米糠中γ－氨基丁酸的富集及純化工藝研究

管娜娜，張 暉，王 立，郭曉娜，錢海峰

(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

米糠中γ－氨基丁酸的富集及純化工藝研究

管娜娜，張 暉*，王 立，郭曉娜，錢海峰

(江南大學食品學院，江蘇無錫214122)

以米糠為原料，利用米糠中高活性谷氨酸脫羧酶(GAD)進行γ－氨基丁酸(GABA)的富集實驗，并采用陽離子交換樹脂對富集液中GABA進行分離純化。結(jié)果表明:采用0.02mol/L pH5.6的Na2HPO4－檸檬酸緩沖液進行GABA富集實驗，反應16h后可得到GABA 2900mg/100g米糠。采用D001大孔強酸性陽離子交換樹脂對該富集液進行純化實驗，調(diào)節(jié)富集液pH2.0，以2mg/mL的濃度上樣吸附，2mol/L的氨水濃度進行洗脫，最終可得γ－氨基丁酸純度61.25%。

米糠，γ－氨基丁酸(GABA)，富集，純化，離子交換

γ－氨基丁酸(GABA)是一種廣泛分布于自然界中的非蛋白氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，有降壓、利尿、鎮(zhèn)靜的作用，對于失眠、抑郁也有很好的治療效果［1］。國內(nèi)外對各種植物組織如稻米、茶葉中積累GABA的研究也較為廣泛。Noriko等［2］對糙米發(fā)芽累積 GABA進行了實驗，浸泡和厭氧處理后可以富集得到高含量的GABA，且發(fā)芽后的充氮無氧保存可以繼續(xù)累積GABA。成熟果實儲存過程中調(diào)節(jié)環(huán)境中氧含量也可活化谷氨酸脫羧酶(GAD)活力，Makino等［3］調(diào)節(jié)番茄果實的儲存環(huán)境為低O2、高CO2時，累積得到GABA量比僅儲存于有氧環(huán)境中時高出48%。相關(guān)文獻對植物組織中富集GABA的機理進行研究，是由于其在缺氧、低溫、高H+濃度、機械損傷等逆境條件下產(chǎn)生的應激反應，激發(fā)其組織內(nèi)GAD的活性，而將游離的谷氨酸脫羧基轉(zhuǎn)化為 GABA［4］。而米糠中含有的谷氨酸脫羧酶(GAD)活力是植物中的佼佼者。因此米糠中富集GABA也采用浸泡的方式，調(diào)節(jié)微酸性、無氧的環(huán)境增加谷氨酸脫羧酶的活性，抑制米糠中GABA轉(zhuǎn)氨酶、丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶的活性，從而將米糠中的谷氨酸及外添加的谷氨酸鈉鹽轉(zhuǎn)化成γ－氨基丁酸。富集液中GABA純度低，有必要對富集液中γ－氨基丁酸濃縮提純進行研究。本文以膜分離作為γ－氨基丁酸富集液的預處理方法，再通過離子交換，將溶液中的γ－氨基丁酸最大程度地交換到樹脂上，選擇合適的洗脫劑選擇性洗脫γ－氨基丁酸以提高其純度。因此實驗是對米糠中富集GABA的條件進行優(yōu)化，然后以離子交換方法對富集液中GABA進行分離純化的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮米糠 安鎮(zhèn)糧食局;離子交換樹脂 南開化工廠;γ－氨基丁酸(純度99.99%) Sigma公司;甲醇、乙腈 中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司，色譜純;0.45μm聚偏氟乙烯微孔濾膜(F型) 上海興亞凈化材料廠;10kDa超濾膜 上海興亞凈化材料廠;其它試劑 均為分析純。

高效液相色譜儀 配有可變波長紫外檢測器，Agilent公司;PALL超濾裝置 Millipore公司;722－可見分光光度計 無錫市科達智能儀器廠;玻璃層析柱(Φ1.0×30cm) 上海錦華層析設備廠;自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜法測γ－氨基丁酸含量［5］

1.2.1.1 GABA柱前衍生化 以1%2，4－二硝基氟苯的乙腈溶液作為衍生劑，取標準γ－氨基丁酸溶液或待測樣品溶液1m L置于10m L棕色容量瓶中，分別加入 0.5mol/L、pH9.0的 NaHCO3溶液 1m L，1%2，4－二硝基氟苯的乙腈溶液1m L，置于60℃水浴中暗處加熱1h，取出冷卻，加入0.05mol/L、pH7.0的磷酸鹽緩沖液定容至刻度，混勻，過0.45μm濾膜，10000r/min離心10m in后，4℃下避光保存，備用。

