羥基酪醇酶促聚合產(chǎn)物的表征及其抗氧化和熱穩(wěn)定性

謝普軍，黃立新,*，張彩虹，丁莎莎，鄧葉俊，王曉杰

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所，生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實驗室，國家林業(yè)局林產(chǎn)化學(xué)工程重點開放性實驗室，江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042；2.南京林業(yè)大學(xué)林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同中心，江蘇 南京 210037）

羥基酪醇（hydroxytyrosol，HT）也稱3,4-二羥基苯乙醇，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，是一種天然小分子酚類化合物，廣泛存在于油橄欖果、葉、初榨橄欖油和尤其富含于油橄欖榨油廠的廢水中[1]，具有抗氧化[2-3]、抗炎[4]、抗癌[5]、保護心血管疾病[6]和降血糖[7]等活性功能。HT是最具有清除自由基活性的天然抗氧化劑之一，其自由基清除率是槲皮素的2 倍、表兒茶酸的3 倍，在保健品、藥品和化妝品領(lǐng)域均有極為廣泛的應(yīng)用[8]。然而，研究表明，對HT的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，存在抗氧化性的熱穩(wěn)定性較低，常溫存貯時容易發(fā)生氧化變質(zhì)等問題[9]。通常采用對HT結(jié)構(gòu)中羥基進行酯化或?；确椒ㄟM行改性，雖然提高了穩(wěn)定性，但卻降低了抗氧化性。如Pereira-Caro等[10]對HT進行羥基醚化反應(yīng)，但HT醚化產(chǎn)物的抗氧化性降低。而利用生物酶對HT進行催化氧化聚合反應(yīng)，形成的聚合物不僅能提高抗氧化性還能改善熱穩(wěn)定性[11]。漆酶（p-diphenol:oxygen oxidoreductase EC1.10.3.2.）是一種含銅離子的多酚氧化酶，與植物抗壞血酸氧化酶和哺乳動物血漿銅藍蛋白同屬于銅藍蛋白家族[12]。廣泛存在于日本紫膠漆樹（Rhus vernicifera）、白腐菌中[13]。漆酶可催化多酚、甲基替代單酚、芳香胺、苯硫醇等易氧化的底物，具有作用底物廣，專一性和穩(wěn)定性高等特點[14]。

圖1 HT化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structure of hydroxytyrosol

基于此，本實驗以HT和漆酶分別為底物和催化劑進行HT的聚合反應(yīng)，通過紫外-可見（ultraviolet-visible，UV-Vis）分光光度計、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）、凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS）對聚合產(chǎn)物進行表征，同時評價其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的抗氧化和熱穩(wěn)定性，為HT的應(yīng)用提供一定實踐和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HT、漆酶（源自彩絨革蓋菌，Coriolus versicolor）美國Sigma-Aldrich試劑有限公司；甲醇（色譜純）美國Tedia試劑有限公司；DPPH、2,2’-連氮-雙-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）（均為色譜純） 西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；乙酸、乙酸鈉 南京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6 UV-Vis分光光度計 北京普析分析通用儀器有限公司；5973 HPLC-MS儀（電噴霧離子源） 美國安捷倫儀器有限公司；IS10 FTIR儀、Hypersil ODS2 C18色譜柱 美國賽默飛儀器有限公司；GPC-2410示差折光檢測器、1515等梯度HPLC、2414示差折光器 美國Waters公司；209F3熱重（thermogravimetry，TG）分析儀德國Netzsch公司；GPC KD-802色譜柱 日本昭和電工株式會社；SDTQ600型綜合熱分析儀 美國TA公司。

1.3 方法

1.3.1 漆酶活性的測定

配制pH 5.0、0.05 mol/L的HAc-NaAc緩沖液和 0.5 mmol/L ABTS溶液，在25 ℃預(yù)熱酶液及ABTS溶液。測定漆酶活性時，取2.9 mL預(yù)熱的ABTS溶液，加入0.1 mL稀釋后的漆酶溶液（酶質(zhì)量濃度1.8 g/L），迅速搖晃使兩者充分混合。用UV-Vis分光光度計記錄 420 nm波長處混合液的吸光度從一點（A1）變化到另一點（A2）所經(jīng)歷的時間，A1與A2之間的吸光度差值統(tǒng)一為0.2，測定所用漆酶活性。一個漆酶活力單位（U）是指：漆酶在1 min 轉(zhuǎn)化 1 μmol ABTS，使產(chǎn)物ABTS＋·濃度從a增加至b[15]。漆酶活性計算公式為：

