凍生蝦仁金黃色葡萄菌預(yù)測(cè)模型的建立用應(yīng)用

黃馳云，雷曉凌，洪鵬志，黃 和

(廣東省海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088)

凍生蝦仁金黃色葡萄菌預(yù)測(cè)模型的建立用應(yīng)用

黃馳云，雷曉凌*，洪鵬志，黃 和

(廣東省海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東湛江524088)

為得到生蝦仁中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)模型，以期對(duì)加工中遭受金黃色葡萄球菌污染后的增長(zhǎng)狀況進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)把金黃色葡萄球菌接種到生蝦仁，按生產(chǎn)工序擬定四個(gè)溫度(4、10、13、20℃)并測(cè)定該菌在不同溫度下菌落數(shù)的變化，采取3種常用方程進(jìn)行擬合，比較后得出各溫度的最適一級(jí)生長(zhǎng)模型，并建立二級(jí)模型。結(jié)果表明，10、20℃適合采用Gompertz模型，13℃為L(zhǎng)ogistic模型，4℃采用Linear模型;預(yù)測(cè)表明金黃色葡萄球菌在解凍工序增長(zhǎng)較明顯，增長(zhǎng)率9.7%;采用平方根方程擬合得到二級(jí)預(yù)測(cè)模型:模型驗(yàn)證表明預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值的殘差在±0.01內(nèi)，偏差因子和準(zhǔn)確因子在可接受范圍內(nèi)，表明模型有效，用于生產(chǎn)預(yù)測(cè)，具有一定參考價(jià)值。

生蝦仁，金黃色葡萄球菌，生長(zhǎng)模型，預(yù)測(cè)微生物

南美白對(duì)蝦從上世紀(jì)80年代末引進(jìn)我國(guó)，20多年來(lái)，我國(guó)特別是華南地區(qū)的南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)已發(fā)展成育苗、飼料、養(yǎng)殖、加工、出口的完整產(chǎn)業(yè)鏈。但近年來(lái)國(guó)際市場(chǎng)“綠色壁壘”日益森嚴(yán)，許多國(guó)家不斷提高對(duì)蝦等水產(chǎn)品的準(zhǔn)入門(mén)檻，我國(guó)水產(chǎn)品出口屢次遭遇歐盟和其他國(guó)家的技術(shù)性貿(mào)易壁壘，屢受沉重打擊［1］。金黃色葡萄球菌具有耐熱、耐低溫和耐鹽等特性，是食源性微生物污染的重要細(xì)菌。美國(guó)在歷年發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件中，金黃色葡萄球菌占第一位;在日本、英國(guó)和歐洲等一些國(guó)家占第二位［2］。我國(guó)每年發(fā)生金黃色葡萄球菌腸毒素中毒事件也非常多，引起我國(guó)衛(wèi)生防疫和進(jìn)出口檢驗(yàn)等部門(mén)的廣泛重視［3］，水產(chǎn)品出口中金黃色葡萄球菌是必須檢驗(yàn)的項(xiàng)目。本實(shí)驗(yàn)擬用生蝦仁為培養(yǎng)介質(zhì)，采用較節(jié)省時(shí)間的顯色培養(yǎng)基法進(jìn)行定量檢測(cè)［4］，建立生蝦仁中金黃色葡萄球菌的一級(jí)、二級(jí)生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型，并對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證，以備將來(lái)應(yīng)用于生蝦仁加工環(huán)節(jié)的智能化監(jiān)控，達(dá)到降低金黃色葡

表1 各溫度下蝦仁中金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)模型擬合參數(shù)及采用的生長(zhǎng)模型

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

凍生蝦仁 400g，某水產(chǎn)加工出口企業(yè)提供;金黃色葡萄球菌菌種 實(shí)驗(yàn)室提供;營(yíng)養(yǎng)瓊脂 北京陸橋公司;金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基 科瑪嘉公司。

生化培養(yǎng)箱SPX－250B型 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;西門(mén)子電冰箱CD－222型 博西華家用電器有限公司;潔凈工作臺(tái)SW－CJ－1F型、手提式壓力蒸汽滅菌鍋YXQ－SG46－280S型 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備菌懸液及人工染菌 向營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面中接入金黃色葡萄球菌菌種，37℃培養(yǎng)24h，按同樣方法活化3次后添加生理鹽水，并刮松菌苔振蕩搖勻，梯度稀釋至適當(dāng)濃度，得到菌懸液［5］。

