系的研究中最有力的一項(xiàng)隨機(jī)的、有對(duì)照的臨床實(shí)驗(yàn)表明，在受孕前即給予含葉酸的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑進(jìn)行干預(yù)，能有效地和明顯地降低嬰兒神經(jīng)管畸形(脊柱裂或無腦)的發(fā)生。這是1/4個(gè)世紀(jì)以來以觀察性研究為主要手段取得的最偉大成就:葉酸能夠預(yù)防一些神經(jīng)管畸形［13］。

對(duì)于誘變和癌變的關(guān)系，國(guó)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，證明兩者存在一定的相關(guān)性［14－15］，如果能干預(yù)誘變過程，則有助于對(duì)癌癥的預(yù)防。近幾年來，Ames實(shí)驗(yàn)被廣泛用于對(duì)果蔬抗誘變、抗癌作用的研究。馮寶健等報(bào)道，萵苣葉、綠米莧、青椒等對(duì)BaP所誘發(fā)的突變有不同程度的抑制作用，其抑制率分別為38.77%、32.62%和30.10%［16］。本研究選取的三種果蔬均含有豐富的葉酸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明高劑量胡蘿卜、番茄提取物對(duì)BaP誘導(dǎo)的TA98、TA100菌株誘變抑制率能達(dá)到50%以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，抑制效果顯著。抗誘變能力的強(qiáng)弱也與果蔬中葉酸的含量成正相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)室用純?nèi)~酸抑制 BaP誘導(dǎo)的 TA98、TA100菌株產(chǎn)生的誘變，其高濃度誘變抑制率也只有35%，低于高濃度果蔬提取物的誘變抑制率。造成這一結(jié)果現(xiàn)象的原因是果蔬中除含有葉酸外，還含有黃酮類物質(zhì)、多糖類物質(zhì)、皂甙類物質(zhì)。現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究表明這三類物質(zhì)均具有抗突變的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)某些富含葉酸的蔬菜確有抗誘變的作用，如新鮮胡蘿卜汁和菠菜汁均可使環(huán)磷酰胺誘發(fā)的小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PEC)微核率降低50%左右［17］，這與本實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論一致。

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Effect of extracts from three cultivars of fruit or vegetables being rich in folate acid to mutagenicity induced by benzo(a)pyrene

ZHAN Cai－gui，GONG Zhi－yong*，YANG Hu，F(xiàn)ANG Min，ZHOU Ning－ling
(College of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

To investigate extracts from three cultivars of fruit or vegetables being rich in folate acid antagonizing mutagenesis to benzo(a)pyrene.The results indicated that the antimutagenesis activities differed in cultivars.The antimutagenesis activities decreased in the order of daucus carrot，tomato，grape.The middle and high dosage extracts from daucus carrot，tomato had strong antimutagenesis activities which reached antimutagenic infect intensity(+++).The antimutagenesis effect of middle and high dosage extracts from daucus carrot，tomato，grape was significant(P＜0.05)or extreme significant(P＜0.01)comparing with the positive control group.All data were analysed using SPSS 17.0 for windows.

folate acid;benzo(a)pyrene;antimutagenesis;Ames test

TS201.4

A

1002－0306(2011)05－0368－04

2010－06－04 *通訊聯(lián)系人

占才貴(1984－)，男，碩士研究生，主要從事食品營(yíng)養(yǎng)與毒理學(xué)研究。

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2009BADB9B02);湖北省教育廳資助項(xiàng)目(D20091802)。