1.2.1.2 HPLC色譜條件 色譜柱:Lichrospher C18(4.6×250mm，5μm);紫外檢測器檢測波長360nm;柱溫:35℃;流速:1m L/m in;流動相由A、B雙組分組成:A組分為CH3CN∶H2O=1∶1，B組分為20mmol/L NH4Ac水溶液，梯度洗脫方法見表1。HPLC法測定GABA濃度的標準曲線如圖1所示。1.2.2 米糠中谷氨酸脫羧酶酶活的測定 稱取10g米糠，加入 100m L底物溶液(1%Glu，pH 5.6)，于40℃水浴中反應 2h，將反應液 95℃ 滅酶 5m in，4000 r/m in離心30m in后，高效液相色譜法測上清液中GABA濃度。

表1 梯度洗脫程序

圖1 HPLC法峰面積與GABA標準溶液濃度的標準曲線

以1g米糠每30m in生成1μmol GABA作為一個酶活單位。

1.2.3 米糠富集GABA直接法 稱取10.0g米糠，加入80mL緩沖液溶液(含底物谷氨酸鈉濃度0.05mol/L)，添加維生素 B65mmol/mol谷氨酸鈉，添加 CaCl210mmol/mol谷氨酸鈉，于40℃水浴搖床100 r/m in反應一定時間后，95℃下滅酶5min，5000 r/m in離心20m in后取上清液，過0.45μm微濾膜，濾過液過10kDa超濾膜后的濾液即是預處理后的γ－氨基丁酸富集液［6］。

1.2.4 樹脂的預處理 首先使用兩倍于樹脂體積的飽和食鹽水浸泡樹脂18～20h后，用清水漂洗干凈，使排出水不帶黃色;其次再用2%～4%的NaOH溶液，兩倍于樹脂體積，浸泡樹脂2～4h后放盡堿液，沖洗樹脂至中性;最后用5%HCl溶液，浸泡樹脂4～8h后，用清水沖洗至中性，備用。

1.2.5 靜態(tài)吸附實驗 精確稱取預處理好的離子交換樹脂，放入一定容量的三角瓶中，加入預處理后的GABA富集溶液，25℃水浴搖床上以100 r/m in振蕩一定時間，取樣測定GABA濃度，用差量法計算樹脂的吸附量Q。

Q=(C0－C)V/W

其中:Q為樹脂重量交換容量(mg/g樹脂);C0為初始液中GABA濃度(mg/m L);C為終溶液中GABA濃度(mg/m L);V為溶液體積(m L);W為樹脂重量(g)。

1.2.6 動態(tài)吸附及洗脫實驗 稱取處理后樹脂裝柱，預處理后富集液以一定速度上樣吸附，待吸附飽和后，用去離子水沖洗未吸附雜質(zhì)，再以氨水作為洗脫劑進行洗脫，流出液用自動部分收集器收集并進行分析，以確定最佳上樣和洗脫條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠富集γ－氨基丁酸的研究

2.1.1 米糠中谷氨酸脫羧酶酶活 測定米糠谷氨酸脫羧酶酶活力為11.81U。

2.1.2 緩沖液種類的選擇 在富集γ－氨基丁酸的過程中，由于Glu脫羧造成反應體系pH不斷上升，偏離了米糠GAD的最適pH，使反應速度下降。因此將酶反應在緩沖體系中進行，可以穩(wěn)定反應的pH，提高GABA產(chǎn)量。而不同緩沖液在一定的離子強度下具有不同的緩沖能力，為了選擇制備GABA合適的緩沖溶液，在米糠中分別加入0.05mol/L、pH5.6的Na2HPO4－KH2PO4、Na2HPO4－檸檬酸、檸檬酸－檸檬酸三鈉緩沖液，并同時用0.05mol/L的檸檬酸和抗壞血酸調(diào)節(jié)反應液 pH，40℃反應6h后，滅酶，離心，測上清液中γ－氨基丁酸的量及灰分含量，結(jié)果見表2。

表2 緩沖液種類對富集的影響

由表2可知，不同緩沖液由于維持反應體系pH平衡的能力不同，對富集反應有不同的影響，其中Na2HPO4－檸檬酸緩沖液的富集結(jié)果最好，且反應過程中引入的灰分含量最少，有利于后續(xù)的純化操作，因此，我們選用Na2HPO4－檸檬酸作為富集緩沖液。2.1.3 緩沖液離子強度對富集的影響 實驗比較不同離子強度的緩沖溶液對富集的影響，選用0.01～0.05mol/L含0.05mol/L谷氨酸鈉的Na2HPO4－檸檬酸緩沖溶液進行實驗。結(jié)果表明，當選用0.02mol/L的Na2HPO4－檸檬酸緩沖溶液時，富集結(jié)果最高。

