物理環(huán)境影響蛋白質(zhì)晶體形核的研究進(jìn)展

陳瑞卿，劉君，鹿芹芹，劉永明，尹大川

西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，西安 710072

物理環(huán)境影響蛋白質(zhì)晶體形核的研究進(jìn)展

陳瑞卿，劉君，鹿芹芹，劉永明，尹大川

西北工業(yè)大學(xué)生命學(xué)院 空間生物實(shí)驗(yàn)?zāi)M技術(shù)國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，西安 710072

物理環(huán)境是影響蛋白質(zhì)晶體形核的重要因素。文中回顧了各種物理環(huán)境如光、電場(chǎng)、超聲波、磁場(chǎng)、微重力、溫度、機(jī)械振動(dòng)、異相形核界面對(duì)蛋白質(zhì)晶體形核的影響，并對(duì)各物理環(huán)境下蛋白質(zhì)晶體形核的可能機(jī)制進(jìn)行探討，展望了利用物理環(huán)境影響蛋白質(zhì)晶體形核的研究前景。

蛋白質(zhì)，晶體，形核，物理環(huán)境

Abstract:This paper reviews the effects of physical environments (including light, electric field, ultrasound, magnetic field,microgravity, temperature, mechanical vibration, and heterogeneous nucleation interface) on protein crystal nucleation. The research results are summarized and the possible mechanisms of the effects are discussed. In the end of this review, the application prospects of these physical environments (including coupled environments) in protein crystallization are presented.

Keywords:protein, crystal, nucleation, physical environment

X射線單晶衍射技術(shù)已經(jīng)解析了85%以上的已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) (PDB，www.pdb.org)，是迄今應(yīng)用最廣泛的生物大分子結(jié)構(gòu)解析技術(shù)。該技術(shù)需要高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體作為衍射對(duì)象，但由于蛋白質(zhì)晶體的制備困難，所以蛋白質(zhì)結(jié)晶是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的“瓶頸”問題之一[1]。蛋白質(zhì)結(jié)晶過程受多參數(shù)影響[2-3]，如物理、化學(xué)或生化因素等，這些因素影響了蛋白質(zhì)晶體的形核及生長(zhǎng)過程。晶體的形核與生長(zhǎng)是蛋白質(zhì)結(jié)晶過程中不可分割的2個(gè)階段，其中，形核作為結(jié)晶過程中的第一個(gè)階段，是獲取蛋白質(zhì)晶體過程起決定性作用的環(huán)節(jié)。因此，合理控制蛋白質(zhì)晶體的形核，不僅可以提高獲得晶體的機(jī)會(huì)，同時(shí)也有利于提高晶體的衍射質(zhì)量。

蛋白質(zhì)晶體的形核和生長(zhǎng)受到一些物理環(huán)境因素的影響，如溫度[4-5]、光[6-7]、電場(chǎng)[8-11]、超聲波[12-13]、磁場(chǎng)[14-16]、微重力[17-18]、機(jī)械振動(dòng)[19]、異相形核界面[20-21]等。重視和把握這些影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素，有助于獲得高質(zhì)量的晶體，為蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的解析打下基礎(chǔ)。

1 蛋白質(zhì)晶體的形核

1.1 蛋白質(zhì)晶體形核的條件

形核是蛋白質(zhì)分子有序聚集進(jìn)而形成穩(wěn)定結(jié)晶簇的自發(fā)過程。在該過程中，分子需要高度的選擇性和正確的取向[22]。形核需要達(dá)到一定的過飽和度，通過蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液體系的相圖 (示意如圖1，引自文獻(xiàn)[23])，有助于深入理解形核的過程。從相圖可了解到系統(tǒng)中相關(guān)變量 (例如蛋白質(zhì)濃度、溫度、溶劑特征、pH及離子強(qiáng)度等) 條件下的物質(zhì)狀態(tài)。

圖1 蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液體系相圖[23]Fig. 1 Schematic illustration of the phase diagram of protein crystallization solution[23].

