肝素雜化材料的制備及抗凝血性質(zhì)的初步研究

宋玉民 缐 萍 李清萍 張玉梅 馬新賢 張 強 王怡云

(1西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，蘭州 730070)(2甘肅省腫瘤醫(yī)院，蘭州 730050)

肝素雜化材料的制備及抗凝血性質(zhì)的初步研究

宋玉民＊,1缐 萍1李清萍1張玉梅1馬新賢1張 強2王怡云2

(1西北師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，蘭州 730070)(2甘肅省腫瘤醫(yī)院，蘭州 730050)

以甲苯二異氰酸酯(TDI)中的-NCO基與納米金屬氧化物表面的羥基發(fā)生反應(yīng)，得到改性納米金屬氧化物，并使其與肝素鈉(Heparin)進行接枝反應(yīng)生成肝素雜化材料，結(jié)合紅外、熱重、掃描電鏡(SEM)等表征方法，確定納米金屬氧化物確實接枝到了肝素鈉的表面。通過對體外凝血時間和復(fù)鈣時間的測定，來初步研究肝素雜化材料的抗凝血性質(zhì)。結(jié)果表明：肝素雜化材料的抗凝血時間和復(fù)鈣時間均比肝素鈉的要短，表明它的抗凝血性比肝素鈉的抗凝血性要弱一些；但比納米金屬氧化物和空白組的抗凝血時間和復(fù)鈣時間要長，說明肝素雜化材料的抗凝血性與其相比則有明顯的提高。

TDI；納米金屬氧化物；肝素；復(fù)鈣時間；抗凝血性

肝素是一類常用的抗凝血藥物，它是因從動物的肝臟中提取而得名的，肝素是一種多糖，作為預(yù)防和治療血栓的藥物，它應(yīng)用于臨床已經(jīng)有70多年了[1-4]。肝素的抗凝血作用主要是通過與抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)相結(jié)合來完成的，它可以用于心導(dǎo)管檢查、體外循環(huán)、血液透析與器官移植等方面，也可用來防治血栓栓塞性疾病[5]。由于肝素研究的較早，經(jīng)Niers等[6]臨床試驗研究表明：肝素不僅在抗凝血方面有良好的作用而且肝素以及肝素衍生物在治療癌癥方面也有著積極的治療作用，將肝素用于癌癥初期病人可以對腫瘤的擴散起到抑制作用。

近年來血栓栓塞性疾病發(fā)病形式多樣，廣泛發(fā)生在人體的動脈和靜脈系統(tǒng)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。針對肝素在用藥過程中可引起自發(fā)性出血、骨質(zhì)疏松癥、血小板減少癥和注射部位輕度血腫和壞死等癥狀[7]，其它多種多樣的抗凝血物質(zhì)的研究也應(yīng)用而生[8]。經(jīng)李潮[9]、魯險鋒[10]等研究納米氧化鋅等物質(zhì)由于表面具有羥基的緣故也具有一定的抗凝血性，鑒于肝素和納米金屬氧化物在臨床方面廣泛的應(yīng)用性和潛在的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)，同時為克服肝素抗凝血效果較強而導(dǎo)致自發(fā)性出血等副作用和納米金屬氧化物抗凝血時間短的缺陷，本文報道了利用納米氧化鋅和納米氧化鈦表面具有羥基的特點，分步用TDI與納米金屬氧化物和肝素進行反應(yīng)生成接枝雜化材料，并研究了肝素雜化材料的抗凝血性質(zhì)。結(jié)果表明，在相同條件下，雜化材料的抗凝血時間相較之肝素鈉要短一些(約為其1/2)，但較之納米金屬氧化物抗凝血時間要長(約為其3倍)。初步達(dá)到了通過制備雜化材料改善二者抗凝血性的預(yù)期目標(biāo)。目前抗凝血材料在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用較為廣泛，例如人造血管，心血管造影導(dǎo)管，生物醫(yī)學(xué)薄膜[11]等，這些材料都要求要與人體血液有良好的相容性，即抗凝血性能要好，因此本研究結(jié)果對通過接枝反應(yīng)生成的雜化材料在臨床應(yīng)用和生物醫(yī)用材料應(yīng)用方面有較大的參考價值。

