人體黏膜活組織模型在HIV-1性傳播途徑感染中的應(yīng)用

楊瑜，張曉燕,2

1 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

2 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 201508

人體黏膜活組織模型在HIV-1性傳播途徑感染中的應(yīng)用

楊瑜1，張曉燕1,2

1 上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508

2 復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，上海 201508

性傳播途徑已經(jīng)成為全球人免疫缺陷病毒1型 (Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) 傳播的主要方式。對(duì)HIV-1黏膜感染機(jī)制的深入理解，將有助于研發(fā)新型有效的生物技術(shù)阻斷其感染和傳播。目前，HIV-1黏膜感染機(jī)制的研究主要依賴于體外細(xì)胞培養(yǎng)和靈長類動(dòng)物模型。近年來，一種新型黏膜活組織模型 (包括人體生殖道或腸道黏膜等組織) 的建立，可再現(xiàn)HIV-1突破黏膜屏障進(jìn)入基底側(cè)的生物學(xué)過程，適用于 HIV-1黏膜感染機(jī)制與黏膜局部感染阻斷生物技術(shù)的臨床前有效性評(píng)價(jià)研究。以下主要闡述了該模型的組織類型、技術(shù)特點(diǎn)以及在 HIV-1性途徑感染機(jī)制與阻斷技術(shù)研究中的進(jìn)展，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室工作對(duì)其新的應(yīng)用進(jìn)行了展望。

人免疫缺陷病毒1型，性傳播，組織培養(yǎng)，模型應(yīng)用

Abstract:Sexual transmission has become the major route of acquiring human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) globally.Understanding the mechanism of HIV-1 mucosal infection will be helpful for development of new effective strategies to block HIV-1 mucosal transmission. Currently, study of the mechanism of HIV-1 mucosal infection majorly depends on in vitro cell culture systems and non-human primate animal models. Recently, a novel tissue explant model (including human vaginal-genital and colorectal tissue) was established, which could elucidate the biological process of HIV-1 mucosal infection from crossing over the membrane to reaching the basal. Therefore, the model can be applied to the study of mechanism, as well as the safety and efficacy evaluation in pre-clinical study of biomedical prevention strategies. In this review, we summarized the recent progress about human mucosal explants model including the sources of tissues, technical characteristics and their application to study the mechanism of HIV-1 sexual transmission and evaluation of prevention strategies. Based on our recent study results, we also provided our opinions aboutdevelopment of novel explant models and their application.

Keywords:human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1), sexual transmission, mucosal infection, explants culture model

在全世界范圍內(nèi)有將近一半的 HIV-1感染者是婦女，她們大多通過異性性接觸而感染HIV-1[1]；另一方面經(jīng)同性性接觸而感染 HIV-1的男男同性戀人群 (Men who have sex with men，MSM) 的比例近年來也在迅速地增長[2]；總體來看，經(jīng)性接觸傳播已經(jīng)成為全球HIV-1疫情難以控制的主要原因。我國HIV-1新發(fā)感染上升的趨勢(shì)依然難以遏制。2007年新發(fā)感染者中56.9%為經(jīng)性途徑感染，2009年已經(jīng)上升為70%，性傳播已成為我國HIV-1感染與傳播的主要途徑，促使HIV-1從高危人群向一般人群擴(kuò)散[3]。

黏膜感染 HIV-1過程中包括生殖道途徑和直腸途徑，研究表明病毒從生殖道部位侵襲到建立系統(tǒng)感染一般需要3~4 d的時(shí)間[4]。而相關(guān)的病毒侵入與感染黏膜的機(jī)制都存在很多不明之處：例如 HIV-1病毒是以游離病毒還是以細(xì)胞內(nèi)病毒的形式感染宿主黏膜細(xì)胞？病毒是如何穿越宿主的黏膜屏障進(jìn)入黏膜下組織？病毒在黏膜感染的初始靶細(xì)胞是什么？HIV-1進(jìn)入黏膜后，黏膜的早期免疫反應(yīng)是抑制病毒還是給病毒更多機(jī)會(huì)增殖？從HIV-1進(jìn)入生殖道或直腸到建立系統(tǒng)的全身感染，有哪些宿主的細(xì)胞以及因子與之相互作用？哪些時(shí)點(diǎn)和分子可以成為新的生物預(yù)防技術(shù)的靶點(diǎn)？上述疑惑嚴(yán)重制約了有效的 HIV-1黏膜生物預(yù)防技術(shù)包括疫苗和殺微生物劑的研究。