圖2 緩沖液離子強度對GABA產(chǎn)量的影響

2.1.4 反應時間對富集的影響 不改變其他反應條件，以時間為單因素進行優(yōu)化實驗，結(jié)果見圖3。

圖3 反應時間對GABA產(chǎn)量的影響

由圖3可以看出，隨著反應時間的延長，富集液中GABA含量持續(xù)增高，直到反應16h后，富集量達到最大值。這是由于反應是在緩沖液中進行，能夠維持反應液中pH的穩(wěn)定，使谷氨酸脫羧酶的活力保持，因此富集到的GABA量持續(xù)增加。隨著反應的進行，底物谷氨酸濃度逐漸降低，谷氨酸濃度的降低會抑制谷氨酸脫羧轉(zhuǎn)化為γ－氨基丁酸的反應，當反應至一定時間，底物濃度降至最低時，富集反應不再發(fā)生，富集量不再升高。因此，選擇富集反應時間為16h，此時富集得到GABA量為29mg/g米糠，谷氨酸轉(zhuǎn)化率達到72%。

2.2 γ－氨基丁酸富集液的純化研究

2.2.1 離子交換樹脂的篩選 準確稱取預處理好的樹脂1.5g，分別裝入具塞磨口三角瓶中，再準確加入已知濃度的 GABA預處理液 50m L，分別將裝有D001、001×7、201 ×7、D113 樹脂的溶液調(diào)節(jié) pH 為2.5、2.5、9.5、5.5，于25℃恒溫水浴上振搖 24h 至吸附平衡，過濾，測定各溶液中GABA的濃度，計算吸附量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同樹脂對GABA的吸附量

由圖4可以看出，陽離子交換樹脂對γ－氨基丁酸的吸附效果好于陰離子交換樹脂，而其中大孔型強酸陽離子交換樹脂對γ－氨基丁酸的吸附量最高。李向平等［7］在研究γ－氨基丁酸提取工藝時進行樹脂的選擇實驗時發(fā)現(xiàn)，D001樹脂的吸附量最高且吸附速率最高，與本實驗結(jié)果吻合。因此本實驗中選用D001樹脂來進行離子交換實驗對γ－氨基丁酸富集液進行純化研究。

2.2.2 吸附平衡時間的測定 準確量取75m L預處理液，加入2g D001型樹脂，調(diào)節(jié)其 pH為2.0，于25℃搖床下振搖。在不同時間里間隔取樣，測定其中GABA濃度。從實驗結(jié)果得知，D001樹脂對γ－氨基丁酸的吸附在30m in以內(nèi)即可達到平衡，吸附速率快，吸附效果好。

圖5 D001樹脂的吸附平衡時間曲線

2.2.3 pH對樹脂靜態(tài)吸附過程的影響 分別量取GABA預處理液(1.3082mg/m L)70m L，加入D001型樹脂 5g，分別調(diào)其 pH 至 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，于25℃搖床至吸附平衡后定容至100m L，高效液相色譜法測定溶液中GABA濃度，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同pH對靜態(tài)吸附容量的影響

根據(jù)實驗結(jié)果，不同pH條件下樹脂的吸附容量差異較大:pH為2.0時，樹脂對GABA的吸附量最大，達到17.0746mg/(g樹脂);之后隨著pH的上升，樹脂對GABA的吸附量逐漸減小。當pH為7時，樹脂對GABA基本不吸附，這是由于γ－氨基丁酸等電點是7.2，當pH位于氨基酸等電點附近時，氨基酸在溶液中呈電中性，不會與離子交換樹脂上的陽離子基團發(fā)生交換行為。pH低于氨基酸等電點時，氨基酸上的氨基結(jié)合一個質(zhì)子而呈陽離子狀態(tài)，與樹脂發(fā)生離子交換。

2.2.4 上樣濃度對吸附過程的影響 離子交換樹脂對目的氨基酸的吸附通常在低濃度下比較有利，如果上樣液中氨基酸濃度太高，樹脂很快出現(xiàn)滲漏，但若上樣液濃度太低，吸附效率低，設備利用率低下，成本上升，也是不可取的。因此實驗選取1、2、3mg/m L的不同GABA預處理液，調(diào)至pH2.0，以1m L/min的速度上樣吸附，收集流出液，測流出液中GABA濃度。以流出液體積為橫坐標，C/C0為縱坐標，繪制滲透曲線。

