應(yīng)用原子力顯微鏡分析豬脂肪前體細(xì)胞的分化

李盛璞，師如意，王秋蘭，王牡，甘睿，潘潔，蔡繼業(yè)，張守全

1 暨南大學(xué)化學(xué)系，廣州 510632

2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642

3 暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510632

應(yīng)用原子力顯微鏡分析豬脂肪前體細(xì)胞的分化

李盛璞1，師如意2，王秋蘭1，王牡1，甘睿3，潘潔1，蔡繼業(yè)1，張守全2

1 暨南大學(xué)化學(xué)系，廣州 510632

2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣州 510642

3 暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510632

脂肪形成過(guò)程中發(fā)生的異常變化與許多疾病的產(chǎn)生有著密切的關(guān)系。為深入了解脂肪形成的機(jī)制，利用原子力顯微鏡研究脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化前后細(xì)胞形貌、超微結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能的變化。結(jié)果表明，脂肪前體細(xì)胞與成熟脂肪細(xì)胞在形貌上存在明顯的差異。在超微結(jié)構(gòu)的探測(cè)中成熟脂肪細(xì)胞表面粗糙度低于脂肪前體細(xì)胞。通過(guò)力曲線的分析得出，分化前后兩種細(xì)胞的機(jī)械性質(zhì)均發(fā)生改變。脂肪前體細(xì)胞在粘彈力、硬度和楊氏模量的研究中比成熟脂肪細(xì)胞都高出約20%。原子力顯微鏡在納米尺度上分析脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中細(xì)胞膜的改變，其研究結(jié)果為進(jìn)一步探討脂肪形成機(jī)制提供可視化定量數(shù)據(jù)。

原子力顯微鏡，脂肪前體細(xì)胞，成熟脂肪細(xì)胞，超微結(jié)構(gòu)，機(jī)械性能

Abstract:Abnormal changes during fat formation are closely related to the prevalence of many diseases. In order to understand the formation mechanism of fat, we used atomic force microscopy (AFM) to characterize the morphology and mechanical properties of porcine preadipocytes during the differentiation. Preadipocytes and adipocytes were different morphologically. The surface roughness of adipocytes was less than preadipocytes by detection of the ultrastructure. The mechanical properties of preadipocytes were changed during differentiation with AFM-based force spectroscopy. Preadipocytes were 20% higher than adipocytes in the adhesion force, stiffness and Young's modulus. Therefore, AFM analysis of membrane changes related to adipocytes formationprovided quantitative data in the nanometer level for further studying the formation mechanism of the adipocytes.Keywords:atomic force microscopy, preadipocytes, adipocytes, ultrastructure, mechanical properties

脂肪細(xì)胞不僅在生物體內(nèi)的能量平衡方面起著重要的作用，并且在荷爾蒙分泌和一些相關(guān)的脂肪因子，如：免疫應(yīng)答、食欲調(diào)節(jié)、胰島敏感性、血管和骨架生長(zhǎng)等方面也起著不可替代的作用[1]。脂肪的過(guò)度沉積會(huì)導(dǎo)致肥胖，不僅增加中老年人患高血壓、高血脂、Ⅱ型糖尿病、心血管等疾病的風(fēng)險(xiǎn)，并且還與許多癌癥發(fā)生的分子機(jī)制有關(guān)[2-3]。脂肪前體細(xì)胞是白脂肪組織的前體細(xì)胞，其分化為成熟的脂肪細(xì)胞又稱為脂肪形成，是伴隨細(xì)胞形態(tài)學(xué)、激素水平和基因表達(dá)協(xié)調(diào)變化的一個(gè)復(fù)雜的生物進(jìn)程[4-5]。調(diào)節(jié)脂肪前體細(xì)胞的分化，進(jìn)而使脂肪細(xì)胞脂肪含量的減少和脂肪細(xì)胞數(shù)目的減小，對(duì)肥胖病的治療有重要意義[6-7]。