早期的感染機(jī)制研究，多采用體外細(xì)胞培養(yǎng)和靈長類動(dòng)物模型研究。感染 SHIV嵌合病毒的非人靈長類動(dòng)物模型可很好再現(xiàn) HIV-1宿主感染的生物學(xué)過程，但是動(dòng)物的購買費(fèi)用昂貴且感染實(shí)驗(yàn)需在大動(dòng)物生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室開展，難以廣泛應(yīng)用。在細(xì)胞水平，體外HIV-1感染多采用可永生傳代的細(xì)胞系 (Caco2、Jurkat細(xì)胞等)，與正常人體細(xì)胞有較大差異；而人PBMC則需要外源激活劑 (PHA等)來維持HIV-1在其中的復(fù)制，也明顯改變了細(xì)胞表面分子的標(biāo)記，加之細(xì)胞種類單一，都不足以模擬正常黏膜中的靶細(xì)胞及其所處的微環(huán)境。因此，有關(guān)HIV-1黏膜感染的機(jī)制研究，以及對(duì)近年來應(yīng)用于局部阻斷或抑制HIV-1感染的殺微生物劑等預(yù)防手段的安全性和有效性評(píng)價(jià)一直缺乏經(jīng)濟(jì)有效的模型。

為深入探索HIV-1黏膜侵入與感染的機(jī)制，研究人員近年來嘗試建立了一種新型的人體活組織體外培養(yǎng)模型。其組織來源可來自女性生殖道或者男性生殖器組織、口腔黏膜以及結(jié)直腸黏膜組織。本文將就上述活組織體外培養(yǎng)模型的特點(diǎn)以及在HIV-1性傳播途徑感染研究中的應(yīng)用加以綜述。

1 活組織培養(yǎng)的起源

組織培養(yǎng)是指組織在體外條件下的存活或生長。動(dòng)物組織培養(yǎng)的技術(shù)起源于19世紀(jì)所應(yīng)用的若干胚胎學(xué)技術(shù)。1907年美國胚胎學(xué)家Harrison的蛙胚神經(jīng)管組織實(shí)驗(yàn)成為組織培養(yǎng)真正開始的標(biāo)志[5]。20世紀(jì)50年代，隨著操作技術(shù)、培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)基的改進(jìn)，組織培養(yǎng)技術(shù)得到更快的發(fā)展。

組織培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以在組織上和功能上保持一定程度的分化，這樣就為實(shí)驗(yàn)生物學(xué)提供了既處于一定的組織結(jié)構(gòu)之中又脫離了體內(nèi)種種復(fù)雜因素的細(xì)胞群體。但在經(jīng)典的組織培養(yǎng)技術(shù)中，由于細(xì)胞常常從培養(yǎng)物中向外遷移，因此培養(yǎng)物很快便失去了它們的組織分化特性。后來采用把組織放置在細(xì)胞難以粘附的表面上，減少支持物與組織的接觸面積，以及把組織包埋于瓊脂中等方法，大大減少了細(xì)胞遷移現(xiàn)象，從而達(dá)到限制生長，使器官專一細(xì)胞同它們的基質(zhì)細(xì)胞維持相對(duì)正常的結(jié)構(gòu)關(guān)系的目的。

2 模型應(yīng)用的組織類型與來源

HIV-1黏膜感染主要涉及的組織類型有子宮頸陰道[6]、包皮[7]和直腸乙狀結(jié)腸[8]等。按組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可分為單層柱狀上皮類 (結(jié)直腸、子宮頸內(nèi)膜等) 與復(fù)層鱗狀上皮類 (陰道、子宮頸外膜、包皮等)，組織的不同結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了HIV-1進(jìn)入機(jī)制的差異，例如專屬于單層柱狀上皮細(xì)胞的胞轉(zhuǎn)作用等。

子宮頸陰道組織多來自絕經(jīng)期前婦女的子宮切除術(shù)或陰道修補(bǔ)術(shù)后的標(biāo)本[9]；子宮切除術(shù)常見于子宮多發(fā)性肌瘤，而陰道修補(bǔ)術(shù)因?qū)僬晤愂中g(shù)，受地域、經(jīng)濟(jì)因素影響大，目前國內(nèi)開展較少。

