酶法合成月桂酸植物甾烷醇酯的研究

何文森，賈承勝，張曉鳴，馮 骉

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

酶法合成月桂酸植物甾烷醇酯的研究

何文森，賈承勝，張曉鳴，馮 骉*

(江南大學(xué)食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122)

研究了有機相脂肪酶催化合成月桂酸植物甾烷醇酯的工藝條件，同時探索出有效分離純化植物甾烷醇酯的方法。通過紅外光譜、質(zhì)譜技術(shù)表征月桂酸植物甾烷醇酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)。最佳反應(yīng)條件為:正己烷為溶劑，植物甾烷醇25μmol/mL，月桂酸100μmol/mL，脂肪酶Novozym 435 30mg/mL，3? 分子篩80mg/mL，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間96h，轉(zhuǎn)速150r/min，經(jīng)三次平行實驗測得平均酯化率為80.3%。

月桂酸，植物甾烷醇酯，酶催化，膽固醇

二十世紀(jì)以來，心血管疾病逐漸成為人類的致死疾病。大量資料表明，人類心血管疾病的發(fā)病率與高的總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平呈正相關(guān)［1－2］。減少體內(nèi)膽固醇的合成和吸收可以降低總膽固醇，從而防止心血管疾病。植物甾醇(以下簡稱甾醇)包括β－谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、菜油甾醇，大多數(shù)來源于植物油精煉下腳料，其結(jié)構(gòu)與膽固醇類似;植物甾烷醇(以下簡稱甾烷醇)是甾醇的飽和形式，包括谷甾烷醇、菜籽甾烷醇兩種［3］。甾醇和甾烷醇通過抑制小腸內(nèi)膽固醇的吸收，有效降低血液總膽固醇含量。二者在動物和人體內(nèi)已經(jīng)應(yīng)用半個多世紀(jì)，其安全性毋庸置疑［4－7］。近年來，國外許多研究報道甾烷醇在降膽固醇方面比甾醇更有效。同甾醇相比，甾烷醇在體內(nèi)的吸收率更低［1，4，8］。由于甾烷醇獨特的結(jié)構(gòu)和晶體形式，其溶解性和生物可利用性非常低，限制了它在食品中的應(yīng)用。將甾烷醇同脂肪酸進行酯化反應(yīng)生成甾烷醇酯，明顯改善其油溶性，極大地拓寬在食品中的應(yīng)用范圍。甾烷醇酯可用化學(xué)法合成，但脂肪酸易在高溫下發(fā)生熱分解反應(yīng)，且有副產(chǎn)物產(chǎn)生。有機相脂肪酶催化酯化反應(yīng)具有反應(yīng)條件溫和，選擇性高，副產(chǎn)物少，產(chǎn)品易分離等優(yōu)點，且產(chǎn)品具有很強的綠色、環(huán)保概念［9］。目前國內(nèi)外有一些關(guān)于甾醇酯的研究，國外關(guān)于甾烷醇酯的開發(fā)報道甚少，國內(nèi)在這一領(lǐng)域基本是空白。本研究采用有機相脂肪酶催化法將中長碳鏈脂肪酸與甾烷醇直接酯化，探索其合成規(guī)律和分離純化方法，并通過紅外光譜、質(zhì)譜技術(shù)表征月桂酸甾烷醇酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Novozym 435固定化脂肪酶 諾維信(中國)生物醫(yī)藥有限公司;月桂酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、環(huán)己烷 分析純;甲醇 色譜純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司;植物甾醇(≥95%) 江蘇春之谷生物制品有限公司;分子篩(3?，4?) 上海環(huán)球分子篩有限公司;鈀碳催化劑

蘇州市吳中區(qū)胥口試劑廠。

高效液相色譜儀、質(zhì)譜儀 美國Waters公司;紅外光譜儀 Thermo Electron公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物甾烷醇的制備 將植物甾醇溶于異丙醇，置入高壓反應(yīng)釜，添加鈀碳催化劑［m(鈀)/m(甾醇)，0.2%］，通氫，密閉加熱?？刂茥l件:反應(yīng)溫度為65℃，壓力10atm，反應(yīng)時間為5h，通過碘值法測得氫化率為97.2%(GB/T 5532－2008)。

1.2.2 植物甾烷醇酯的酶法合成 取一定的植物甾烷醇、脂肪酸、固定化脂肪酶Novozym 435，4?分子篩，適量的溶劑于反應(yīng)瓶，密封后置于一定溫度(45～65℃)的恒溫水浴振蕩器(150r/min)中反應(yīng)一定時間(72～96h)。

