利用小亞基核糖體RNA技術(shù)分析溫室黃瓜近根土壤古菌和真菌多樣性

趙志祥，蘆曉飛，陳國華，茆振川，楊宇紅，劉二明，謝丙炎

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081

2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科技學(xué)院，長沙 410128

利用小亞基核糖體RNA技術(shù)分析溫室黃瓜近根土壤古菌和真菌多樣性

趙志祥1,2，蘆曉飛1，陳國華1，茆振川1，楊宇紅1，劉二明2，謝丙炎1

1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081

2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科技學(xué)院，長沙 410128

土壤古菌和真菌在溫室生態(tài)系統(tǒng)是僅次于細(xì)菌的微生物，具有類似于細(xì)菌的重要生態(tài)功能。通過構(gòu)建古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因克隆文庫，分析溫室黃瓜近根土壤古菌和真菌群落結(jié)構(gòu)組成，為開發(fā)利用溫室這一特殊的生態(tài)環(huán)境中豐富的微生物資源以及理解微生物與植物間的互作提供參考依據(jù)。采用研磨-凍融-溶菌酶-蛋白酶K-SDS熱處理以及CTAB處理等理化方法，提取和純化微生物總DNA，構(gòu)建古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因克隆文庫。利用DOTUR軟件將古菌和真菌序列按照相似性97%的標(biāo)準(zhǔn)分成若干個(gè)可操作分類單元 (OTUs)。土壤古菌克隆文庫主要包括泉古菌門和未分類的古菌兩大類，并有少部分廣域古菌類群，所有泉古菌均屬于熱變形菌綱，共45個(gè)OTUs；真菌克隆文庫包括真菌門的大多數(shù)亞門真菌，共24個(gè)OTUs，未發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌亞門真菌。古菌多樣性比較豐富，且發(fā)現(xiàn)少量的廣域古菌 (甲烷菌)，這一情況可能與溫室長期高溫高濕，高有機(jī)質(zhì)含量，土壤處于缺氧環(huán)境有關(guān)；土壤真菌的優(yōu)勢種群為子囊菌，占到土壤真菌的80%以上，這可能與絕大多數(shù)植物真菌性病害屬于土傳病害，通過菌絲體、菌核或子囊殼在土壤病殘?bào)w中越冬有一定的關(guān)系。

土壤微生物群落，古菌16S rRNA基因，真菌18S rRNA基因，系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

1 Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100081, China

Received: March 2, 2010; Accepted: April 30, 2010

Supported by: National Basic Research Program of China (No. 2009CB119000), Public Service Sectors (agriculture) Special Funding for Research (No. nyhyzx07-050), Key Projects in the National Science and Technology Pillar Program during the Eleventh Five-Year Plan Period (Nos.2006BAD07B03, 2006BAD08A08, 2006BAD17B08).

Corresponding author: Bingyan Xie. Tel: +86-10-82109545; E-mail: xiebingyan2003@yahoo.com.cn

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2009CB119000)，公益性行業(yè) (農(nóng)業(yè)) 科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi) (No. nyhyzx07-050)，國家“十一五”國家科技支撐計(jì)劃 (Nos. 2006BAD07B03, 2006BAD08A08, 2006BAD17B08) 資助。

2 College of Biosafety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China

Abstract:Soil archaea and fungi play important roles in the greenhouse soil ecosystem. To develop and apply rich microbial resources in greenhouse ecological environment, and to understand the interaction between microbes and plants, we constructed archaeal 16S rRNA and fungal 18S rRNA gene libraries to analyze the compositions of archaeal and fungal communityies. Total greenhouse soil DNA was directly extracted and purified by skiving-thawing-lysozyme-proteinase K-SDS hot treatment and treatment of cetyltriethylammnonium bromide (CTAB). After PCR amplification, retrieving, ligating, transforming, screening of white clones, archaeal 16S rRNA and fungal 18S rRNA gene libraries were constructed. The sequences of archaea and fungi were defined into operational taxonomic units (OTUs) when 97% similarity threshold for OTU assignment was performed by using the software DOTUR. Phylogenetic analysis showed that crenarchaeota and unidentified-archaea were the two major sub-groups and only a few of euryarchaeota existed in the archaeal clone library, total 45 OTUs. All the crenarchaeota belonged to thermoprotei;except for Basidiomycotina, the other four sub-group fungi were discovered in the fungal library, total 24 OTUs. The diversities of archaea were very abundant and a few euryarchaeota (methanebacteria) existed in the archaeal clone library, it might be directly related to the long-term high temperature, high humidity, and high content of organic matter. The limitation of oxygen was the other reason for causing this phenomenon; Ascomycotina (over 80%) was the dominant sub-groups in fungal library. It was because most of the plant fungal diseases belonged to soil-borne diseases which gone through the winter by the ways of scierotium or perithecium and became the sources of primary infection.