直腸乙狀結(jié)腸組織有幾種來源：活檢組織、腫瘤患者癌旁組織以及直腸脫垂患者組織?；顧z標(biāo)本可通過內(nèi)窺鏡直視，獲取特異部位的黏膜組織，但活檢機(jī)械手臂咬合組織時(shí)容易傷及黏膜表面，而且總量較少，一個(gè)患者最多可獲20塊活檢組織[10]，相較而言腫瘤患者和直腸脫垂患者手術(shù)后獲得的黏膜組織面積大，可滿足較多需求，提高了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的靈活性，是目前較為常用的組織來源。

包皮組織絕大多數(shù)是因包皮過長進(jìn)行的環(huán)切手術(shù)獲得，一般患者年齡偏低 (青少年)，極少合并其他重大疾病，是上述各類組織來源中最接近體內(nèi)正常組織生理狀態(tài)的一種。

3 HIV-1黏膜感染模型培養(yǎng)技術(shù)特點(diǎn)

活組織培養(yǎng)的方式，有的是直接將組織標(biāo)本塊修剪，進(jìn)行培養(yǎng)，其培養(yǎng)技術(shù)包括支撐筏 (Rafts)、Transwell等[10-11]；也有的是用消散的細(xì)胞進(jìn)行組織重建，構(gòu)成黏膜的片層，再現(xiàn)上皮細(xì)胞的特征。

3.1 活組織整體培養(yǎng)

目前國際上有幾家實(shí)驗(yàn)室相繼開展了人體活組織培養(yǎng)在 HIV-1感染中的應(yīng)用研究。他們基于前人發(fā)展的組織培養(yǎng)技術(shù)，結(jié)合HIV-1性途徑感染特點(diǎn)，研究建立HIV-1感染相關(guān)的黏膜組織模型。1992年，F(xiàn)leming等為確認(rèn)HIV-1能否直接感染人腸道黏膜而不是腸道細(xì)胞系，將胎兒腸黏膜剪切成塊 (2 mm3)放入培養(yǎng)基進(jìn)行了培養(yǎng)及感染實(shí)驗(yàn)，這是較為早期的涉及黏膜體外培養(yǎng)進(jìn)行HIV-1感染的嘗試[12]。

3.1.1 支撐筏模型 (Rafts)

Shattock等將宮頸活檢組織鉆取成3 mm或8 mm直徑大小，黏膜面向上置于24板內(nèi)的方形不銹鋼網(wǎng)支架上，加入培養(yǎng)基使其圍繞支架形成新月形的氣-液界面，讓黏膜表面暴露于空氣，而其底部則可透過不銹鋼網(wǎng)格孔與培養(yǎng)基接觸從而保證汲取營養(yǎng)。其后，人們?cè)囉酶鞣N材質(zhì)的支撐物對(duì)黏膜進(jìn)行培養(yǎng)[11]，如濾紙、Millipore濾膜、吸收性明膠海綿等，最終認(rèn)為吸收性明膠海綿效果更有利于組織存活 (圖 1A)[10]。

3.1.2 Transwell類模型

該類模型依據(jù)Transwell小室建立，其外形為一個(gè)可放置在孔板里的小杯子，并采用通透性濾膜作杯底。Collins等[13]的模型中，將人宮頸復(fù)層鱗狀上皮組織黏膜面向上放入上室濾膜，用瓊脂糖凝膠灌注封閉黏膜四周，讓病毒只能接觸中心未封閉的黏膜表面 (圖1B)。Cummins等[14]發(fā)展的組織極化模型不同之處是將Transwell上室濾膜鉆孔，組織塊從孔中穿越，把黏膜層露在上室而基底部跨過濾膜浸入下室培養(yǎng)基中 (圖1C)。兩種模型異曲同工，都是只把黏膜面暴露于可接觸病毒的環(huán)境，近似的模擬生理狀態(tài)下HIV-1在女性生殖道內(nèi)感染的過程。但在實(shí)際操作中也暴露出一些問題，如本實(shí)驗(yàn)室曾用該類模型，發(fā)現(xiàn)在安全柜中操作時(shí)無法垂直注視小室，向其中灌注凝膠時(shí)用量較難把握：凝膠過多會(huì)將黏膜面一起封閉，少則封閉不嚴(yán)發(fā)生病毒泄漏；而Shen等[15]的模型則逆向思維，解決了這一問題 (圖1D)：他們將黏膜組織切成1 cm2大小，放入鋪有尼龍濾網(wǎng)的上室中，在黏膜面上放置一個(gè)直徑0.6 cm、高1 cm的聚丙烯小桶作為感染用“上室”，然后用外科膠將小桶四周的黏膜面及暴露組織全部封閉，這樣可灌注足夠量的凝膠而不必?fù)?dān)心黏膜面被覆蓋。在感染實(shí)驗(yàn)中相比兩類方法可以看到，前者的黏膜用