從圖1可看出，蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液體系相圖一般可分為 4個(gè)區(qū)域：欠飽和區(qū)、亞穩(wěn)區(qū)、形核區(qū)和沉淀區(qū)。在溶解度曲線以下是欠飽和區(qū)，自發(fā)的形核不會(huì)發(fā)生；亞穩(wěn)區(qū)是晶體生長(zhǎng)的最佳區(qū)域，但在任何合理的時(shí)間內(nèi)都不會(huì)自發(fā)形核；在形核區(qū)，過飽和度足夠大，可以保證自發(fā)的形核發(fā)生；在沉淀區(qū)，由于過飽和度太高，更容易迅速形成沉淀[23-24]。

1.2 蛋白質(zhì)晶體形核的機(jī)理

相比于小分子物質(zhì)，由于蛋白質(zhì)分子本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，其晶體的形核機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜。上世紀(jì)90年代，有關(guān)蛋白質(zhì)晶體形核機(jī)理方面的研究比較多[25-26]，但與晶體生長(zhǎng)過程相比，形核過程的研究還是很少。這種現(xiàn)狀與形核過程的重要性地位并不相稱。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因在于形核過程的復(fù)雜性及深入研究的難度較大。

通常認(rèn)為，蛋白質(zhì)晶體形核的驅(qū)動(dòng)力是過飽和度，從自由能角度看，卻不是一個(gè)體系自由能降低的過程。下文將分別從過飽和度和體系自由能變化角度來探討形核過程。

1.2.1 過飽和度與形核

Baird等[27]研究了蛋白質(zhì)晶體形核的機(jī)理，提出形核是由過飽和度驅(qū)動(dòng)的。其研究將形核過程中的相對(duì)過飽和度 定義為：

式中： 是溶液的相對(duì)過飽和度，為無量綱數(shù)；c是溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度；sc是蛋白質(zhì)的溶解度。

在任何時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)在系統(tǒng)中均遵循質(zhì)量守恒定律：

式中：m0是蛋白質(zhì)的初始質(zhì)量；V是溶液的體積；t是時(shí)間；m1是在一段時(shí)間t后晶體從溶液中析出的質(zhì)量。

將方程 (2) 對(duì)時(shí)間t求微分有：

此方程的意義可表述為在某一時(shí)刻晶體質(zhì)量的增長(zhǎng)率與過飽和度的降低率相關(guān)。

由經(jīng)典的形核理論，晶體生長(zhǎng)溶液中出現(xiàn)臨界晶核的速率即形核率 ()Iσ (定義為單位時(shí)間單位體積內(nèi)出現(xiàn)晶核的數(shù)量) 可表示為：

由 (4) 式可知過飽和度越大，形核越快，說明適宜大小的過飽和度可驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)形核。

與小分子晶體的形核相比，蛋白質(zhì)晶體形核需要更大的過飽和度，這已經(jīng)得到了無數(shù)事實(shí)的支持。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，可能與蛋白質(zhì)分子本身的復(fù)雜程度有關(guān)，而且因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子需要在溶液中獲得一致取向時(shí)才有機(jī)會(huì)形核，從而使其形核更加困難。

1.2.2 晶體的形核自由能

晶核形成時(shí)自由能GΔ的變化，也被認(rèn)為是形核過程的驅(qū)動(dòng)力，這是從自由能角度而言的觀點(diǎn)。晶核形成時(shí)，不僅需要達(dá)到一定的臨界尺寸[28]，而且需要越過一定的能量勢(shì)壘才能形成穩(wěn)定的晶核。GΔ依賴于有序堆積聚集體的尺寸，臨界尺寸又與晶核形成時(shí)的能壘相關(guān)。

Gacia-Ruiz[29]研究了形核過程中能量勢(shì)壘的變化。將晶核假定為球形模型 (表面張力不隨方向而改變)，從而推導(dǎo)出形成結(jié)晶簇半徑為r時(shí)的自由能表達(dá)式：

式中：r是結(jié)晶簇半徑；v是摩爾體積，定義為晶胞體積與每單位晶胞中分子數(shù)之間的比例；k為玻爾茲曼常數(shù)；T為體系的絕對(duì)溫度；S為溶液的過飽和度，定義為溶液實(shí)際的活度 (或濃度) /在平衡時(shí)的活度 (或濃度)； 是結(jié)晶簇表面的比能，可認(rèn)為是表面張力。將方程 (5) 對(duì)r求導(dǎo)并令導(dǎo)數(shù)值為0，可得到臨界晶核半徑*r的表達(dá)式：