將蝦仁用無(wú)菌蒸餾水沖洗雜質(zhì)后分裝到4個(gè)無(wú)菌燒杯中，各100g，將菌懸液緩慢倒入各燒杯中，和蝦仁攪拌均勻，持續(xù)20s后倒掉懸液，染菌濃度約102～103cfu/g。用保鮮紙蓋嚴(yán)后分別放入4℃冰箱和10、13、20℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 分時(shí)段菌數(shù)計(jì)數(shù) 每次計(jì)數(shù)時(shí)分別從各燒杯中取10g蝦仁，剪碎后投入盛有90mL無(wú)菌生理鹽水的三角瓶充分搖勻，生理鹽水梯度稀釋后，用顯色培養(yǎng)基進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，37℃培養(yǎng)24h得計(jì)數(shù)結(jié)果。具體為4℃下每24h計(jì)數(shù)一次;10、13、20℃下每12h計(jì)數(shù)一次。

1.2.3 建立金黃色葡萄球菌預(yù)測(cè)模型 用Curve expert軟件，10、13、20℃ 的數(shù)據(jù)建立 Gompertz、Logistic模型，4℃建立Linear模型。通過(guò)比較各模型的標(biāo)準(zhǔn)差S和相關(guān)系數(shù)R以確定最適擬合方程。

在一級(jí)模型的基礎(chǔ)上，對(duì)所得到各溫度下的生長(zhǎng)速度進(jìn)行線性擬合，得到金黃色葡萄球菌的二級(jí)平方根模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌各溫度的一級(jí)預(yù)測(cè)模型

2.1.1 建立10、13、20℃金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)模型

采用Gompertz、Logistic方程對(duì)10、13、20℃下生蝦仁中金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)數(shù)進(jìn)行擬合［log(Nt/N0)為因變量，時(shí)間t為自變量］，擬合結(jié)果見(jiàn)表1。

目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)ogistic模型和Gompertz模型的預(yù)測(cè)效果較好，較廣泛應(yīng)用于微生物生長(zhǎng)模型的擬合［6］。表1各擬合方程的標(biāo)準(zhǔn)差和相關(guān)系數(shù)顯示，在10、20℃下用Gompertz方程擬合蝦仁中金黃色葡萄球菌一級(jí)生長(zhǎng)模型較好，在 13℃下則采用Logistic方程較合適。2.1.2 金黃色葡萄球菌在4℃下的失活模型 采用Linear方程，以4℃下蝦仁中金黃色葡萄球菌失活模型［log(Nt/N0)為因變量，時(shí)間t為自變量］，得到擬合方程 log(Nt/N0)=－0.0342－0.0024×t，標(biāo)準(zhǔn)差為0.0281，相關(guān)系數(shù)為0.9788，擬合度高。

圖1～圖4的四種溫度最適模型擬合圖顯示，10℃下金黃色葡萄球菌緩慢生長(zhǎng)，36h即已進(jìn)入穩(wěn)定期;13℃下，48h內(nèi)菌數(shù)穩(wěn)定增長(zhǎng)，log(Nt/N0)最大值是10℃下的5倍以上，蝦肉中腐敗菌的生長(zhǎng)對(duì)金黃色葡萄球菌起較強(qiáng)抑制作用，36h后金黃色葡萄球菌增長(zhǎng)減慢;20℃下金黃色葡萄球菌在感染蝦仁后的12h內(nèi)生長(zhǎng)較13℃慢，之后迅速增長(zhǎng)，由于溫度較高，蝦肉中腐敗菌及其他細(xì)菌的強(qiáng)抑制使得48h后金黃色葡萄球菌數(shù)開(kāi)始增速減慢，60h趨于平緩。4℃下，金黃色葡萄球菌數(shù)在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)緩慢下降，120h后趨于平緩，說(shuō)明采用4℃環(huán)境能抑制蝦肉中金黃色葡萄球菌的增長(zhǎng)，但菌體減速緩慢。

圖1 10℃蝦仁中金黃色葡萄球菌的Gompertz生長(zhǎng)模型

圖2 13℃蝦仁中金黃色葡萄球菌的Logistic生長(zhǎng)模型

2.2 凍生蝦仁加工過(guò)程中金黃色葡萄球菌預(yù)測(cè)模型實(shí)際應(yīng)用

表3 由Gompertz模型和Logistic模型所得的生長(zhǎng)參數(shù)(

表3 由Gompertz模型和Logistic模型所得的生長(zhǎng)參數(shù)(

溫度(℃) 模型方程umax 10 log(Nt/N0)=0.2169×e－e1.2762－0.1221×t 0.0987 13 log(Nt/N0)=1.2398/(1+18.5998×e－0.1361×t) 0.1565 20 log(Nt/N0)=1.4894×e－e1.9224－0.0981×t 0.2318