1 實驗部分

1.1 原料與儀器

肝素鈉(上海山浦化工有限公司)；過硫酸銨(天津市百世化工有限公司)；甲苯 2，4-二異氰酸酯(TDI，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；硬脂酸(上?？颠_(dá)氨基酸廠)；二丁基二月桂酸錫(上海試劑一廠)；丙酮，四氫呋喃(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；納米氧化鈦，納米氧化鋅(自制)；人體血液：取自健康成人；實驗用水為二次蒸餾水，其余均為分析純試劑。

電鏡S-4800(日本日立公司)；800型電動離心沉淀器；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；KQ-100M超聲波清洗器(東莞市科橋超聲波設(shè)備有限公司)；DG／DTA-6300型熱重-差熱分析儀 (美國PE公司)；FTS-3000型紅外光譜儀(美國PE公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米金屬氧化物的表面修飾

納米金屬氧化物用硬脂酸法制得[12]。稱取5 g納米氧化鋅或納米氧化鈦在120℃下真空干燥7 h。分別將干燥后的納米金屬氧化物5 g，100 mL無水丙酮和5 g TDI加入三口燒瓶，在氮氣保護下室溫超聲處理2 h后，加入0.3 mL二丁基二月桂酸錫，80℃下超聲反應(yīng)2 h。反應(yīng)后經(jīng)離心，洗滌，真空干燥，得納米金屬氧化物-TDI。

1.2.2 納米金屬氧化物表面與肝素的接枝

各稱取納米金屬氧化物-TDI 0.2 g加入到裝有50 mL THF的圓底燒瓶中，超聲分散1 h，隨后加入0.2 g肝素鈉和0.1 g的過硫酸銨，在氮氣保護下常溫攪拌6 h。離心，洗滌得固體，在50℃下真空干燥15 h。 分別記為：ZnO-TDI-Heparin和 TiO2-TDIHeparin。

1.2.3 反應(yīng)機理

1.2.4 溶液的配制

分別稱取0.1 g肝素鈉，肝素雜化材料及與其相對應(yīng)的納米金屬氧化物溶于10 mL二次蒸餾水中。其中肝素鈉易溶于水，直接進行配制，而雜化材料微溶于水，納米金屬氧化物難溶于水，故在其溶液中加入2滴1%的吐溫-80水溶液進行乳化，常溫攪拌5 h，得到溶液濃度均為0.01 g·mL-1，室溫保存?zhèn)溆?，待需用時再進行稀釋。對照組為1%的吐溫-80水乳化液。

1.2.5 全凝血時間(CT)的測定

取潔凈的玻璃試管，將其分為6組，每組3個平行樣。第 1 組為空白對照，第 2、3、4、5、6 組中分別加入肝素、納米氧化鋅、納米氧化鈦、ZnO-TDI-Heparin和TiO2-TDI-Heparin雜化材料溶液(加入的溶液濃度均為 0.1 mg·mL-1，體積為 0.1 mL)，同時將加好樣品的6組試管放在37℃水浴中恒溫5 min，然后沿試管壁緩慢加入1 mL人體血液，3 min后每隔30 s傾斜試管進行觀察，直到血液凝固不再流動為止，記為全血凝血時間[13-14]。

1.2.6 復(fù)鈣時間(RT)的測定

取9 mL人體血液，迅速加入裝有1 mL(38 mg·mL-1)枸櫞酸鈉的試管中，在1 000 r·min-1的條件下離心分離10 min，將分離出的血漿置冰水浴中保存?zhèn)溆肹15]。