從不同上樣濃度繪制出來的滲透曲線可以看出，隨著上樣濃度的增加，穿透時間縮短，而有效交換容量在2mg/m L時為最大，因此實驗選擇將富集液濃度濃縮至約2mg/m L左右上樣，使樹脂對氨基酸的吸附容量達到最大。

2.2.5 洗脫劑的選擇 不同pH的洗脫液對GABA的洗脫效果不同，將吸附好的樹脂分別用0.1mol/L的pH5.0、pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液、乙酸銨溶液、pH8.0、pH9.0的乙酸銨－氨水緩沖液和氨水溶液七種洗脫劑進行洗脫，收集洗脫液，測定GABA的含量，結(jié)果如表3。

圖7 不同上樣濃度下的滲透曲線

表3 不同pH洗脫劑對GABA的洗脫影響

洗脫劑的pH，對氨基酸的洗脫選擇性有一定影響。pH越大，γ－氨基丁酸洗脫越完全;當洗脫劑pH小于γ－氨基酸等電點，氨基酸不能被完全洗脫下來而有部分被吸附保留在樹脂柱上;而pH大于等電點時，γ－氨基丁酸的電荷性質(zhì)發(fā)生改變，與樹脂的結(jié)合力減弱，易于被洗脫下來;pH越大，氨基酸被洗脫下來的越集中，因此收集到的洗脫液中γ－氨基丁酸的純度也就越高;且由于使用氨水作為洗脫劑時，可以減壓蒸餾出氨氣，進一步提高γ－氨基酸的純度，因此實驗采用氨水作為洗脫劑。

2.2.6 氨水濃度對洗脫效果的影響 分別量取pH2.0的1mg/m L處理液150m L，加入10g D001型樹脂，進行靜態(tài)吸附。而后以2、1、0.5mol/L氨水作為洗脫劑，在1m L/m in的流速下對近飽和吸附樹脂進行洗脫，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可以看出，使用氨水濃度為2mol/L時，氨基酸洗脫出峰時間早且洗脫較集中，因此選擇氨水濃度為2mol/L進行樹脂的洗脫實驗。洗脫后溶液減壓蒸餾除去氨氣后，γ－氨基丁酸回收率90.35%，純度61.25%。

圖8 不同氨水濃度下的洗脫曲線

3 結(jié)論

本文對米糠中富集γ－氨基丁酸和純化進行了優(yōu)化實驗。添加0.02mol/L pH5.6的Na2HPO4－檸檬酸緩沖液，料液比1∶8，底物濃度0.05mol/L，40℃水浴反應16h后可得到富集液中GABA濃度2.9mg/m L，谷氨酸轉(zhuǎn)化率達72%，富集液中GABA占固形物量11.42%。使用D001樹脂對此富集液做進一步分離純化研究，調(diào)節(jié)富集液pH2.0，以2mg/m L的濃度上樣吸附，2mol/L的氨水濃度進行洗脫，最終可得γ－氨基丁酸純度61.25%。

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［4］黃懷生，陳金華，李志剛.茶葉中γ－氨基丁酸的提取測定方法研究進展［J］.福建茶業(yè)，2006(3):7－9.

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Study on enrichment and purification of γ－am inobutyric acid in rice bran

GUAN Na－na，ZHANG Hui*，WANG Li，GUO Xiao－na，QIAN Hai－feng
(School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China)

The accumulation of GABA in rice bran by glutamate decarboxylase(GAD)，and the purification of GABA enriched solution using cation ion exchange resin were investigated.The optimal accumulation conditions of GABA were determ ined as described below:the ionic strength of citric acid－disodium hydrogen phosphate buffer solution was 0.02mol/L，the reaction tim e was16h.Under the optimal conditions，the concentration of GABA reached 2900m g/100g rice bran.The optimal purification conditions of GABA enriched solution also be determ ined as follow ing:the optim al pH of sample solution was 2.0，the concentration of GABA enriched solution was 2.0mg/m L，concentration of eluting agent was 2.0mol/L.And the final purity of GABA reached 61.25%.

rice bran;γ－am inobutyric acid;enrichment;purification;ion exchange

TS210.1

B

1002－0306(2011)06－0292－04

2010－06－30 *通訊聯(lián)系人

管娜娜(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:糧食、油脂與植物蛋白工程。