圖1 組織整體培養(yǎng)模型：Rafts模型 (A)[10]和Transwell模型 (B，C，D)[13-15]Fig. 1 The models of whole tissue culture: Rafts model (A) and Transwell models (B, C, D).

量較小，但對(duì)凝膠封閉操作技術(shù)要求高，且封閉后各實(shí)驗(yàn)孔間暴露的黏膜面積難以保持均一，這有可能導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)孔的病毒因接觸的黏膜面積及靶細(xì)胞的數(shù)量不同而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生影響；后者應(yīng)用直徑統(tǒng)一的聚丙烯小桶作為上室，保證了黏膜與病毒的接觸面積相同，同時(shí)該做法使凝膠封閉也易于操作，不足之處是模型中每個(gè)實(shí)驗(yàn)孔對(duì)完整的組織黏膜用量都提高了近2~3倍，在一定程度上限制了實(shí)驗(yàn)規(guī)模。

3.2 活組織片層或細(xì)胞重建組織層培養(yǎng)

黏膜感染 HIV-1后，上皮層內(nèi)的粒細(xì)胞和郎格罕氏細(xì)胞 (Langerhans cells，LCs) 短時(shí)即可遷移出來，檢測(cè)培養(yǎng)基中遷移細(xì)胞可以觀察HIV-1的感染率，但活組織的整體培養(yǎng)無法確認(rèn)細(xì)胞來源于上皮層還是基質(zhì)層？因此，McElrath教授的課題組采用一種體外器官活組織片層培養(yǎng)技術(shù)[9]，利用真空負(fù)壓吸引或EDTA低溫處理過夜的方法較為溫和的分離上皮層與基質(zhì)層，能保持上皮層的完整結(jié)構(gòu)和活力。也有的采用消散的細(xì)胞或細(xì)胞系進(jìn)行組織重建，構(gòu)成黏膜的片層，再現(xiàn)上皮細(xì)胞的特征。如Bouschbacher等[16]即利用人原代成纖維細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞共同重構(gòu)陰道黏膜層，特異性觀察整合進(jìn)去的LCs在HIV-1感染中的作用，避免了T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的“干擾”。Nazli等[17]將原代女性生殖道上皮細(xì)胞等建成緊密的單細(xì)胞層，以此驗(yàn)證 HIV-1感染對(duì)黏膜屏障的損傷作用。此類模型雖然將組織微環(huán)境趨于簡(jiǎn)單化，與體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境有一定差異，卻更有利于觀察特定區(qū)域或特定細(xì)胞在HIV-1感染前后的變化。

4 在機(jī)制研究和生物預(yù)防技術(shù)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

4.1 黏膜感染機(jī)制研究

HIV-1侵入完整黏膜的途徑包括：通過LCs、樹突狀細(xì)胞 (Dendritic cells，DCs)、M細(xì)胞 (Microfold cell) 等的捕捉式跨上皮運(yùn)輸方式[18-19]，或經(jīng)與上皮細(xì)胞的半乳糖神經(jīng)酰胺 (Galactosyl ceramide) 等受體結(jié)合被轉(zhuǎn)運(yùn)穿越上皮細(xì)胞層[20]。穿越黏膜的病毒可直接感染固有層的 CD4+T細(xì)胞，或與表達(dá)DC-SIGN受體的DCs結(jié)合，通過順式感染或反式感染的方式進(jìn)行傳播：即一種方式是在DCs中建立感染進(jìn)行復(fù)制，并利用產(chǎn)生的子代病毒感染CD4+T等靶細(xì)胞；另一種方式則以DCs為載體被直接運(yùn)載去感染CD4+T細(xì)胞[21]。