圖4 4℃蝦仁中金黃色葡萄球菌的Linear失活模型

2.2.1 凍生蝦仁的主要加工工序 出口凍生蝦仁每步加工工序蝦肉溫度均不相同，經(jīng)對(duì)加工過(guò)程實(shí)地考察并記錄平均溫度和工序時(shí)間，將其中溫度較高，持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)的工序定為關(guān)鍵控制工序，并納入模型的建立和預(yù)測(cè)，其他工序時(shí)間短或轉(zhuǎn)換快，影響忽略不計(jì)。圖5為關(guān)鍵工序及相應(yīng)的溫度和持續(xù)時(shí)間。

圖5 凍生蝦仁關(guān)鍵工序的溫度及持續(xù)時(shí)間

2.2.2 凍生蝦仁加工過(guò)程中金黃色葡萄球菌增長(zhǎng)水平預(yù)測(cè) 通過(guò)所得預(yù)測(cè)模型可以查出在生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)鍵控制點(diǎn)［7］。采用所得到的模擬方程進(jìn)行菌數(shù)水平預(yù)測(cè)。假定生蝦仁中金黃色葡萄球菌初始值為10cfu/g，按四步關(guān)鍵工序預(yù)測(cè)每步工序菌數(shù)的變化。

表2所示，解凍工序金黃色葡萄球菌數(shù)的增長(zhǎng)率最高，為9.7%，剝殼和泡藥時(shí)間對(duì)菌數(shù)影響較小，冰存條件下菌數(shù)減少5.2%。該結(jié)果表明解凍過(guò)程中金黃色葡萄球菌易大量生長(zhǎng)，是整個(gè)流程的關(guān)鍵控制點(diǎn)，冰存能較好抑制菌數(shù)增長(zhǎng)。

2.3 凍生蝦仁中金黃色葡萄球菌的二級(jí)預(yù)測(cè)模型

2.3.1 溫度－生長(zhǎng)速率二級(jí)預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建 采用平方根模型建立二級(jí)模型，其形式為:Tmin)，b為系數(shù)，Tmin為理論最低生長(zhǎng)溫度，即回歸線延長(zhǎng)線與溫度軸相交所得的溫度。在4℃下生蝦仁中金黃色葡萄球菌數(shù)目呈遞減趨勢(shì)，一級(jí)模型為存活模型而非生長(zhǎng)模型，因而平方根二級(jí)模型采用10、13、20℃的最大比生長(zhǎng)速率(umax·h－1)的平方根。通過(guò)線性回歸，得出回歸方程umax=0.0129T－0.0220，Tmin=1.71℃，相關(guān)系數(shù)R2=0.9886，結(jié)果如表3和圖6所示。

平方根模型得到的最低生長(zhǎng)溫度為1.71℃。微生物在極端條件下的生長(zhǎng)速率一般難以確定，在不同介質(zhì)環(huán)境生長(zhǎng)速率也不同［8－9］。在4℃下金黃色葡萄球菌數(shù)逐步下降，與1.71℃較接近，該最低生長(zhǎng)溫度仍有一定參考意義，平方根模型具有較好的適用性。圖6中10～20℃范圍里，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)速率與溫度具有良好的線性關(guān)系，擬合度較高。

圖6 生蝦仁中金黃色葡萄球菌二級(jí)模型

2.3.2 溫度－生長(zhǎng)速率二級(jí)預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證 采用殘差法驗(yàn)證二級(jí)預(yù)測(cè)模型。表4為不同溫度下金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速率的觀測(cè)值和預(yù)測(cè)值，預(yù)測(cè)值減觀測(cè)值為殘差。所有的殘差值均在－0.01與0.01之間，殘差大小與預(yù)測(cè)值的順序無(wú)關(guān)，預(yù)測(cè)模型在ɑ=0.01水平可信［10］。

表4 金黃色葡萄球菌二級(jí)預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證分析

引入偏差性因子和準(zhǔn)確性因子對(duì)預(yù)測(cè)值和觀測(cè)值分析，因子公式見(jiàn)表5。模型的可接受條件為偏差因子在0.75和1.25之間［11］。準(zhǔn)確性因子衡量預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的平均誤差，越接近1則表明兩者吻合，準(zhǔn)確度高。該因子在1.1～1.9之間均可接受。通過(guò)計(jì)算得到模型的偏差性因子和準(zhǔn)確性因子均符合模型可接受條件的要求，該模型可較好反映生蝦仁中金黃色葡萄球菌在不同溫度下生長(zhǎng)速率的快慢情況。