細(xì)胞的形態(tài)、表面粗糙度和力學(xué)性質(zhì)改變會(huì)影響細(xì)胞的性質(zhì)、功能進(jìn)一步引起疾病[8-9]。另一方面，疾病也能引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)的變化[10]。因此細(xì)胞的形貌和力學(xué)性質(zhì)的分析在更深層次研究生命活動(dòng)、治療疾病方面發(fā)揮著重要的作用。原子力顯微鏡 (Atomic force microscope，AFM) 能夠在單細(xì)胞水平上對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)進(jìn)行三維化和定量，獲得細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)的定量數(shù)據(jù)，使得分析更全面[11-15]。文獻(xiàn)報(bào)道脂肪前體細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，不是單純的脂滴形成。其分化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白等生物大分子，從而引起細(xì)胞膜的一系列變化[16]。故本實(shí)驗(yàn)主要利用 AFM 研究豬脂肪前體細(xì)胞分化前后膜結(jié)構(gòu)及其力學(xué)性質(zhì)的改變，為更深入探討分化的調(diào)控機(jī)制和疾病產(chǎn)生提供定量的數(shù)據(jù)。研究結(jié)果也揭示了AFM是在微觀領(lǐng)域研究脂肪形成的一種有效工具。

1 材料與方法

1.1 材料

0.25%胰蛋白酶、1 mg/mL膠原蛋白酶Ⅰ、1%的青霉素、鏈霉素 (Sigma公司)，10% (V/V) 胎牛血清 FCS(Hyclone公司)，DMEM (Gibco BRL 公司)，50 nmol/L胰島素、50 nmol/L地塞米松、0.25 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 (IBMX)、50 μmol/L 油酸 (Sigma公司)。

1.2 脂肪前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)

用 75%酒精進(jìn)行仔豬全身消毒，之后用高壓滅菌的手術(shù)器械取 2日齡仔豬皮下脂肪組織，剪碎后采用膠原酶消化法：將膠原酶Ⅰ用無(wú)菌 PBS溶解，調(diào)整濃度為 1 mg/mL，在 37 ℃水浴搖床中消化1.5 h，搖床速率為100 r/min。之后用PBS清洗2次，1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。

將消化好的細(xì)胞接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，接種1~1.5 h后，將上清去掉，因?yàn)橹厩绑w細(xì)胞的貼壁速度高于其他細(xì)胞，所以可以快速貼壁，用差速貼壁進(jìn)行純化。之后用完全培養(yǎng)基10%FCS+DMEM(含 1%的雙抗) 進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱，隔日換液，觀察細(xì)胞貼壁以及生長(zhǎng)情況。2~3 d后細(xì)胞會(huì)長(zhǎng)到80%左右，再進(jìn)行消化傳代，消化時(shí)用 0.25%的胰酶進(jìn)行消化，之后用等體積的含10% FCS完全培養(yǎng)基進(jìn)行終止消化，1 000 r/min離心5 min，之后去掉上清，用不完全培養(yǎng)基DMEM進(jìn)行清洗2次，此時(shí)繼續(xù)進(jìn)行差速貼壁用以純化所得細(xì)胞。傳代2~3次后，就可以分離培養(yǎng)出細(xì)胞成分均一、增殖旺盛的脂肪前體細(xì)胞，經(jīng)2%臺(tái)盼藍(lán)檢查，細(xì)胞活性達(dá)到98%。

1.3 脂肪前體細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

對(duì)所獲脂肪前體細(xì)胞采用含50 nmol/L胰島素、50 nmol/L地塞米松、0.25 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤 (IBMX)、50 μmol/L油酸混合液的雞尾酒方法進(jìn)行誘導(dǎo)，第2天時(shí)出現(xiàn)小脂滴，并開(kāi)始融合成大脂滴。第4天之后完全形成成熟的脂肪細(xì)胞。

1.4 樣品制備

取脂肪前體細(xì)胞和誘導(dǎo)分化后的成熟脂肪細(xì)胞分別滴在玻片上，自然鋪展后吸附 10 min，先用pH 7.4的PBS緩沖液沖洗1次，然后用4% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的多聚甲醛固定 15 min，再用蒸餾水沖洗 3次，室溫自然干燥。