1.2.3 植物甾烷醇酯的分離及結(jié)構(gòu)鑒定 分離:用點樣毛細(xì)管(0.5mm)取2～4管反應(yīng)液在預(yù)制的硅膠薄層板上點樣，同時以植物甾烷醇、脂肪酸為對照，展開劑為環(huán)己烷/乙酸乙酯(80∶20，v/v)，顯色劑為5%的硫酸乙醇溶液或碘蒸氣。利用硅膠柱層析分離植物甾烷醇酯，硅膠柱層析條件:洗脫劑為環(huán)己烷/乙酸乙酯(80∶20，v/v)，流速為25mL/h，用自動收集器按1管/12min收集洗脫液，并隨時用TLC檢測產(chǎn)物，最后將收集到的目標(biāo)產(chǎn)物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到植物甾烷醇酯。

結(jié)構(gòu)鑒定:將分離純化制得的植物甾烷醇酯于烘箱中充分干燥，然后進行分析。紅外光譜:全反射衰減法，光譜掃描范圍為4000～600cm－1，掃描次數(shù)為64，分辨率為4cm－1;質(zhì)譜:離子方式ESI+，毛細(xì)管電壓3.5kV，錐孔電壓20V，錐孔氣流50L/h，碰撞能量6V，質(zhì)量范圍50～1000m/z。

1.2.4 液相色譜分析 用高效液相色譜儀測定酯化率，色譜柱為 symmetry－C18反相柱(5μm，4.6×150mm)，柱溫35℃，流速1mL/min，進樣量為10μL，流動相為甲醇/正己烷(90∶10，v/v)。檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD 2420，Waters)，漂移管溫度為80℃，載氣為氮氣，壓力為0.17MPa。

ELSD檢測器進行定量分析時，需要標(biāo)準(zhǔn)品校正，要用對數(shù)計算被測定樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，利用前面分離得到的植物甾烷醇作為標(biāo)準(zhǔn)物。被測定樣品與標(biāo)準(zhǔn)物濃度對數(shù)的比值等于二者峰面積對數(shù)的比值。由于標(biāo)準(zhǔn)物的濃度是已知的，因此可以通過反應(yīng)液HPLC圖譜中植物甾烷醇酯的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)物峰面積對數(shù)的比值，計算求出反應(yīng)液中植物甾烷醇酯的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，從而得到脂肪酶催化反應(yīng)的酯化率。

2 結(jié)果與討論

2.1 植物甾烷醇的分離及結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 薄層色譜分析 進行薄層色譜分析時主要考慮三個因素，即吸附劑的活性、被分離物質(zhì)的極性、展開劑的極性。實驗時，前兩者均是一定的，故通過改變展開劑的極性來提高分離效率。通過大量的預(yù)實驗，確定了展開劑為環(huán)己烷/乙酸乙酯(80∶20，v/v)。

用于薄層層析的顯色劑有很多，常用的有5%硫酸乙醇和碘蒸氣。兩者均能使植物甾烷醇、植物甾烷醇酯顯色，但月桂酸是一種飽和脂肪酸，不能在5%的硫酸乙醇作用下顯色，圖1分別為在不同的顯色劑作用下的結(jié)果。

由圖1可知，不同物質(zhì)的Rf值:植物甾烷醇0.1～0.15，月桂酸0.05～0.20，植物甾烷醇酯0.8～0.85。根據(jù)結(jié)果可知，盡管植物甾烷醇與月桂酸之間的分離效果不好，但這兩者能與植物甾烷醇酯很好地分離，不影響植物甾烷醇酯的分離純化。

圖1 薄層色譜分析

2.1.2 硅膠柱層析 常用薄層層析來探索硅膠柱層析所用洗脫條件。用薄層層析探索出的展開劑能很好地將甾烷醇、月桂酸與甾烷醇酯分開，故將該條件應(yīng)用于硅膠柱層析分離，其結(jié)果如圖1c。據(jù)圖可知，圖中只有一個斑點，為純的植物甾烷醇酯，說明用薄層色譜得到的分離條件可應(yīng)用于硅膠柱色譜分離，能得到較純的植物甾烷醇酯。