表5 金黃色葡萄球菌二級(jí)模型偏差性、準(zhǔn)確性分析

3 結(jié)論

本研究得到生蝦仁中金黃色葡萄球菌在四個(gè)不同加工環(huán)節(jié)的一級(jí)預(yù)測(cè)模型，以及描述溫度和生長(zhǎng)速率關(guān)系的二級(jí)模型。從運(yùn)用模型預(yù)測(cè)金黃色葡萄球菌在實(shí)際加工工序的增長(zhǎng)狀況看，假定蝦體解凍前初始金黃色葡萄球菌數(shù)為10cfu/g，經(jīng)過(guò)四步關(guān)鍵工序后增長(zhǎng)至10.63cfu/g，增長(zhǎng)6.3%。四步工序中，解凍工序溫度較高，菌落增加最快，因此該工序應(yīng)避免粗放式解凍，對(duì)其解凍溫度進(jìn)行跟蹤，且盡可能做到解凍松塊后即進(jìn)入剝殼工序，減少金黃色葡萄球菌快速增長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。盡管剝殼工序中菌數(shù)增長(zhǎng)較少，但人手頻繁接觸蝦體，且有相關(guān)報(bào)道凍蝦仁生產(chǎn)車(chē)間的部分工作臺(tái)、多數(shù)作業(yè)手套污染較為嚴(yán)重［12］，因此半成品感染的可能性不能忽視，工作服、手套需嚴(yán)格按規(guī)定進(jìn)行嚴(yán)格消毒，盡可能降低剝殼過(guò)程感染金黃色葡萄球菌的幾率。冰存工序中低溫保存對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制能力，可通過(guò)調(diào)整工序時(shí)間，如增加工人加快批量剝殼速度以換取較長(zhǎng)的冰存時(shí)間，減少金黃色葡萄球菌風(fēng)險(xiǎn)，提高產(chǎn)品食用安全性。

本研究以生蝦仁作培養(yǎng)基質(zhì)，成分復(fù)雜，菌相非單一，把菌間可能存在的相互促進(jìn)或抑制作用納入作為考慮因素，一定程度上提高了模型預(yù)測(cè)的可靠性。

溫度是影響微生物生長(zhǎng)的主導(dǎo)因素［13］，金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)除受溫度影響外，還受其他環(huán)境因素的影響。Bunchana等曾在建立金黃色葡萄球菌的溫度、pH、NaCl、NO2的單因素模型基礎(chǔ)上得到多因素響應(yīng)面模型，T.P.Oscar等研究低初始菌數(shù)和高初始菌數(shù)對(duì)模型的影響［14］，但增加參數(shù)同時(shí)也增加建模難度及模型的復(fù)雜度，不利于應(yīng)用［15］。在凍生蝦仁加工出口企業(yè)實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，溫度是最容易進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)督和給予及時(shí)調(diào)控的重要參數(shù)，通過(guò)建立金黃色葡萄球菌在凍生蝦仁的一級(jí)預(yù)測(cè)模型和溫度－生長(zhǎng)速率二級(jí)預(yù)測(cè)模型進(jìn)行安全評(píng)價(jià)符合生產(chǎn)實(shí)際，且操作簡(jiǎn)單，預(yù)測(cè)及時(shí)，節(jié)約大量時(shí)間和費(fèi)用［16］，為建立安全預(yù)警機(jī)制和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系提供理論依據(jù)［17］。

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Establishment and application of predictive growth model of Staphylococcus aureus in the frozen fresh shelled shrimp

HUANG Chi－yun，LEI Xiao－ling*，HONG Peng－zhi，HUANG He
(Food Science and Technology College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang 524088，China)

This paper was aimed to establish the growth model of Staphylococcus aureus in the frozen shelled shrimp，in order to predict the growth of Staphylococcus aureus in the shrimps during processing.Inoculations of Staphylococcus aureus to the frozen shelled shrimps were carried out.According to the actual situation of the process，four different temperatures(4，10，13，20℃)were selected to determine the Staphylococcus aureus growth in frozen shelled shrimp.Two kinds of equations were used to fit the data which result in the optimum primary growth models after comparison，thus established the secondary growth model.The fitting results showed that Gompertz equation was best for 10℃ and 20℃ growth model，Logistic equation was best for 13℃ growth model，Linear equation was adopted for 4℃.Predictions in processing by models indicated that obvious growth of Staphylococcus aureus could be found in the processes of unfreezing，the growth rate were 9.7%.The square root equation was adopted to get the secondary predictive model:Model validation showed that the residual errors of predicted value and measured value were within±0.01，factors of deviation and accuracy were in acceptable range.The model possessed good dependability that can be useful for microbe prediction in processing.

fresh shelled shrimp;Staphylococcus aureus;growth model;predictive microorganism

TS254.1

A

1002－0306(2011)04－0081－04

2010－01－21 *通訊聯(lián)系人

黃馳云(1984－)，男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品安全的研究。

國(guó)家科技部支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAK02A22)。