將 (6) 代入 (5) 式可得達(dá)到臨界尺寸晶核時(shí)，溶液所需要克服的能量勢(shì)壘的表達(dá)式：

晶核形成率I即單位體積的晶核數(shù)在單位時(shí)間內(nèi)形成臨界晶核的速率可表達(dá)為：

式中：B為指前因子，近似為常數(shù)，其值很難從理論上得到。B與形成晶核時(shí)的化學(xué)動(dòng)力學(xué)、溶液的粘性、分子電荷、分子體積和溶液的密度等有關(guān)。

根據(jù)上述所有公式，可見形核過程與溶液過飽和度之間存在密切的關(guān)系。

Durbin和Feher的研究表明[30]，在過飽和的大分子溶液中，如果過飽和度 /sc c超過 1，在正常的結(jié)晶條件下，大分子聚集體自由能隨其尺寸增大而增大，當(dāng)聚集體的尺寸達(dá)到一定值，其自由能達(dá)到最大，尺寸繼續(xù)增加，自由能將開始減小。由于自由能減小過程是一個(gè)自發(fā)進(jìn)行的過程，因此，該有序聚集體的繼續(xù)生長(zhǎng)也相應(yīng)地自發(fā)進(jìn)行。此時(shí)的有序聚集體即為臨界晶核 (即與最大自由能對(duì)應(yīng)時(shí)的聚集體半徑為臨界晶核半徑*r)。高過飽和度溶液的形核自由能要明顯低于低過飽和度溶液的形核自由能如圖 2，引自文獻(xiàn)[29])，可見高過飽和度可降低形核勢(shì)壘。研究還發(fā)現(xiàn)，形成晶核所需要的時(shí)間高度依賴于形核勢(shì)壘的大小。

圖2 形核自由能隨過飽和度的變化圖[29]Fig. 2 Variation in the free energy as a function of supersaturation[29].

2 各種物理環(huán)境下蛋白質(zhì)晶體的形核

2.1 光

近年來，光照作為影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的一個(gè)重要因素，越來越受到結(jié)晶學(xué)家的重視。主要工作集中在：激光和紫外光照射的影響。

利用激光照射蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液的研究發(fā)現(xiàn)，一定強(qiáng)度飛秒激光照射可以促進(jìn)蛋白質(zhì)晶體形核，明顯縮短形核時(shí)間，同時(shí)提高蛋白質(zhì)晶體的質(zhì)量[31-33]。有研究認(rèn)為，激光促進(jìn)蛋白質(zhì)晶體形核的原因是在激光照射下，蛋白質(zhì)溶液中產(chǎn)生了局部過飽和[34]。

在高過飽和溶液中，自發(fā)形核容易產(chǎn)生。利用激光照射，可在低過飽和溶液中形成局部高過飽和區(qū)，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在低過飽和度溶液中的形核，從而有利于生長(zhǎng)高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體。Sasaki等[32]的研究也佐證了上述觀點(diǎn)：在低過飽和度溶液中，應(yīng)用傳統(tǒng)的方法 AcrB膜蛋白不會(huì)結(jié)晶，而在飛秒激光(波長(zhǎng)780 nm、脈沖寬度200 fs) 照射下得到了AcrB膜蛋白晶體，生長(zhǎng)期為3~5 d。膜蛋白的溶解度非常低，其結(jié)晶至今仍很困難，而60%的商業(yè)藥物靶向蛋白都是膜蛋白。因此，此技術(shù)的發(fā)現(xiàn)對(duì)于在低過飽和溶液中結(jié)晶膜蛋白并提高其質(zhì)量有很大價(jià)值。激光照射不僅對(duì)膜蛋白的結(jié)晶有重要的價(jià)值，對(duì)可溶性蛋白的結(jié)晶也有重要的影響。Adachi等[35]的研究表明在相同條件下運(yùn)用傳統(tǒng)方法未得到葡萄糖異構(gòu)酶、核糖核酸酶晶體，而運(yùn)用飛秒激光則誘導(dǎo)了葡萄糖異構(gòu)酶、核糖核酸酶、布氏錐蟲的前列腺素F2a合酶的形核，同時(shí)明顯縮短了布氏錐蟲的前列腺素F2a合酶的結(jié)晶期。