2.1.3 植物甾烷醇酯的結(jié)構(gòu)鑒定 植物甾烷醇酯是谷甾烷醇酯和菜籽甾烷醇酯的混合物，對其進行紅外光譜和質(zhì)譜分析。

紅外光譜分析:將月桂酸、植物甾烷醇，分離純化制得的植物甾烷醇酯分別進行紅外光譜分析，圖2從上至下依次為純月桂酸、植物甾烷醇、植物甾烷醇酯的紅外光譜圖，其主要的特征吸收峰如下:月桂酸紅外光譜圖中，2500～3300cm－1為－COOH中－OH的伸縮振動吸收峰，1701cm－1為－COOH中C=O的伸縮振動吸收峰;植物甾烷醇紅外光譜中，3426cm－1為醇－OH的伸縮振動吸收峰，1042cm－1為C－O的伸縮振動吸收峰;植物甾烷醇酯紅外光譜中，1739cm－1為酯鍵的C=O的伸縮振動吸收峰，且2500～3300cm－1處－COOH中－OH的伸縮振動吸收峰和3426cm－1處醇－OH的伸縮振動吸收峰消失，說明生成了酯。

質(zhì)譜分析:電噴霧電離(ESI)是很弱的電離方法，通常沒有碎片離子峰，只有整體分子的峰。谷甾烷醇酯和菜籽甾烷醇酯的相對分子量分別為598和584，質(zhì)譜分析圖出現(xiàn)的621和607分別為谷甾烷醇酯和菜籽甾烷醇酯的［M+Na］質(zhì)譜信號。由此可以斷定，該物質(zhì)即為植物甾烷醇酯。

圖2 紅外光譜圖

2.2 高效液相色譜分析

圖3 植物甾烷醇酯合成反應(yīng)液HPLC圖

近年來，HPLC已被廣泛用于許多生物成分的分離和分析工作，研究用HPLC分離植物甾烷醇酯的方法，選擇正己烷/甲醇(90∶10，v/v)洗脫，利用HPLC可以從植物甾烷醇酯的反應(yīng)液中分離純化植物甾烷醇酯，HPLC分析圖譜見圖3。圖3為植物甾烷醇酯反應(yīng)液的 HPLC圖，1.75min為月桂酸，5.90min為植物甾烷醇。因植物甾烷醇酯主要包括谷甾烷醇酯和月桂酸菜籽甾烷醇酯，其保留時間分別為24.13、23.57min。由圖3可知，在該條件下HPLC能很好地從反應(yīng)液中分離植物甾烷醇酯。

2.3 植物甾烷醇酯的合成工藝優(yōu)化

2.3.1 碳鏈長度的影響 圖4為不同碳鏈長度的飽和脂肪酸對酯化率的影響。由圖可知，隨著脂肪酸碳鏈的逐漸延長，其酯化率由 34.1%逐漸降到28.7%，這種現(xiàn)象可能為空間位阻效應(yīng)所致［10］。相比而言，月桂酸對應(yīng)的酯化率最高，故在后續(xù)的研究中采用月桂酸。

圖4 不同碳鏈長度對酯化率的影響

2.3.2 有機溶劑的影響 固定化脂肪酶的催化活性與反應(yīng)體系介質(zhì)的極性有密切關(guān)系。通常，有機溶劑的非極性越高，固定化脂肪酶的催化活性就越強。這可能是由于在極性介質(zhì)中，溶劑通過破壞酶的氫鍵和疏水相互作用改變了酶的原始構(gòu)象。除此之外，選擇溶劑時還要考慮底物及產(chǎn)物的溶解性及其是否容易除去等因素［11－12］。

因植物甾烷醇和月桂酸不溶于水等強極性溶劑，故選擇中等極性和非極性的有機溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，而丙酮和正己烷正是常用的中等和非極性溶劑。正己烷與丙酮等量混合的溶劑其極性應(yīng)介于兩者之間。由表1可知，隨溶劑的極性由弱至強，相應(yīng)的酯化率逐漸降低。又由于植物甾烷醇、月桂酸及其生成的酯在正己烷中均有一定的溶解性，故選擇正己烷作為反應(yīng)介質(zhì)。

表1 不同溶劑對酯化率的影響

2.3.3 底物濃度的影響 底物濃度直接影響酯化率。底物濃度過大，不能充分反應(yīng);底物濃度過小，反應(yīng)速率變慢，降低酯化效率。為此在保持酸醇摩爾比為1∶1的前提下選取不同的植物甾烷醇濃度進行酯化反應(yīng)，結(jié)果見圖5。

由圖5可見，隨著甾烷醇濃度逐漸增大，其酯化率先升高后降低。當(dāng)濃度大于25μmol/mL時，其酯化率先快速下降后緩慢降低。這可能是因為底物只有溶解后才能參加反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^大時，大量的底物并非完全溶解，即大量底物并非參加反應(yīng)。濃度過低，底物之間或底物與脂肪酶相互接觸的機會減少，使得酯化率很低。據(jù)結(jié)果可知，底物濃度為25μmol/mL時為最優(yōu)底物濃度。