1.5 AFM成像

將制備好的樣品固定在 AFM (Autoprobe CP Research，veeco公司，USA) 的XY掃描臺(tái)上，用監(jiān)視器定位所要掃描的樣品區(qū)域，在空氣中室溫下利用接觸模式成像。試驗(yàn)中采用 100 μm掃描器，UL20B硅探針，力常數(shù)為2.8 N/m，AFM圖像僅經(jīng)自帶軟件 IP2.1 (Thermomicroscopes proscan image processing software version 2.1) 平滑處理，以消除掃描方向上的低頻背景噪音。利用 AFM力位移曲線測(cè)量系統(tǒng)在同一加載速率下測(cè)量得到力的曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 倒置顯微鏡觀察脂肪前體細(xì)胞的分化

采用倒置顯微鏡對(duì)分離培養(yǎng)的豬皮下脂肪前體細(xì)胞及誘導(dǎo)分化后的成熟脂肪細(xì)胞分布進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)分化前后細(xì)胞形貌無(wú)太大變化，均成不規(guī)則的長(zhǎng)梭形或三角形 (圖1A和1B)，在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的第2天，用油紅O染色進(jìn)行觀察，可以看見(jiàn)大量細(xì)胞有小的脂滴出現(xiàn)，分化率達(dá)95%以上。最初脂滴出現(xiàn)在核周，形似指環(huán)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小脂滴逐漸聚集成葡萄串狀。第3天開(kāi)始細(xì)胞內(nèi)的脂滴逐漸匯合形成大的脂滴。誘導(dǎo)4 d之后，細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。從倒置顯微鏡等儀器能宏觀了解分化前后細(xì)胞一些大的變化，而在分化的不同階段，細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)出不同的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白等生物大分子卻用肉眼觀察不到。這些微觀的變化和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和機(jī)械性能有著密切的關(guān)系，用 AFM分析分化前后細(xì)胞結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)，用微觀輔助宏觀，進(jìn)一步探測(cè)脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的諸多變化。

2.2 AFM對(duì)脂肪前體細(xì)胞分化前后的形貌分析

AFM是樣品表面信息的收集工具，較易獲得細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)及其他一些表面信息。脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程中，伴隨著形態(tài)、生物化學(xué)性質(zhì)和分子層面上的變化，這些都將導(dǎo)致細(xì)胞膜的變化。因此，有必要探測(cè)細(xì)胞膜表面的信息。

用原子力顯微鏡對(duì)多個(gè)單獨(dú)細(xì)胞進(jìn)行分析，拓?fù)鋱D顯示，脂肪前體細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞均呈現(xiàn)不規(guī)則的長(zhǎng)梭形或小三角形 (圖 2A 和 2F)，大小在40~70 μm之間，高度在350~650 nm之間。對(duì)局部小范圍掃描，局部拓?fù)鋱D2B和三維圖2D發(fā)現(xiàn)脂肪前體細(xì)胞上存在直徑約為1 μm大小的球狀結(jié)構(gòu)，在成熟脂肪上并沒(méi)有觀察到。在分化后的成熟脂肪細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞核周圍出現(xiàn)大小不一的孔洞(圖2G和2I)，為脂肪形成過(guò)程中出現(xiàn)的空泡。圖2C和2H為兩種細(xì)胞膜上的超微結(jié)構(gòu)，在2 μm×2 μm區(qū)域里，可以看出脂肪前體細(xì)胞膜表面顆粒分布比較突出和明顯，粒度分布圖2E顯示粒子大小主要分布在60 nm附近，分布均勻。而成熟脂肪細(xì)胞膜表面變得光滑，顆粒主要分布減小為18 nm左右 (圖2J)。選取多個(gè)不同的膜表面超微結(jié)構(gòu)，利用 IP2.1分析軟件對(duì)其進(jìn)行測(cè)量，得到幾何參數(shù)值 (表1)：分化前均方根粗糙度 (Rq)為 (30.82±9.69) nm、分化后為 (15.02±7.96) nm；平均粗糙度 (Ra) 在未分化時(shí)為(24.97±8.23) nm、分化后減小到 (12.09±6.14) nm。從總體的形態(tài)上看，脂肪前體細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞的形貌沒(méi)有明顯的區(qū)別。但從超微結(jié)構(gòu)中可以看出兩者有著明顯區(qū)別。利用原子力顯微鏡在納米級(jí)別上高分辨率的優(yōu)勢(shì)，分析得知分化之后膜表面變得光滑。