取6組玻璃試管，每組3支，每支試管中加入經(jīng)過上述處理后的血漿0.1 mL，第1組為生理鹽水對照組，第2、3、4、5、6組中分別加入肝素、納米氧化鋅、納米氧化鈦、ZnO-TDI-Heparin和 TiO2-TDIHeparin雜化材料溶液(加入的溶液濃度均為0.1 mg·mL-1，體積為 0.1 mL)。 同時將加好樣品的 6組試管放在37℃水浴中恒溫3 min，隨后在各試管中加入 0.1 mL 氯化鈣溶液(cCaCl2=0.025 mol·L-1)仍讓其處于37℃恒溫水浴中，然后開啟秒表進行計時，直到試管底部出現(xiàn)纖維狀細(xì)絲且纖維蛋白凝固時則計時結(jié)束[16]，記為復(fù)鈣時間。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

圖1，圖2分別是納米氧化鋅和納米氧化鈦的系列紅外譜圖。圖1中納米ZnO的紅外吸收曲線在1 622和3 435 cm-1處的吸收峰表明了納米氧化鋅表面存在有羥基[17]，與納米氧化鋅相比，納米ZnOTDI的紅外吸收曲線在1645和1539cm-1處新出現(xiàn)的峰則為氨基甲酸酯的吸收峰[18-19]。而據(jù)文獻報道2 270 cm-1處的振動吸收峰是-NCO基團的吸收峰[20]，其原因是TDI第2位和第4位的-NCO基團活性存在差異，使得活性高的第4位-NCO充分反應(yīng)而第2位-NCO大多沒有反應(yīng)，所以-NCO基團的特征吸收峰得以保留。由此說明TDI確實與納米金屬氧化物表面的羥基發(fā)生了反應(yīng)，使納米氧化鋅得到了改性。而ZnO-TDI-Heparin的紅外吸收曲線與ZnO-TDI的曲線相比，2 270 cm-1處-NCO的特征吸收峰消失，3344 cm-1處出現(xiàn)的一寬峰則是肝素分子中的各種基團如-COOH、-OH、-NH2綜合效應(yīng)的結(jié)果，這進一步說明TDI改性的納米氧化鋅接枝到了肝素分子上。納米氧化鈦的系列紅外圖譜與納米氧化鋅的類似，只是圖2中的TiO2-TDI-Heparin紅外吸收曲線與ZnO-TDI-Heparin相比-NCO的吸收峰稍有保留，這可能是由于氧化鈦表面接枝的TDI太多致使TiO2-TDI未與肝素鈉完全反應(yīng)所致。

圖1 納米 ZnO，納米 ZnO-TDI，ZnO-TDI-Heparin紅外譜圖Fig.1 FTIR spectra of nano-ZnO before and after the grafting

圖2 納米 TiO2，納米 TiO2-TDI，TiO2-TDI-Heparin紅外譜圖Fig.2 FTIR spectra of nano-TiO2before and after the grafting

2.2 熱重分析

圖3是納米氧化鋅，納米ZnO-TDI，ZnO-TDIHeparin的TGA圖，圖4是納米氧化鈦，納米TiO2-TDI，TiO2-TDI-Heparin的 TGA 圖。

從圖3和圖4的TGA曲線中可以看出，納米氧化鋅和納米氧化鈦在100～300℃之間出現(xiàn)失重現(xiàn)象，失重率大約為1.5%，這主要是由于吸附在納米粒子表面的水分以及少量有機溶劑引起的，在300℃之后，大約2%的失重是納米金屬氧化物表面的羥基以及相鄰羥基間脫水的結(jié)果。TDI改性后的納米氧化鋅和納米氧化鈦的熱重曲線顯示100℃左右有略微的失重，是由納米金屬氧化物-TDI表面的吸附水引起的；250℃左右失重現(xiàn)象較為明顯，則是由反應(yīng)接枝到納米金屬氧化物表面的TDI熱分解造成的。由納米金屬氧化物-TDI-Heparin雜化材料的熱重曲線可知，200℃開始出現(xiàn)失重是由于接枝到納米金屬氧化物表面的肝素及TDI熱分解造成的。由熱重曲線可以得知氧化鈦和氧化鋅的接枝率[21-22]分別為 36.9%，47.02%。