式中：k＝0.049 2；ABTS＋·濃度增加量ΔA為0.2；ΔT為吸光度變化所經(jīng)歷的時間/s；V0為酶活測試底物和酶液的總體積/mL；V1為漆酶溶液體積/mL；C為漆酶質(zhì)量濃度/（g/L）。

1.3.2 酶促氧化聚合反應(yīng)

就聚合反應(yīng)而言，3.4 mmol/L的HT溶解于50 mL乙酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 5）。該酶促聚合反應(yīng)初始添加漆酶溶液（1.8 g/L，約10 mL）。將載有不同試劑的燒瓶置于50 ℃反應(yīng)5 h，再高溫使漆酶失活。酶促反應(yīng)過程中，該反應(yīng)的媒介顏色逐漸加深可用于指示聚合反應(yīng)的大體進程，聚合反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)容器置于4 ℃冰箱24 h，使其聚合產(chǎn)物沉淀。然后沉淀物通過離心獲得，并用丙酮-去離子水（1∶3，V/V）的混合溶劑洗滌若干次以去除未反應(yīng)的酚類化合物與漆酶。生成的聚合物置于凍干機中除去溶劑，再置于干燥器中備用。

1.3.3 HPLC-MS儀器條件

HPLC條件：色譜柱：Hypersil ODS2 C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：A：0.1%醋酸溶液；B：甲醇，柱溫25 ℃。梯度洗脫條件：0 min 0% B，30 min 30% B，50 min 40% B，60 min 45% B，80 min 100% B和100 min 0% B，檢測波長280 nm，流速0.3 mL/min，進樣量20 μL。

MS條件：離子源為電噴霧離子源，負(fù)離子模式。掃描范圍m/z 100～1 000，干燥氣體（N2）干燥器體積流量10 L/min；干燥器溫度340 ℃，霧化器壓力206.85 kPa。液相色譜與質(zhì)譜之間分流，進入質(zhì)譜的流速為0.5 mL/min。

1.3.4 FTIR分析

原料及酶促反應(yīng)產(chǎn)物都需要進行FTIR，以8 cm-1分辨率室溫下進行400～4 000 cm-1掃描。

1.3.5 GPC分析

由1515等梯度HPLC泵、2414示差折光器和GPC KD-802色譜柱組成。所有樣品溶解于四氫呋喃（HPLC級），進樣量30 μg，進樣速率1.5 mL/min，柱溫35 ℃。標(biāo)準(zhǔn)曲線通過使用聚乙二醇（分子質(zhì)量400～612 000 Da）進行繪制，也用于計算平均分子質(zhì)量和聚合度。

1.3.6 DPPH自由基清除能力

配制不同質(zhì)量濃度的純品HT，稱取10 mg DPPH于100 mL容量瓶中并用甲醇溶解得到0.1 mg/mL醇溶液作為母液，再準(zhǔn)確移取3.9 mL母液于具塞試管中，分別各加入0.1 mL不同濃度的HT聚合物、HT、VC和BHT，混合均勻后在黑暗處室溫反應(yīng)30 min，并在517 nm波長處測定各樣品的吸光度，進行清除DPPH自由基實驗，BHT標(biāo)準(zhǔn)品進行對比，考察HT和酶促聚合產(chǎn)物清除DPPH自由基抗氧化性能力。

式中：A0為DPPH醇溶液的初始吸光度；A1為反應(yīng)30 min后溶液的吸光度。

1.3.7 TG-FTIR聯(lián)用分析

保護氣為高純氮氣，流量為60 mL/min，升溫速率10 ℃/min，升溫范圍40～950 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶活性測定結(jié)果

以ABTS為底物，通過在420 nm波長處測定吸光度的變化來確定漆酶活性[16]。ABTS在漆酶的催化作用下可以迅速生成ABTS＋·，ABTS＋·在420 nm波長處的吸光系數(shù)遠(yuǎn)大于底物ABTS。隨著ABTS＋·濃度的增加，吸光度也變大。吸光度在規(guī)定范圍內(nèi)變化時所經(jīng)歷的時間則表示為漆酶活性[17]。