以上機(jī)制研究多采用動(dòng)物或細(xì)胞模型。與這些模型相比，組織模型的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可在HIV-1急性感染期進(jìn)行多點(diǎn)連續(xù)采樣進(jìn)行免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、電鏡等損傷性檢測(cè)，對(duì)HIV-1進(jìn)入黏膜的生物學(xué)軌跡進(jìn)行跟蹤研究，同時(shí)又不失其在體內(nèi)復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)。對(duì)于病毒進(jìn)入的時(shí)間，采用人的宮頸陰道活組織培養(yǎng)體系觀察HIV-1初始感染期的研究顯示[22]，HIV-1臨床分離病毒株接種3~4 d，在宮頸黏膜下層出現(xiàn)許多感染細(xì)胞，4~6 d后在組織檢測(cè)到感染的白細(xì)胞。而感染損傷的組織，則最早 3 d即可檢測(cè)到感染的白細(xì)胞。Gupta小組的研究則進(jìn)一步顯示宮頸組織感染后6 h黏膜下層即可檢測(cè)到HIV-1陽性細(xì)胞，并確認(rèn)為記憶性 CD4+T細(xì)胞；96 h后HIV-1陽性LCs與巨噬細(xì)胞才被檢測(cè)到[23]。

在生殖道，通過活組織片層的感染研究發(fā)現(xiàn)，HIV-1一旦接觸局部黏膜可迅速滲透上皮內(nèi)LCs 和CD4+T細(xì)胞。HIV-1進(jìn)入CD4+T細(xì)胞幾乎完全是由CD4和CCR5 受體介導(dǎo)的直接融合方式，無需LCs細(xì)胞傳遞病毒。而HIV-1進(jìn)入CD1a+ LCs 細(xì)胞則主要通過細(xì)胞內(nèi)吞 (Endocytosis) 作用，借助于多種受體[9]。在Saba等的宮頸陰道組織模型研究中，感染的T細(xì)胞均為表達(dá)CCR5的效應(yīng)記憶T細(xì)胞。盡管有廣泛表達(dá)CXCR4受體，但絕大多數(shù)組織仍只支持CCR5嗜性HIV-1病毒的復(fù)制[24]，當(dāng)單獨(dú)阻斷CD4或同時(shí)阻斷CXCR4與CCR5受體時(shí)可局部抑制病毒的黏膜感染[25]。此外，支持 CXCR4嗜性病毒復(fù)制的組織擁有一個(gè)共同特征——富含 CD27+CD28+效應(yīng)記憶T細(xì)胞[24]。

進(jìn)入黏膜后的病毒如欲進(jìn)一步傳播，離不開組織中細(xì)胞的遷移作用，同時(shí)阻斷 CD4與 DC-SIGN可抑制遷移細(xì)胞對(duì)HIV-1的攝取與傳播。流式分析與免疫染色遷移細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)兩群細(xì)胞：CD3+HLA-DR-和CD3-HLA-DR+細(xì)胞，后者顯著表達(dá)DC-SIGN。研究顯示這些HLA-DR+細(xì)胞90%與HIV傳播相關(guān)[25]。

在對(duì)宮頸與包皮組織中免疫細(xì)胞進(jìn)行比較研究時(shí)，Petterson等[26]發(fā)現(xiàn)成人包皮黏膜中 CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、郎罕氏細(xì)胞的比例分別達(dá) 22.4%、2.4%和11.5%，遠(yuǎn)高于兒童包皮組織 (4.9%、0.3%、6.2%) 和婦女的宮頸組織 (6.2%、1.4%、1.5%)。與宮頸黏膜或包皮的外表面組織相比，包皮內(nèi)側(cè)黏膜對(duì)HIV-1 BaL (R5嗜性) 有顯著的易感性。此外，外源的刺激可改變組織中細(xì)胞表面蛋白的表達(dá)、TNF-α處理可將靜息LCs激活，這些都只發(fā)生在內(nèi)側(cè)包皮而非外側(cè)包皮[27]，這部分解釋了為什么包皮環(huán)切術(shù)可以降低人群中HIV-1的感染率[28-29]。

近年來，由于MSM人群HIV-1感染顯著上升，腸道黏膜在HIV-1傳播與病理中扮演的作用日益受到重視。但是關(guān)于腸道黏膜HIV-1感染的機(jī)制缺乏深入的研究。生殖道黏膜與腸道黏膜的生理結(jié)構(gòu)、組織細(xì)胞構(gòu)成以及微生態(tài)環(huán)境均存在很大的差異性。例如同樣的巨噬細(xì)胞在生殖道和腸道中對(duì)HIV-1感染易感性也存在很大的差異性。有報(bào)告稱陰道和腸道的巨噬細(xì)胞表達(dá)不同水平的免疫受體及 HIV-1受體CD4與輔助受體CCR5、CXCR4。病毒穿越黏膜上皮后，是陰道而不是腸道巨噬細(xì)胞允許 R5 HIV-1復(fù)制[30]。HIV-1腸道黏膜感染的機(jī)制包括首感細(xì)胞與遷徙軌跡則存在更多亟待探索的問題。