Okutsu等[6,36]研究了氙燈產(chǎn)生的紫外光對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響，發(fā)現(xiàn)紫外照射可促進(jìn)溶菌酶和核糖核酸酶A的形核。在氙燈照射下測(cè)定蛋白質(zhì)的活性，發(fā)現(xiàn)在較短的照射時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)的活性不受影響。選用不同波長(zhǎng)的氙燈進(jìn)行照射，發(fā)現(xiàn)溶菌酶的形核數(shù)量與波長(zhǎng)有很大關(guān)系，在波長(zhǎng)為400 nm時(shí)形核數(shù)量基本不變，而在波長(zhǎng)為280 nm、300 nm時(shí)形核數(shù)量明顯增加，且在280 nm處的形核數(shù)量最大。實(shí)驗(yàn)表明，蛋白質(zhì)表面的氨基酸殘基 (如絲氨酸、酪氨酸) 在光照下會(huì)發(fā)生電子躍遷，形成一種中間態(tài)，進(jìn)而形成穩(wěn)定的二聚體，這通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行了驗(yàn)證。二聚體會(huì)吸引周圍的溶菌酶分子形成穩(wěn)定臨界尺寸的晶核，從而促進(jìn)形核。

2.2 電場(chǎng)

帶電物質(zhì)在電場(chǎng)中會(huì)受到電場(chǎng)力作用，蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，在不同pH值下帶有不同電荷，當(dāng)溶液pH值小于蛋白質(zhì)等電點(diǎn) pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電；反之帶負(fù)電，因此蛋白質(zhì)溶液在電場(chǎng)中時(shí)會(huì)受到電場(chǎng)力的作用。Taleb等[8]于 1999年報(bào)道了電場(chǎng)對(duì)溶菌酶結(jié)晶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在外加電場(chǎng)作用下，溶菌酶晶體數(shù)量明顯減少、尺寸增大，晶核形成率顯著降低，且在陰極形核的幾率比較大。對(duì)其進(jìn)行理論分析，可認(rèn)為，在電場(chǎng)作用下，蛋白質(zhì)溶液可形成濃度梯度，導(dǎo)致結(jié)晶溶液中出現(xiàn)局部過飽和現(xiàn)象，最終影響蛋白質(zhì)晶體的形核和生長(zhǎng)[37]。Al-haq等[38]全面綜述了電場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響，指出電場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)晶體的形核及晶體生長(zhǎng)過程有很大的影響。

Penkova 等[39]的研究表明，在使用坐滴法的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中，電場(chǎng)強(qiáng)度為2~4 kv/cm時(shí)，可抑制鐵蛋白質(zhì)和去鐵鐵蛋白質(zhì)晶體的形核，在4~6 kv/cm時(shí)下卻促進(jìn)此二者的形核；電場(chǎng)強(qiáng)度為2~6 kv/cm時(shí)，可促進(jìn)溶菌酶晶體的形核。分析原因，認(rèn)為可能是在外加電場(chǎng)作用下，溶菌酶向陰極移動(dòng)，溶液中可能會(huì)形成濃度梯度，出現(xiàn)局部過飽和，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)晶核的形成。但當(dāng)溶質(zhì)流動(dòng)較少時(shí)，可能反而會(huì)抑制晶核的形成。因此，一定的溶質(zhì)流動(dòng)速度可能會(huì)導(dǎo)致晶體快速形核。

電場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響是一個(gè)涉及多參數(shù)的過程，例如結(jié)晶的方法、蛋白質(zhì)的種類、電場(chǎng)強(qiáng)度、電場(chǎng)作用的時(shí)間、電極的分布位置及電極數(shù)等，因此其對(duì)形核的影響比較復(fù)雜，當(dāng)條件適宜時(shí)會(huì)促進(jìn)形核，反之會(huì)起到抑制的作用。近期Koizumi等[11]的研究表明可以通過改變交流電場(chǎng)的頻率成功控制溶菌酶晶核形成速率，從而影響晶核形成數(shù)量。