當(dāng)加入漆酶溶液至ABTS溶液后，在420 nm波長處每隔5 s中記錄吸光度，得到其經(jīng)歷的時間與吸光度的關(guān)系見圖2，漆酶催化ABTS的吸光度隨時間的延長呈線性增加，根據(jù)線性擬合得到如下方程：

Y＝0.099＋0.002 47X（R＝0.999，s＝0.005，N＝25，P＜0.000 1） （3）

根據(jù)公式（2）的R為0.999及標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.005，說明公式（3）線性擬合良好，且根據(jù)吸光度變化值0.2（ΔY=0.2）所經(jīng)歷的變化時間（ΔX=81）約為81 s，再代入公式（1）計算，獲得所購買的樣品漆酶活性為121.5 U/mL。

圖2 漆酶活性的測定Fig. 2 Determination of laccase activity

2.2 酶促聚合產(chǎn)物的表征

2.2.1 UV-Vis全掃描

圖3 HT聚合物的UV-Vis全波段掃描圖Fig. 3 UV-Vis absorption spectra of hydroxytyrosol polymers

圖4 HT酶促氧化聚合的反應(yīng)過程Fig. 4 Reaction process of hydroxytyrosol polymerization catalyzed by laccase

為掌握漆酶酶促酚類化物進程，利用UV-Vis檢測器對漆酶不同處理階段的反應(yīng)物每隔1 h進行測定。圖3為HT與漆酶催化HT隨時間（每隔1 h）的UV-Vis全波段掃描圖。圖3A表明HT的最大吸收波長為230 nm和280 nm。由圖3B～F可知，漆酶催化HT過程中可能產(chǎn)生了自由基，形成了不同的聚合物，類似Briggs-Rauscher的振蕩反應(yīng)形成的圖譜[18-19]，隨著時間的延長，振蕩吸收帶寬變長，說明聚合反應(yīng)持續(xù)劇烈進行。5 h后漆酶酶促氧化聚合反應(yīng)完全，可能的反應(yīng)歷程如圖4所示，有2 類HT聚合物形成[20]。

2.2.2 FTIR分析

圖5 HT與HT聚合物的FTIRFig. 5 FTIR spectra of hydroxytyrosol and its polymer

由圖5可知，HT在波數(shù)為3 446 cm-1的羥基的O—H伸縮振動，而HT聚合物則在波數(shù)3 353 cm-1的羥基的O—H伸縮振動，且形成更寬的吸收峰。這些現(xiàn)象是由HT聚合物較HT具有更強的分子內(nèi)氫鍵作用力導(dǎo)致的[21]。在2 960 cm-1HT聚合物較HT有更強的吸收峰，為C—H伸縮振動，HT和HT聚合物的C＝C不對稱伸縮振動吸收峰的波數(shù)分別在1 635 cm-1和1 610 cm-1，HT和HT聚合物的C—O伸縮振動吸收峰的波數(shù)分別在1 046 cm-1和1 037 cm-1，HT和HT聚合物的O—H面內(nèi)彎曲振動1 380 cm-1和1 371 cm-1[22]。

通過對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行分析可知：當(dāng)強蝕變巖且渣體以碎屑狀為主、塊狀渣體(≤10 cm)占比5%時，試驗2、試驗3的灌漿材料發(fā)泡倍數(shù)分別為2倍～3倍、5倍～10倍時，渣體固結(jié)強度分別對應(yīng)10 MPa、5 MPa；當(dāng)強蝕變巖且渣體以碎屑狀為主、塊狀渣體(≤10 cm)占比10%時，試驗4的灌漿材料發(fā)泡倍數(shù)調(diào)整為2倍～3倍時，試塊最大固結(jié)強度僅為3.5 MPa左右；此外，不論何種注漿方式，側(cè)面取樣強度要高于頂面取樣強度值。

2.3 GPC和HPLC-MS檢測結(jié)果

多分散性指數(shù)也即分布寬度指數(shù)D（分散度）用于衡量聚合物分子質(zhì)量分布的廣度，其定義如下：D為mw/mn，當(dāng)D為1時，所有鏈長都相等的單分散聚合物（如蛋白質(zhì)）是均一分子質(zhì)量的聚合物；D值大于1時，D值越大，其分子質(zhì)量分布越寬，多分散性程度越大。逐步聚合反應(yīng)生成高聚物的D值通常在2.0左右，而連鎖聚合反應(yīng)產(chǎn)物的D值在1.5～2.0之間[23]。