4.2 評(píng)價(jià)生物預(yù)防技術(shù)的安全性與有效性

評(píng)價(jià)殺微生物劑的安全性與有效性也是上述人體黏膜活組織模型最初建立的目的之一[10,13]。由于第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的抗HIV-1廣譜殺微生物劑——壬苯醇醚 (Nonoxynol-9，N-9)，沒有顯示出預(yù)期的保護(hù)效果，通過兔子陰道模型人們發(fā)現(xiàn)，臨床劑量的N-9對(duì)黏膜有較大的毒性損傷，破壞上皮屏障，誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生，從而導(dǎo)致HIV-1感染率不降反升[31]。因此在用組織模型進(jìn)行殺微生物劑評(píng)價(jià)之初，常用N-9作為對(duì)照，以觀測(cè)黏膜對(duì)藥物毒性的靈敏度。由于陰道與腸道組織的差異性，陰道用殺微生物劑能否安全有效的用于腸道需要重新進(jìn)行評(píng)估。在Fletcher等[10]的結(jié)直腸模型中，評(píng)價(jià)的6種殺微生物劑在1 mg/mL的最高劑量時(shí)均沒有顯示出對(duì)組織的毒性作用，與之形成鮮明對(duì)照的是，同樣濃度的N-9已讓組織活性降低至69%。其中第1代殺微生物劑(多聚陰離子聚合物) 中的 PRO2000與硫酸糊精(Dextrin sulphate) 分別在陰道用藥劑量的1/5 000和1/40時(shí)即可達(dá)到99%的保護(hù)。第2代殺微生物劑 (逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑) 中 PMPA (9-[2-(phosphonomethoxy)peopyl]adenine) 可有效抑制病毒的劑量也只有陰道制劑的 1%。同時(shí)在宮頸、包皮等組織上的驗(yàn)證，也顯示出PRO2000等殺微生物劑在安全劑量范圍內(nèi)具有病毒抑制效果[7,32-33]。

由于組織模型感染無法像細(xì)胞模型那樣控制病毒的靶細(xì)胞數(shù)量，病毒在其中的復(fù)制生長受到組織類型、培養(yǎng)方式、病毒接種等眾多因素的影響，這將影響對(duì)殺微生物劑評(píng)價(jià)結(jié)果的可重復(fù)性與可信度，實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果也難以比較。為此，Richardson-Harman等[34]報(bào)道了一種較為客觀檢測(cè)病毒生長狀況及評(píng)價(jià)候選殺微生物劑的軟終點(diǎn)法 (Soft-endpoint)。病毒生長曲線可分為 4個(gè)階段：停滯期、指數(shù)增長期、穩(wěn)定期和衰退期。軟終點(diǎn)法是指無論病毒復(fù)制水平高低，都將其在組織內(nèi)生長的穩(wěn)定期作為時(shí)間截取點(diǎn)進(jìn)行 p24等檢測(cè)與統(tǒng)計(jì)，這樣便于分析和比較不同實(shí)驗(yàn)室得到殺微生物劑臨床前比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，減少固有偏差。利用該方法判斷病毒在直腸組織模型中生長的變異性最大。同時(shí)在該方法中病毒原始株及其進(jìn)化分支是影響病毒復(fù)制的關(guān)鍵參數(shù)，雖然組織類型與模型差異也是影響病毒復(fù)制的非常重要的參數(shù)，但若使用同一類型組織時(shí)，實(shí)驗(yàn)室間仍可以用p24水平及IC50來進(jìn)行可靠的藥效比較。