圖3 納米 ZnO,納米 ZnO-TDI，ZnO-TDI-Heparin熱重圖Fig.3 TGA curves of nano-ZnO before and after the grafting

圖4 納米 TiO2,納米 TiO2-TDI，TiO2-TDI-Heparin熱重圖Fig.4 TGA curves of nano-TiO2before and after the grafting

2.3 電鏡分析

從圖中可以看到，雜化材料分別為層狀和納米纖維狀結(jié)構(gòu)的固體，長度在50～400 nm不等，但看不到納米金屬氧化物粒子，這表明在納米氧化物表面成功的發(fā)生了接枝反應(yīng)，肝素已將氧化物粒子進行包覆。進一步說明各納米氧化物均被TDI改性，并反應(yīng)接枝。

圖5 納米ZnO的掃描電鏡圖Fig.5 SEM image of nano-ZnO

圖6 ZnO-TDI-Heparin的掃描電鏡圖Fig.6 SEM image of ZnO-TDI-Heparin

圖7 納米TiO2的掃描電鏡圖Fig.7 SEM image of nano-TiO2

圖8 TiO2-TDI-Heparin的掃描電鏡圖Fig.8 SEM image of TiO2-TDI-Heparin

2.4 凝血時間

表1為空白組，肝素鈉，納米氧化鋅，納米氧化鈦，ZnO-TDI-Heparin，TiO2-TDI-Heparin 的全血凝血時間測定結(jié)果。在相同濃度的條件下肝素鈉的抗凝效果較好持續(xù)的時間也最長，納米氧化鋅和納米氧化鈦的抗凝時間稍長于血液的正常凝固時間，但經(jīng)過接枝后的ZnO-TDI-Heparin和TiO2-TDI-Heparin的凝血時間則明顯長于各對應(yīng)的金屬氧化物，但相對于肝素鈉抗凝血時間則要短一些。根據(jù)文獻[23]肝素分子中含有五糖的特殊序列，肝素中的該五糖序列可提供與抗凝血酶(ATⅢ)相結(jié)合的位點，使其形成三元復(fù)合物，從而使得ATⅢ能有效滅活凝血酶，達(dá)到抗凝血的作用。在本實驗中雜化材料的凝血時間較肝素短，可能是由于通過雜化反應(yīng)后，肝素的五糖序列結(jié)構(gòu)有所改變，使得抗凝血酶(ATⅢ)難以找到與肝素雜化材料相結(jié)合的位點，影響了雜化材料對凝血過程的作用，從而使得肝素雜化材料的抗凝作用弱于肝素但強于相對應(yīng)的金屬氧化物。

表1 雜化材料對人體體外血液凝固時間的影響Tabble 1 Eeffect of hybrid materials on the coagulation time(CT)in human

2.5 濃度對凝血時間的影響

為了測定雜化材料的凝血時間與其濃度之間的關(guān)系，選定ZnO-TDI-Heparin雜化材料為實驗對象，配制了不同濃度的ZnO雜化材料進行測試。結(jié)果見表2，從表2的數(shù)據(jù)可以看到：隨著雜化材料濃度的不斷增加，全凝血時間也在逐漸變長，即抗凝血性能越來越好。這一現(xiàn)象說明凝血時間與物質(zhì)的濃度之間存在著一定的量效關(guān)系，也就是說可以根據(jù)臨床不同程度的要求，調(diào)節(jié)雜化材料的濃度來治療血栓疾病，或者用于醫(yī)用材料方面，使其達(dá)到物盡其用的效果。

表2 不同濃度雜化材料對人體體外血液凝固時間的影響Table 2 Effect of Hybrid materials with different concentrations on the coagulation time(CT)in human