表1 脂肪前體細(xì)胞分化前后的超微結(jié)構(gòu)參數(shù)Table 1 Comparison of ultrastructure parameter of preadipocytes and adipocytes

圖1 脂肪前體細(xì)胞分化前后的倒置顯微鏡圖Fig. 1 Inverted microscopy images of preadipocytes before and after differentiation. (A) Freshly plated preadipocytes (size: 400×).(B) preadipocytes after differentiation, black arrows shows the lipid droplet by oil red O staining (size: 400×).

圖2 脂肪前體細(xì)胞分化前后的AFM圖Fig. 2 AFM images of preadipocytes and adipocytes. (A–E) First group: AFM images of preadipocytes. (A) Topological morphology (size: 25 μm×25 μm). (B) Local membrane surface zoomed from (A) (size: 5 μm×5 μm). (C) Ultrastructure of the cell membrane surface zoomed from (A) (size: 2 μm×2 μm). (D) Three-dimensional morphology of (C). (E) Particles histogram of (C).(F–J) Second group: AFM images of adipocytes. (F) Topological morphology (size: 80 μm×80 μm). (G) Nuclei of adipocytes. (H)Ultrastructure of the cell membrane surface zoomed from (F) (size: 2 μm×2 μm). (I) Three-dimensional morphology of (H). (J) The particles histogram of (H). div: division.

2.3 AFM 對(duì)脂肪前體細(xì)胞分化前后的機(jī)械性能的分析

細(xì)胞各方面性質(zhì)和能力的改變會(huì)導(dǎo)致機(jī)械性能的變化，而膜表面機(jī)械性質(zhì)無(wú)法用肉眼看見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)原子力顯微鏡測(cè)量得到的力-距離曲線來(lái)分析脂肪前體細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞膜上的機(jī)械性質(zhì)。由力曲線圖可得到細(xì)胞膜表面的粘附力、相對(duì)硬度和楊氏模量。圖3A和圖3B分別是脂肪前體細(xì)胞和成熟脂肪細(xì)胞的力曲線示意圖。

圖3 脂肪前體細(xì)胞分化前后的力曲線示意圖Fig. 3 Representative examples of force-distance curve acquired from preadipocytes and adipocytes, respectively. (A)Representative force curves of preadipocytes. (B)Representative force curve of adipocytes.

圖4 脂肪前體細(xì)胞分化前后機(jī)械性質(zhì)的比較Fig. 4 The mechanical properties of preadipocytes and adipocytes. (A) Frequency-adhesion force histogram of preadipocytes, the adhesion force distributed in (146.33±11.23) PN. (B) Frequency-adhesion force histogram of adipocytes, the adhesion force distributed in (119.95±8.67) PN. (C) Histograms for stiffness of preadipocytes and adipocytes group (scanning size: 2 μm×2 μm). The cell stiffness is the slope of the retraction curve. Stiffness= Y(PN)/X(nm). (D) Histograms for Young’s modulus of preadipocytes and adipocytes group (scanning size: 2 μm×2 μm). Young’s modulus E=3F(1–ν2) /4(Rδ3)1/2[17-18]. F is the adhesion force,νis the Poisson’s ratio, R is the radius of the probe, and δ is indentation depth.