圖5 底物濃度對酯化率的影響

2.3.4 酸醇摩爾比的影響 酸醇摩爾比是影響酯化率的一個重要因素。脂肪酸與甾烷醇的酯化反應(yīng)為平衡反應(yīng)，理論上應(yīng)選擇等摩爾酸醇比。由于植物甾烷醇較月桂酸昂貴許多，故在選取酸醇比時應(yīng)使月桂酸過量。

圖6為不同酸醇比下的酯化率，從圖可看出，隨著酸醇摩爾比從1∶1增加至4∶1，其酯化率逐漸增加。48h時，其酯化率先從20.5%逐漸增至32.1%，然后降為24.1%;72h時，其酯化率先從34.1%逐漸增至56%，然后降至31.2%，當(dāng)增至5∶1時，其酯化率反而下降。這可能是由于隨著月桂酸的增加，大量的月桂酸溶于溶劑中使得植物甾烷醇的溶解量減少，即實際參加反應(yīng)的植物甾烷醇減少所致。

2.3.5 分子篩的影響 酯化反應(yīng)有水生成，添加分子篩可除去反應(yīng)中產(chǎn)生的水，推動反應(yīng)向合成的方向進行，有利于酯的生成。不同類型和用量的分子篩對酯化率的影響如圖7所示。

圖6 酸醇摩爾比對酯化率的影響

隨著添加量從0增至80mg/mL時，其酯化率逐漸增加。當(dāng)用量為80mg/mL時，其酯化率最高，且3?組稍高于4?組。這是因為隨著分子篩用量增加，反應(yīng)中的水除去的越多，越有利于向合成方向移動。但當(dāng)分子篩用量由80mg/mL增至100mg/mL時，其酯化率反而下降。這是由于分子篩添加過量，奪取酶催化所必需的水，酶部分失活，從而使催化能力下降，導(dǎo)致酯化率降低。因此選擇3?分子篩，用量為80mg/mL。

圖7 分子篩種類及數(shù)量對酯化率的影響

2.3.6 酶用量的影響 酶添加量對酯化率的影響如圖8所示，不難看出，不同添加量組隨著反應(yīng)時間的進行其酯化率不同程度地增加。當(dāng)反應(yīng)時間達48h時，隨著酶量的增加，酯化率逐漸增加，但當(dāng)酶濃度大于30mg/mL時，酯化率基本保持恒定。酶和一般的化學(xué)催化劑一樣，隨著用量的增加其轉(zhuǎn)化率增加，在達到一定的濃度后，其轉(zhuǎn)化率不再增加，趨于穩(wěn)定。這是由于底物已被酶全部飽和，增加酶用量也不能提高酯化率了。Novozym 435為固定化脂肪酶，因有固定化載體存在，造成了較高酶用量的情況下才能達到較為理想的酯化率［13］。根據(jù)結(jié)果可知，最佳酶用量為30mg/mL。

2.3.7 反應(yīng)溫度的影響 溫度對酯化率的影響如圖9所示。隨著溫度升高，其酯化率先增加后降低，在55℃達到最高。在酶的最適溫度以下，酶的活性被抑制，隨著溫度升高其活性逐漸增強，在最適溫度下，酶活最高。當(dāng)溫度高于最適溫度，酶逐漸失活。根據(jù)結(jié)果可知，最佳反應(yīng)溫度為55℃。

2.3.8 酶反應(yīng)的時間曲線 在上述因素考察的基礎(chǔ)上，用最優(yōu)組合作實驗反應(yīng)時間曲線，如圖10所示。從圖可知，在12～60h，酯化率上升很快，由18.2%上升到40.7%;60～96h，酯化率上升還較快，由40.7%增至79.3%;96～120h，酯化率上升比較慢，24h內(nèi)僅增加了三個百分點。因此，反應(yīng)時間為96h。

圖8 酶添加量對酯化率的影響

圖9 溫度對酯化率的影響

圖10 植物甾烷醇酯的時間曲線

3 結(jié)論

通過對酯化反應(yīng)各方面的考察，確定了最佳工藝條件:正己烷為溶媒，植物甾烷醇25μmol/mL，月桂酸100μmol/mL，脂肪酶Novozym 435 30mg/mL，3?分子篩80mg/mL，反應(yīng)溫度55℃，反應(yīng)時間96h，轉(zhuǎn)速150r/min。在最佳條件下，平行重復(fù)三次，其酯化率分別為79.3%、81.2%、80.4%，平均酯化率達到80.3%。