2.3 超聲波

聲結(jié)晶作為聲化工的一個(gè)分支，主要是通過超聲波來控制結(jié)晶過程的一門新穎技術(shù)。聲結(jié)晶很早就應(yīng)用于小分子物質(zhì)，其作用包括可以縮短形核誘導(dǎo)期、促進(jìn)晶核形成、改變?nèi)芤哼^飽和度及亞穩(wěn)區(qū)寬度、影響晶體晶型以及控制晶體的尺寸等[40-41]。近 10年來超聲波已成為強(qiáng)化結(jié)晶過程的熱點(diǎn)問題之一，然而其對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響卻很少有報(bào)道。Luft和 DeTitta[12]曾于 1999年將超聲波用于蛋白質(zhì)結(jié)晶。運(yùn)用的是超聲波振動(dòng)可產(chǎn)生能量的原理，使溶液中的聚四氟乙烯珠子移動(dòng)，將大晶體粉碎為均勻的微小籽晶。將這些微籽晶加入過飽和度低的蛋白質(zhì)溶液中，就可以實(shí)現(xiàn)在亞穩(wěn)區(qū)生長(zhǎng)蛋白質(zhì)晶體。

Kakinouchi等[13]研究了超聲波直接應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶時(shí)的作用。超聲波應(yīng)用于結(jié)晶過程時(shí)會(huì)產(chǎn)生較高的能量，超聲的時(shí)間及超聲的照射點(diǎn)也會(huì)對(duì)結(jié)晶造成一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)：一組實(shí)驗(yàn)為在結(jié)晶實(shí)驗(yàn)開始后的0 min、超聲照射10 s后的結(jié)晶樣品，與未超聲以及超聲作用60 s的對(duì)照樣品相比，超聲10 s明顯縮短了誘導(dǎo)形核的時(shí)間，促進(jìn)了形核，產(chǎn)生的晶體數(shù)量最多；另一組實(shí)驗(yàn)的處理方式為，在結(jié)晶開始后的30 min、超聲照射60 s。與對(duì)照相比，這種處理方式得到的樣品其形核所用時(shí)間反而增加了，但與未超聲處理的樣品相比，也有促進(jìn)形核的作用。分析原因，認(rèn)為可能是由于超聲波打碎了已經(jīng)形成的結(jié)晶簇或晶核，因此延長(zhǎng)了形核誘導(dǎo)期。一定條件下的超聲波處理可明顯降低蛋白質(zhì)形核的誘導(dǎo)期[42]，促進(jìn)晶核的形成，在不同濃度下有同樣的效應(yīng)。在該實(shí)驗(yàn)中超聲波加速溶菌酶晶核形成的原因可能是由于其打碎了一些事先已經(jīng)形成的蛋白質(zhì)晶體作為新的形核中心，從而減少了形核時(shí)間，可見超聲波對(duì)蛋白質(zhì)的作用力大于其分子間的結(jié)合能。

2.4 磁場(chǎng)

Yin等[15]研究了磁場(chǎng)中的蛋白質(zhì)結(jié)晶過程，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液體系在磁場(chǎng)中會(huì)受到磁化力的作用，有可能抑制溶液中的對(duì)流和沉降。Sazaki等[14]在 1997年研究了磁場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)晶體形核和晶體生長(zhǎng)的影響，并證實(shí)在10 T強(qiáng)磁場(chǎng)下，溶菌酶、鐵蛋白質(zhì)晶體的形核數(shù)減少，同時(shí)晶體尺寸增大，且晶體呈現(xiàn)明顯的擇優(yōu)取向現(xiàn)象。可見磁場(chǎng)作用可以控制蛋白質(zhì)晶核的數(shù)量，對(duì)于生長(zhǎng)個(gè)數(shù)少尺寸大的晶體可能是一種很有效的方法。但近期的研究報(bào)道給出了相異的結(jié)果。如本課題組[43]最近研究發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)磁場(chǎng)條件下，順磁溶液中溶菌酶晶體的特異取向會(huì)隨著pH值的改變而改變，根據(jù)該研究結(jié)果，推論得出溶菌酶分子的磁各向異性會(huì)受到溶液中 pH值影響，進(jìn)而影響分子在磁場(chǎng)中的取向。分子在磁場(chǎng)中的共同取向可能有助于分子進(jìn)行有序排列，從而促進(jìn)形核。近期Gavira等[44]的研究也得到類似的結(jié)果。其研究發(fā)現(xiàn)恒定磁場(chǎng)可降低溶菌酶晶核形成的誘導(dǎo)時(shí)間，提高晶核的形成密度。當(dāng)撤去磁場(chǎng)時(shí)，相應(yīng)的效應(yīng)也隨之消失。這些研究結(jié)果表明，磁場(chǎng)可能有助于蛋白質(zhì)晶體的形核。由于過去的報(bào)道互不一致，相關(guān)的研究還有待進(jìn)一步深入進(jìn)行。