通過(guò)力曲線得出粘附力的分布范圍，脂肪前體細(xì)胞粘附力較大，分布在 (146.33±11.23) PN，而成熟脂肪細(xì)胞粘附力較低，分布在 (119.95±8.67) PN (圖4A和4B)。硬度是表征細(xì)胞膜表面力學(xué)性質(zhì)的一個(gè)重要參數(shù)，它反映的是剛性隨形變的變化，諸多文獻(xiàn)報(bào)道其與細(xì)胞骨架有很大關(guān)系。圖 4C是分化前后細(xì)胞硬度的對(duì)比。脂肪前體細(xì)胞的硬度 (2.58±0.41) mN/m比成熟脂肪細(xì)胞 (2.05±0.19) mN/m高出約20%。圖4D是脂肪前體細(xì)胞組和成熟脂肪細(xì)胞組的楊氏模量對(duì)比，楊氏模量反映了細(xì)胞膜表面的剛性。脂肪前體細(xì)胞組的楊氏模量 (1.05±0.09) kPa也高于成熟脂肪細(xì)胞組 (0.87±0.06) kPa約20%。

細(xì)胞膜上有很多膜蛋白和脂多糖等生物大分子顆粒。從AFM對(duì)成脂分化前后細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)的分析可得，脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化后，膜逐漸變得光滑，粗糙度降低，表面顆粒減小，成熟脂肪細(xì)胞膜上與原子力顯微鏡的針尖相互作用的生物大分子顆粒減少，所以粘附力低于脂肪前體細(xì)胞。細(xì)胞骨架由微絲、微管和肌動(dòng)蛋白等構(gòu)成，其變化影響細(xì)胞膜的硬度，從而影響膜的流動(dòng)性。脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化后，細(xì)胞骨架發(fā)生變化，硬度降低，膜流動(dòng)性增加，說(shuō)明成熟脂肪細(xì)胞比起脂肪前體細(xì)胞，膜流動(dòng)性有所增強(qiáng)。剛性也是細(xì)胞形變的一個(gè)參數(shù)，楊氏模量越大，細(xì)胞越不易變形。成熟脂肪細(xì)胞比脂肪前體細(xì)胞楊氏模量小，說(shuō)明成脂分化后的細(xì)胞更易變形。

3 結(jié)論

原子力顯微鏡是分析成脂分化前后細(xì)胞膜表面超微結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)的一種有效工具。脂肪細(xì)胞在體外經(jīng)過(guò)分化而形成的過(guò)程與體內(nèi)脂肪組織分化產(chǎn)生的基因表達(dá)、蛋白變化過(guò)程具有非常類似之處。通過(guò) AFM 在體外研究雞尾酒法誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化，清楚地觀察到分化前后細(xì)胞形貌和膜表面超微結(jié)構(gòu)的改變，同時(shí)對(duì)力曲線進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)膜表面粘附力、硬度、楊氏模量的變化。脂肪前體細(xì)胞在分化后，膜表面變得光滑，粗糙度減小，顆粒大小降低，膜表面粘附力由(146.33±11.23) PN 降低到 (119.95±8.67) PN。而硬度與楊氏模量方面，脂肪前體細(xì)胞也比成熟脂肪細(xì)胞高約20%。對(duì)脂肪細(xì)胞過(guò)程中細(xì)胞膜的研究結(jié)果說(shuō)明，成熟脂肪細(xì)胞比脂肪前體細(xì)胞更易變形，膜的流動(dòng)性更強(qiáng)。AFM 以其在納米級(jí)別的高分辨優(yōu)勢(shì)，獲得的可視化圖像和定量數(shù)據(jù)有助于全面了解脂肪前體細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程和分化機(jī)制。

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Analysis of porcine preadipocytes differentiation by atomic force microscope

Shengpu Li1, Ruyi Shi2, Qiulan Wang1, Mu Wang1, Rui Gan3, Jie Pan1, Jiye Cai1,and Shouquan Zhang2
1 Department of Chemistry, Jinan University, Guangzhou 510632, China
2 College of Animal Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
3 College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China

Received: April 20, 2010; Accepted: July 12, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 20676130).

Corresponding author: Mingbo Gao. Tel: +86-411-87656219; E-mail: lily@dlnu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 20676130) 資助。