5 本實(shí)驗(yàn)室的活組織培養(yǎng)進(jìn)展

本實(shí)驗(yàn)室已開展了包括結(jié)、直腸、包皮等組織來源的Rafts和Transwell培養(yǎng)模型。通過Rafts模型在對(duì)腸道黏膜的培養(yǎng)中，HE染色觀察第5天組織結(jié)構(gòu)依然良好，13 d時(shí)黏膜結(jié)構(gòu)依然可見。經(jīng)MTT法檢測(cè)培養(yǎng)10 d內(nèi)的組織活性，顯示培養(yǎng)4 d時(shí)組織活性高于80%，7 d的活性可保持在50%左右，包皮培養(yǎng)存活狀態(tài)優(yōu)于腸道黏膜，與其他實(shí)驗(yàn)室相比，本實(shí)驗(yàn)對(duì)腸道組織與包皮組織的培養(yǎng)無論組織結(jié)構(gòu)的完整性保持或高活性的培養(yǎng)時(shí)間均優(yōu)于已有的報(bào)道[7,10]，建立的組織模型可以滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)要求。

藥物的臨床前安全性與有效性評(píng)價(jià)首先要求評(píng)價(jià)模型具有一定的敏感性，本實(shí)驗(yàn)室用10倍濃度梯度的N-9分別與結(jié)腸黏膜孵育，發(fā)現(xiàn)黏膜活性隨N-9濃度的升高而降低，即使將梯度差減小至3倍，黏膜依然可以靈敏地反映出藥物的毒性變化。此外，對(duì)臨床試驗(yàn)中證明安全的幾種抗HIV-1 藥物進(jìn)行平行觀察，對(duì)組織活性的影響較小，而對(duì)照N-9組活性明顯降低。

6 展望

人體組織培養(yǎng)模型中的組織塊是在脫離了機(jī)體的情況下獨(dú)立生存，因此得出的研究結(jié)果還不能與人體感染的真實(shí)情況完全等同，這點(diǎn)需要在數(shù)據(jù)分析中予以注意。同時(shí)，組織培養(yǎng)模型還存在著一些爭(zhēng)議和需要解決的問題，例如，組織來源的背景資料、抗生素等對(duì)組織激素水平的影響、靶細(xì)胞數(shù)量、結(jié)果的分析等[35-37]。但不可否認(rèn)的是，組織培養(yǎng)模型，尤其是人體組織來源的模型在 HIV-1性途徑感染的研究中具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。

未來，模型的構(gòu)建和應(yīng)用仍有較大的拓展空間。首先，隨著研究目的不同，組織來源將不局限于現(xiàn)有類型。其次，現(xiàn)有組織培養(yǎng)技術(shù)可進(jìn)一步完善，如借鑒臨床外科的器官移植取材規(guī)范與體外保存技術(shù)，以及對(duì)培養(yǎng)基成分的優(yōu)化調(diào)整，都將對(duì)改善組織存活狀態(tài)有較大幫助。從本實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)來看，使用器官移植保存液作為組織離體后的運(yùn)輸液能更好的保持黏膜狀態(tài)；在機(jī)制研究中，可向模型中加入人體微環(huán)境存在的介質(zhì)或采用不同類型組織共同培養(yǎng)等方式以進(jìn)一步模擬真實(shí)感染環(huán)境；第三，新的應(yīng)用開發(fā)。將一些細(xì)胞或動(dòng)物模型上難以培養(yǎng)的病毒用人體組織模型進(jìn)行培養(yǎng) (例如丙肝病毒等)，從艾滋病研究延伸到性傳播疾病等更廣泛的領(lǐng)域。在感染靶細(xì)胞間或受體間相互作用機(jī)制、局部免疫與炎癥等研究以及公共衛(wèi)生突發(fā)傳染病病原體的快速鑒定上進(jìn)行突破。組織水平的安全性與有效性評(píng)價(jià)范圍也可擴(kuò)展涵蓋至抗病毒藥物以外的更多的生物預(yù)防性策略 (如疫苗等)，這些也將作為我們今后考慮的研究方向。

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Application of human mucosal explants culture in the HIV-1 sexual transmission

Yu Yang1, and Xiaoyan Zhang1,2
1 Shanghai Public Health Clinical Center, Fudan University, Shanghai 201508, China
2 Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 201508, China

Received: May 11, 2010; Accepted: June 25, 2010

Supported by: Natural Science Foundation of Department of Education of Anhui Province (No. KJ2008A127), Start-up Foundation for Doctor. of Anhui University. (No. 02203105).

Corresponding author: Honghua Ge. Tel: +86-551-5107224; Fax: +86-551-5107240; E-mail: hhge@ustc.edu

安徽省教育廳自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. KJ2008A127)，安徽大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目 (No. 02203105) 資助。