除了恒定磁場(chǎng)，梯度磁場(chǎng)對(duì)形核的研究也有報(bào)道。Wakayama等[45]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)結(jié)晶溶液處于梯度磁場(chǎng)中的不同位置時(shí)，晶核形成會(huì)有不同的表現(xiàn)。研究表明，在梯度磁場(chǎng)中，當(dāng)磁力與所受重力反向時(shí)，溶菌酶結(jié)晶溶液的重力水平降低 5%，晶體數(shù)少于對(duì)照組，這可能是由于失重減少了溶液的沉降和對(duì)流；當(dāng)磁場(chǎng)與所受重力同向時(shí)，溶菌酶結(jié)晶溶液的重力增加 5%，晶體數(shù)量多于對(duì)照組，這可能是由于超重增加了溶液中的沉降和對(duì)流，易形成臨界晶核所致?？梢娞荻却艌?chǎng)可通過改變重力水平影響晶體生長(zhǎng)過程中的沉降和對(duì)流，從而影響蛋白質(zhì)晶體形核及生長(zhǎng)過程[46]。

2.5 微重力

蛋白質(zhì)結(jié)晶通常在常重力條件下進(jìn)行。隨著空間科學(xué)及技術(shù)的迅速發(fā)展，在微重力環(huán)境下生長(zhǎng)蛋白質(zhì)晶體成為可能。自上個(gè)世紀(jì)80年代開始，探空火箭、返回式衛(wèi)星、空間站等手段被大量用于開展空間蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。一般認(rèn)為，空間微重力主要通過兩個(gè)方面的作用影響蛋白質(zhì)結(jié)晶：一方面，微重力條件下自然對(duì)流基本消失。在此情況下，溶質(zhì)輸運(yùn)受到限制，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)中的晶體周邊出現(xiàn)溶質(zhì)缺乏區(qū)，使晶體生長(zhǎng)過程中的溶質(zhì)輸運(yùn)主要由擴(kuò)散完成。這被普遍認(rèn)為是改善晶體質(zhì)量的主要原因之一。另外一個(gè)方面，空間微重力條件下，沉降現(xiàn)象消失。在常重力條件下，研究表明[17]，當(dāng)晶體尺寸增長(zhǎng)到1 μm時(shí)，原來在溶液中懸浮的晶體，會(huì)在重力作用下發(fā)生沉降，從而容易發(fā)生晶體之間的融合，導(dǎo)致晶體質(zhì)量變差。在空間微重力環(huán)境中，由于導(dǎo)致沉降的重力因素消失，因此沉降現(xiàn)象消失。這也是解釋晶體質(zhì)量提高的主要原因之一。

微重力環(huán)境對(duì)形核的影響方面，研究結(jié)果顯示，微重力環(huán)境下，晶體形核時(shí)間延長(zhǎng)，數(shù)量減少，尺寸增大[17-18,47]?？梢娢⒅亓l件下晶體形核的機(jī)會(huì)是減少的。