漆酶酶促聚合HT為逐步聚合反應(yīng)生成高聚物，由圖6A可知，HT聚合物出峰時間在10～18 min，通過與聚乙二醇（分子質(zhì)量400～612 000 Da）標(biāo)準(zhǔn)曲線進行對比，得到的mn為547 Da，mw為1 152 Da，mz為4 885 Da，一般情況下，具有多分散樣品，mn＜mw＜mz[24]。由此可知，分布寬度指數(shù)D（分散度）= mw/mn= 2.1，HT經(jīng)漆酶氧化聚合反應(yīng)可能是逐步聚合的過程，由圖6B可知，峰從右到左的分子質(zhì)量（mw）分別為1 370、914、608、458 Da和306 Da，由此對應(yīng)的聚合度分別為9、6、4、3、2，從積分面積分析主要以聚合物度3、4、6的化合物為主。

圖6 HT聚合物的GPC圖Fig. 6 GPC of hydroxytyrosol polymer

為進一步驗證HT聚合物的聚合度，使用HPLC-MS，負(fù)電模式下檢測其分子離子，由于HPLC-MS中質(zhì)譜的最大負(fù)離子峰為1 000，因此，聚合度大于6的HT聚合物，則無法檢測到[25]。由圖7可知，HT酶促聚合的產(chǎn)物包括4種，分別為：1）HT二聚體（[M-H]-質(zhì)譜離子信號峰，305.2；得到[M]，306.2；圖7A）；2）HT三聚體（[MH]-質(zhì)譜離子信號峰，457.3；得到[M]，458.3；圖7B）；3）HT四聚體（[M?H]?質(zhì)譜離子信號峰，607.3；得到[M]，608.3；圖7C）；4）HT六聚體：（[M-H]-質(zhì)譜離子信號峰，913.5；得到[M]，914.5；圖7D）。

圖7 HT聚合物的HPLC-MSFig. 7 HPLC-MS of hydroxytyrosol polymers

2.4 抗氧化性評價

為測定HT及其聚合物清除DPPH自由基能力，以VC和BHT為陽性對照。由圖8可知，IC50（HT聚合物）為0.25 mg/mL，IC50（HT）為 0.57 mg/mL，IC50（BHT）為1.4 mg/mL和IC50（VC）為0.18 mg/mL。因此，HT聚合物較HT更強清除DPPH自由基，約是其2.28 倍，較VC的清除DPPH自由基能力更弱，約是后者的72%，而HT的清除DPPH自由基比BHT明顯更強，清除DPPH自由基的能力約是BHT的2.5 倍。因其具有高效的抗氧化性使其可在食品、藥品和化妝品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

圖8 HT與其聚合物清除DPPH自由基Fig. 8 Scavenging effect of HT and its polymer on DPPH radicals

2.5 熱穩(wěn)定性評價

圖9 VC（A）、BHT（B）、HT（C）和HT聚合物（D）的熱重圖Fig. 9 TG-DTG of VC (A), BHT (B), HT (C) and HT polymers (D)