2.6 對復(fù)鈣時間的影響

表3是各物質(zhì)復(fù)鈣時間的測定結(jié)果。從表3中可以看出：肝素鈉的復(fù)鈣時間最長，在2 h內(nèi)未出現(xiàn)纖維絲狀物。而ZnO-TDI-Heparin，TiO2-TDI-Heparin雜化材料的復(fù)鈣時間與生理鹽水對照組和相應(yīng)的納米金屬氧化物組相比均得到了延長，但與肝素鈉的復(fù)鈣時間相比則要小一些。這一結(jié)果說明了雜化材料可延長凝血酶所致纖維蛋白的凝固時間而具有一定的抗凝血作用[24]，這一實驗結(jié)果與上述的抗凝血實驗得到了相互印證。

表3 雜化材料對人體體外血液復(fù)鈣時間的影響Table 3 Effect of hybrid materials on the recalcification time(RT)in human

3 結(jié) 論

正常生理情況下，人體的凝血系統(tǒng)與抗凝血系統(tǒng)之間維持著動態(tài)平衡，如果此平衡遭到破壞，就會導(dǎo)致凝血或者抗凝血過程的發(fā)生[25]。該過程一般是由多種凝血因子參與的復(fù)雜生化反應(yīng)過程，而肝素普遍被人們認(rèn)為是通過與ATⅢ結(jié)合阻斷Xa和Ⅱa因子來完成抗凝血過程的[26-27]。本實驗通過接枝反應(yīng)生成了肝素氧化鋅、肝素氧化鈦雜化材料，經(jīng)全凝血時間和復(fù)鈣時間的測定，表明均具有良好的抗凝血性質(zhì)且凝血時間與雜化材料的濃度之間存在著一定的量效關(guān)系，在相同的條件下，雜化材料的抗凝血時間比肝素鈉短(約為其1/2)，但比對應(yīng)的納米金屬氧化物抗凝血時間要長(約為其3倍)，初步達(dá)到了通過制備雜化材料改善二者抗凝血性的預(yù)期目標(biāo)。新合成的雜化材料既克服了肝素抗凝血效果較強而導(dǎo)致自發(fā)性出血等副作用和納米金屬氧化物抗凝血時間短的缺陷，同時又具有較好的抗凝血性質(zhì)。

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Preparation and Preliminary Study of Anticoagulant Properties of Heparin Hybrid Materials

SONG Yu-Min＊,1XIAN Ping1LI Qing-Ping1ZHANG Yu-Mei1MA Xin-Xian1ZHANG Qiang2WANG Yi-Yun2
(1College of Chemistry and Chemical Engineering,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China)(2Gansu Tumer Hospital,Lanzhou 730050,China)

Heparin hybrid materials were obtained by the grafting reaction of heparin and modified metal oxide nanoparticles,which were synthsized by the reaction between the TDIs NCO group and the hydroxyl group on the surface of nano metal oxides,and characterized by infrared spectra,thermogravimetry,scanning electron microscopy (SEM).The anticoagulant effect of hybrid materials were studied by the measurements of coagulation time(CT)and recalcification time (RT).The results showed that nano metal oxides were indeed grafted on the heparin.Compared to heparin,the coagulation time and recalcification time of heparin hybrid materials is shorter,but longer than the corresponding nano metal oxides and control group.In conclusion,the heparin hybrid materials were successfully prepared,and can shorten anti-coagulation time of heparin,prolong anti-coagulation time of nano metal oxides.

TDI;nano metal oxides;heparin;recalcification time;anticoagulant

O614.121；O614.81

：A

：1001-4861(2011)04-0631-06

2010-11-08。收修改稿日期：2010-12-08。

甘肅省自然科學(xué)基金(No.0710JRZA108)和甘肅省高分子材料重點實驗室資助項目。

＊通訊聯(lián)系人。 E-mail：songym@nwnu.edu.cn，Tel：0931-6169896；會員登記號：S06N8225M1006。