過去，受航天活動(dòng)機(jī)會(huì)及發(fā)射成本等的限制，空間蛋白質(zhì)結(jié)晶僅取得了有限的成功。長(zhǎng)遠(yuǎn)看，隨著未來空間環(huán)境利用的逐步普及，空間蛋白質(zhì)結(jié)晶無論在實(shí)際應(yīng)用還是在繼續(xù)深入機(jī)理研究方面，均有望迎來新的重要發(fā)展。

2.6 溫度

溫度與蛋白質(zhì)的溶解度具有直接的相關(guān)性，對(duì)于大部分蛋白質(zhì)而言，在一定的溫度范圍內(nèi)，其溶解度隨溫度的升高而增加。但一些蛋白質(zhì)具有倒溶解度，即溶解度隨溫度的升高而降低。因此溫度可通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的溶解度從而改變?nèi)芤旱倪^飽和度，繼而影響蛋白質(zhì)晶體形核和生長(zhǎng)過程。

以溫度作為推動(dòng)力，結(jié)晶實(shí)驗(yàn)可快速并且可逆地控制過飽和度，影響晶體的數(shù)量、尺寸及質(zhì)量[48-49]。Murai等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下，溶菌酶在不同溫度下的形核數(shù)有顯著差異。在高濃度的溶菌酶溶液中，低溫下形核數(shù)要明顯多于高溫下。在低濃度的溶菌酶溶液中，在溫度升高到一定值時(shí)沒有晶體出現(xiàn)，這說明溫度的升高使溶菌酶溶液進(jìn)入未飽和區(qū)，從而無法形核，不能獲得晶體。Lin等[50]研究了不同溫度下10種蛋白質(zhì)結(jié)晶的相圖，通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)改變溫度可控制形核區(qū)的面積，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)晶體的形核與生長(zhǎng)。

溫度梯度法是目前普遍應(yīng)用于結(jié)晶的一種方法，當(dāng)需要解析某種未知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)時(shí)，其最佳的結(jié)晶溫度尚不明確時(shí)，溫度梯度法將是一種很好的選擇，此法可明顯促進(jìn)形核[51]。Murai等[52]通過計(jì)算機(jī)來控制冷卻速率，在單一的微孔板上產(chǎn)生許多溫度點(diǎn)，形成在不同冷卻速率下的溫度梯度，將20 ℃下沒有蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的溶液進(jìn)行冷卻，冷卻速率為1.5 ℃~4 ℃/d，用顯微鏡進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)快速冷卻條件下可促進(jìn)形核，冷卻速度慢的條件下晶體數(shù)量少尺寸大，以此可成功控制晶體數(shù)量及晶體的尺寸。本課題組[4,53]使用溫度掃描的方法對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明溫度掃描明顯促進(jìn)了蛋白質(zhì)晶體形核，明顯提高了篩選的成功率。溫度梯度法雖然可以通過改變溫度來控制蛋白質(zhì)晶體的形核，然而溫度變化有一定的局限性，因?yàn)椴⒎撬械鞍踪|(zhì)對(duì)溫度變化都是很敏感的。

2.7 機(jī)械振動(dòng)

事實(shí)上，在蛋白質(zhì)結(jié)晶過程中，機(jī)械振動(dòng)總是存在的。但是該環(huán)境對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的影響研究未見報(bào)道過。本課題組最近研究了主動(dòng)機(jī)械振動(dòng)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的可重復(fù)性及結(jié)晶條件篩選成功率的影響[19]。發(fā)現(xiàn)在機(jī)械振動(dòng)環(huán)境中，低過飽和度條件下的蛋白質(zhì)晶體形核數(shù)量減少；而高過飽和度條件下的蛋白質(zhì)晶體形核數(shù)量與對(duì)照組相當(dāng)，甚至增加。經(jīng)詳細(xì)研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)械振動(dòng)總體上抑制蛋白質(zhì)晶體的形核。但是在高過飽和度條件下，足夠高的過飽和度保證了在機(jī)械振動(dòng)下的晶體形核，但是在沒有機(jī)械振動(dòng)的情況下，由于過飽和度高，蛋白質(zhì)分子聚集太快，最后形成了沉淀，從而使在高過飽和度條件下蛋白質(zhì)在沒有振動(dòng)時(shí)形核數(shù)量反而較低。除了抑制形核外，另一個(gè)有趣的發(fā)現(xiàn)是，機(jī)械振動(dòng)下生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)晶體通常在外觀上看起來更完美，預(yù)示其晶體質(zhì)量可能更好。