由圖9可知，VC在溫度207～250 ℃開始質(zhì)量損失加快，在溫度228.1 ℃左右質(zhì)量損失率達到峰值，最后殘余質(zhì)量為初始值的23.93%。BHT在溫度206～250 ℃開始質(zhì)量損失加快，在溫度236.2 ℃左右質(zhì)量損失率達到峰值，最后殘余質(zhì)量為0%。HT在溫度271～350 ℃開始發(fā)生劇烈質(zhì)量損失，在溫度314.9 ℃左右質(zhì)量損失率達到峰值，最后殘余質(zhì)量為18.02%。HT聚合物在溫度40～100 ℃開始發(fā)生劇烈質(zhì)量損失，在溫度77.8 ℃左右質(zhì)量損失率達到峰值，隨后在250～450 ℃開始發(fā)生劇烈質(zhì)量損失，在溫度315.1 ℃左右質(zhì)量損失率達到峰值，最后殘余質(zhì)量為66.09%。由圖9D可知，HT聚合物開始出現(xiàn)質(zhì)量損失溫度降低，可能是由于HT聚合物富含親水性羥基，容易與酶促反應(yīng)體系中的水結(jié)合，形成了聚合物-水的復(fù)合物[26]。從而使其在0～100 ℃加熱過程中就出現(xiàn)形成的結(jié)合水先脫去的質(zhì)量損失現(xiàn)象，且HT聚合物在100 ℃以內(nèi)并沒有化學(xué)鍵的斷裂。另外，由于該聚合物是二、三、四和六聚體的混合物，其中二聚體與HT的熱重微分曲線（differential thermal gravity，DTG）峰值溫度相近，熱穩(wěn)定性相似，而三、四和六聚體熱穩(wěn)定性更高。此外，基于最后殘余質(zhì)量百分比值可知，HT聚合物（66.09%）顯著大于HT（18.02%）?；跇悠钒l(fā)生劇烈質(zhì)量損失率的峰值溫度結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HT聚合物與HT具有相似的熱穩(wěn)定性，但較VC和BHT表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性。此外，基于殘留質(zhì)量所占百分?jǐn)?shù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HT聚合物是所有樣品的耐熱程度表現(xiàn)最好的。綜合上述結(jié)果表明，HT聚合物穩(wěn)定性較HT具有更強的熱穩(wěn)定性（VC初始質(zhì)量：20.18 mg；BHT初始質(zhì)量：218.14 mg；HT初始質(zhì)量：316.26 mg；HT聚合物初始質(zhì)量：49.49mg）。

圖10為VC、BHT、HT和HT聚合物的0～100 min內(nèi)組合形成的三維FTIR吸收光譜圖。VC特征吸收峰為：在3 500 cm-1處為O—H的伸縮振動，2 350 cm-1為CO2的不對稱伸縮振動（中間過程出現(xiàn)的3 020 cm-1特征吸收為C＝C—H的伸縮振動，而后消失），1 510 cm-1為C＝C的伸縮振動，660 cm-1為C—H彎曲振動。基于FTIR結(jié)果可知，VC隨著溫度升高，分子內(nèi)先脫水，形成碳碳雙鍵，再進一步使內(nèi)酯鍵斷裂脫羧基（中間產(chǎn)物CO2生成）[27]。

HT的特征吸收峰為鄰二苯酚羥基、苯環(huán)、烷烴和醇羥基官能團吸收。3 300～3 700 cm-1為酚羥基和醇羥基中O—H的伸縮振動，3 100～3 190 cm-1為苯環(huán)上C＝C—H的伸縮振動，還包括苯環(huán)中C＝C 1 200 cm-1的伸縮振動。C—H彎曲振動峰950 cm-1?；贔TIR結(jié)果可知，羥基先發(fā)生變化，醇羥基脫水形成C＝C 1 610 cm-1雙鍵，而酚羥基脫氫形成鄰醌結(jié)構(gòu)，形成了C＝O 1 750 cm-1[29-30]。

HT聚合物的特征吸收峰與HT有相似也有顯著不同，由于聚合物中含有聚合度為2～6。羥基的吸收更強，且1 500～1 700 cm-1，且對應(yīng)的峰寬較HT更強，HT偶合形成C—C聚合物鍵能大不易斷裂，而聚合物的羥基易發(fā)生斷裂形成烯烴、羰基。

圖10 VC（A）、BHT（B）、HT（C）和HT聚合物（D）的三維FTIR圖Fig. 10 Three dimensional IR spectra of VC (A), BHT (B), HT (C) and HT polymers (D)

3 結(jié) 論

本實驗以漆酶為催化劑，通過對HT進行氧化聚合，既提高其抗氧化性又增強穩(wěn)定性。采用UV-Vis、FTIR、GPC和HPLC-MS對聚合產(chǎn)物進行表征。結(jié)果表明，漆酶酶促氧化聚合HT的聚合物的聚合度為2、3、4、6和9，主要的聚合物HT的三聚體、四聚體和六聚體，所需的條件為酶活121.5 U/mL、反應(yīng)時間5 h、pH 5、反應(yīng)溫度50 ℃。HT聚合物清除DPPH自由基的抗氧化性較HT和BHT均更強，分別為其2.28 倍和5.7 倍，接近于VC，約是其72%。從峰值溫度和殘余質(zhì)量所占的比例的結(jié)果表明，HT聚合物（所占比例66.09%）為所有化合物中最高，也即穩(wěn)定性最強。