通過薄層色譜探索出的洗脫條件環(huán)己烷/乙酸乙酯(80∶20)能很好地分離植物甾烷醇酯，將該條件應(yīng)用于硅膠柱層析，可以分離得到較為純凈的植物甾烷醇酯。通過紅外光譜、質(zhì)譜對產(chǎn)物進行了表征，確定產(chǎn)物為植物甾烷醇酯。利用高效液相色譜技術(shù)，通過保留時間定性，峰面積定量，對合成的植物甾烷醇酯進行定量分析。

［1］Laura C，Joan C，F(xiàn)rancisco B.New insights into the molecular actions of plant sterols and stanols in cholesterol metabolism:Review［J］.Atherosclerosis，2009，203:18－31.

［2］Sridevi D，Ishwarlal J.The Role of Dietary Supplementation with Plant Sterols and Stanols in the Prevention of Cardiovascular Disease［J］.Nutrition Reviews，2006，7(1):348－354.

［3］Arienne J，Jogchum P，Ronald P.Metabolic effects of plant sterols and stanols(Review)［J］.Journal of Nutritional Chemistry，2003，14:362－369.

［4］Peter C.Plant sterol and stanols comparison and contrasts.Sterols versusstanolsin cholesterol－lowering:isthere a difference?［J］.Atherosclerosis Supplements，2002(3):5－9.

［5］Baker W，Baker E，Coleman C.The effect of plant sterols or stanols on lipid parameters in patients with type 2 diabetes:A meta－analysis［J］.Diabetes Research and Clinical Practice，2009，84:33－37.

［6］Weber N，Weikamp P，Mukherjee K.Cholesterol－lowering food additives:lipase－catalysed preparation of phytosterol and phytostanol esters［J］.Food Research International，2002，35:177－181.

［7］Kritchevsky D，Chen S.Phytosterols－h(huán)ealth benefits and potential concerns:a review［J］.Nutr Res，2005，25:413－428.

［8］Thompson G，Grundy S.History and Development of Plant Sterol and Stanol Esters for Cholesterol－Lowering Purposes［J］.The American Journal of Cardiology，2005，96(1A).

［9］李瑞，張曉鳴.有機相脂肪酶催化合成共軛亞油酸β－谷甾醇酯的研究［J］.中國油脂，2006，31(2):56－59.

［10］Liu Y，Lotero E，James G.Effect of carbon chain length on esterification ofcarboxylic acidswith methanolusing acid catalysis［J］.Journal of Catalysis，2006，243:221－228.

［11］Zaks A，Klibanov A.The effect of water on enzyme action in organic media［J］.J Biotechnol，1998，14:157－167.

［12］Soumanou M，Bornscheuer U.Improvement in lipasecatalyzed synthesis of fatty acid methyl esters from sunflower oil［J］.Enzyme Microb Technol，2003，33:97－103.

［13］姚曉玲，黃琴，陳茂彬.有機介質(zhì)中酶催化合成月桂酸甾醇酯［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(7):15－17.

Study on lipase－catalyzed synthesis of phytostanol laurate

HE Wen－sen，JIA Cheng－sheng，ZHANG Xiao－ming，F(xiàn)ENG Biao*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

Lipase－catalyzed synthesis of phytostanol with lauric acid in the presence of Novozym 435(from Candida antarctica B)as catalyst in organic medium was investigated.Effects of different reaction parameters，such as the type of solvent，enzyme load，molecular sieve type and concentration，reaction temperature，substrates molar ratio and different fatty acids as acyl donors were studied.It was shown that the highest phytostanyl laurate conversion of

80.3%was obtained under optimal conditions:25μmol/mL phytostanol，100μmol/mL lauric acid，80mg/mL 3? molecular sieve and 30mg/mL lipase at 150r/min and 55℃for 96h in 10mL of n－h(huán)exane.The chemical structure of phytostanyl laurate was confirmed by Fourier transformation－Infrared Spectroscopy，Mass Spectrometry.

lauric acid;phytostanyl laurate;lipase－catalyzed;cholesterol

TS201.2+2

B

1002－0306(2011)04－0213－05

2010－03－19 *通訊聯(lián)系人

何文森(1985－)，男，碩士研究生，研究方向:食品科學(xué)。

江南大學(xué)自主科研計劃(JUSRP30903)資助。