2.8 異相形核

MchPerson第一次將異相形核材料用于蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)[20]，以此來控制形核時(shí)的過飽和度。這一研究意義很大，因?yàn)槠渲赋隽艘环N在較低過飽和條件下形核的途徑，非常有利于生長(zhǎng)高質(zhì)量的晶體。此后多種異相形核材料如多孔滲水硅[54]、聚合體膜[55]、脂肪酸薄膜[56]、多微孔合成沸石[57]、功能化處理的云母片[58]、氫氟酸處理的蓋玻片[59]等被用于誘導(dǎo)及控制蛋白質(zhì)晶體的形核。2009年 Asanithi等[21]第一次將碳納米管薄膜用于蛋白質(zhì)結(jié)晶，研究表明應(yīng)用這種納米尺度的多孔材料可以控制形核，使在過飽和度低的溶液中生長(zhǎng)數(shù)量少尺寸大的蛋白質(zhì)晶體。此技術(shù)成功地用于MyBP-C蛋白質(zhì)的結(jié)晶，衍射分辨率達(dá)1.6 ?，是傳統(tǒng)結(jié)晶方法下獲得最好衍射分辨率的 2倍。這種材料微孔尺寸與晶核的尺寸大小相當(dāng)，可促進(jìn)蛋白質(zhì)晶體的快速形核，是蛋白質(zhì)晶體形核極好的候選材料。

由于使用異相形核的方法對(duì)很多蛋白質(zhì)的結(jié)晶有效，因此，近年來結(jié)晶學(xué)家一直在尋求一種結(jié)晶的通用晶核[60]。2009年Saridakis和Chayen對(duì)近年來異相形核多孔材料的研究進(jìn)行了總結(jié)[61]，指出迄今為止最接近于通用晶核的是CaO-P2O5-SiO2(稱作生物玻璃)，這種晶核促進(jìn)了 14種蛋白質(zhì)的結(jié)晶，其中包括了多種傳統(tǒng)方法難于結(jié)晶的蛋白質(zhì)。然而到目前為止，仍不能說已經(jīng)找到針對(duì)于所有蛋白質(zhì)結(jié)晶的通用晶核。

3 展望

隨著生命科學(xué)領(lǐng)域的飛速進(jìn)展，迫切需要對(duì)各類蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，這對(duì)于以蛋白質(zhì)為靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的，X射線單晶衍射法解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)需要獲得高質(zhì)量的晶體，形核作為蛋白質(zhì)結(jié)晶的第一步，并對(duì)晶體質(zhì)量起到一定的操控作用，因此形核方法的研究是不容忽視的。

目前對(duì)于許多晶體形核方法的機(jī)制尚不明確，有待科學(xué)家們進(jìn)一步的探索。新的可控制形核的方法相繼出現(xiàn)，與已有的結(jié)晶技術(shù)相融合，取得了部分階段性的成果，如磁場(chǎng)與電場(chǎng)的結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)晶體形核率的提高，多物理場(chǎng)耦合作用有望成為下一階段蛋白質(zhì)晶體形核研究的熱點(diǎn)之一。隨著許多新型的異相形核材料用于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，通過材料表面的功能化控制晶體形核的數(shù)量及時(shí)間亦將成為這個(gè)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。

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Effects of physical environments on nucleation of protein crystals: a review

Ruiqing Chen, Jun Liu, Qinqin Lu, Yongming Liu, and Dachuan Yin
Key Laboratory for Space Bioscience & Biotechnology, School of Life Sciences, Northwestern Polytechnic University, Xi’an 710072, China

Received: May 27, 2010; Accepted: September 20, 2010

Supported by: Health and Science Foundation of Health Department of Jiangsu Province (No. H200914).

Corresponding author: Yehan Zhu. Tel: +86-512-67780353; E-mail: zhuyehansz@sina.com

江蘇省衛(wèi)生廳衛(wèi)生科技發(fā)展項(xiàng)目 (No. H200914) 資助。