Keywords:soil microbial communities, archaeal 16S rRNA gene, fungal 18S rRNA gene, phylogenetic analysis

土壤微生物代表著地球環(huán)境中相當(dāng)大部分的微生物量[1]。據(jù)估計(jì)，每公頃的表層土壤中包含著103~104kg的微生物生物量[2]。它的活動(dòng)影響著地球環(huán)境中的營養(yǎng)循環(huán)、有機(jī)質(zhì)的分解、土壤肥力、以及物質(zhì)與能量的交換[3]。盡管具有結(jié)構(gòu)和功能多樣性，長期以來，人們對其的研究極其有限，多數(shù)情況下，局限于傳統(tǒng)的可純培養(yǎng)的方法[4]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用，小亞基核糖體RNA (Small subunit rRNA，SSU rRNA)序列分析作為微生物分類系統(tǒng)的主要依據(jù)也得到了廣泛認(rèn)同，隨著微生物核糖體數(shù)據(jù)庫的日益完善，該技術(shù)成為微生物分類和鑒定的一個(gè)有力工具。

在土壤微生物群體中，人們研究得最多的是細(xì)菌群體。據(jù)估計(jì)，1 g土壤樣品中，含有103~107個(gè)細(xì)菌種 (Species)[5-6]。然而古菌和真菌多樣性同樣豐富。到目前為止，僅有美國學(xué)者Fierer等[7]系統(tǒng)地研究過同一環(huán)境樣品中細(xì)菌、古菌、真菌和病毒多樣性，國內(nèi)尚未見報(bào)道。

溫室常年種植單一作物，高溫高濕度 (年平均氣溫＞28 ℃，相對濕度＞80%)，有機(jī)質(zhì)含量相當(dāng)豐富。從而造成了該特定環(huán)境下微生物種類的特異性和物種豐度的穩(wěn)定性，以及單一微生物物種對該環(huán)境的偏好性。因而，研究溫室土壤微生物多樣性，對了解微生物與主栽作物之間的互作關(guān)系有十分重要的意義，對開發(fā)利用溫室土壤中豐富的微生物資源以及理解土壤溫度、濕度、酸堿度等物理化學(xué)性質(zhì)的變化對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響提供參考依據(jù)。在之前的研究中，我們結(jié)合細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫和宏基因組末端測序技術(shù)，分析了溫室黃瓜近根土壤細(xì)菌多樣性，初步了解了溫室黃瓜近根土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成。但細(xì)菌并不是唯一的土壤微生物，古菌和真菌也占有相當(dāng)大的比例。

因此，為全面弄清溫室黃瓜近根土壤微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成情況，本試驗(yàn)繼續(xù)對溫室黃瓜近根土壤古菌和真菌多樣性進(jìn)行了研究。從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃瓜溫室采集土壤樣品，直接提取和純化土壤微生物總DNA，構(gòu)建古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因克隆文庫，分析了溫室黃瓜近根土壤古菌和真菌多樣性。對開發(fā)利用溫室這一特殊的生態(tài)環(huán)境中豐富的微生物資源以及理解微生物與植物間的互作提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 溫室土壤類型及栽培管理

土壤類型為潮土，前茬作物為黃瓜 (種植年限10年以上)，品種為中農(nóng)118。種植前，先將地塊深翻，并且撒上13.3 kg/hm2的蛭石，與土壤混勻，增加土壤疏松度和保濕能力。用平板鋤頭或者鍬挖出245 mm×175 mm大小的坑，播種黃瓜前，每坑補(bǔ)上120 g的干雞糞，與周邊土壤稍混勻。人工管理，中途不施加其他化學(xué)肥料和農(nóng)藥。從苗子長出到 6葉期，少量噴霧澆水的方式，每日1次，每次10 min，6葉期后，加大噴水次數(shù)，每日分早、中、晚3次，每次10 min。每年3月份，溫室最后一季黃瓜收完之后，取近根土壤。其中一份土壤經(jīng)測量濕重為200.004 g，25 ℃、100 r/min的烘箱中，烘至土壤不再粘結(jié)成塊為止，土壤干重為168.1 g。因此，估計(jì)土壤濕度在15%以上。

1.1.2 土壤樣品

土樣于2008年3月采自海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)農(nóng)場黃瓜種植地。選擇10個(gè)種植黃瓜的地塊，采用五點(diǎn)采樣法，用土壤采樣器采集5個(gè)黃瓜近根 (采集直徑10 cm，采集深度0~15 cm)的土壤樣品，混合后用密封袋帶回，土樣用10 mesh(2 mm) 篩網(wǎng)過篩，去除小顆粒的石頭和殘存的植物根系，存放于-20 ℃冰箱中。土壤性質(zhì)見表1。

1.2 DNA的提取與純化

參考Bertrand等的方法并稍作改進(jìn)[8]。用100 μL TE溶解，1%瓊脂糖電泳檢測，-20 ℃保存。獲得的粗DNA用上海申能博彩公司生產(chǎn)的DNA柱純化試劑盒進(jìn)行純化。

1.3 古菌 16S rRNA和真菌 18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增

以純化后的DNA為模板，分別用古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增所用反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL，Mg2+(25 mmol/L) 4 μL，dNTPs (5 mmol/L) 2 μL，上下游引物 (10 pmol/L) 各2 μL，模板 (純化后的土壤DNA)10 ng，Taq DNA 聚合酶 (5 U) 0.7 μL，用 ddH2O 補(bǔ)足50 μL體系。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃ (或 52 ℃，擴(kuò)增真菌 18S rRNA基因) 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，12 ℃保溫1 h。退火溫度和延伸時(shí)間見表2。

1.4 基因克隆文庫的構(gòu)建

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收900 bp的古菌和600 bp左右的真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接至pGEM-T上，大腸桿菌TOP10轉(zhuǎn)化，在含有IPTG和X-Gal以及氨芐青霉素的LB平板上37 ℃過夜培養(yǎng)。挑白斑，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，每克隆菌液取1 μL，T7和SP6進(jìn)行菌液PCR，篩選陽性克隆，構(gòu)建基因克隆文庫。T7：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′，SP6：5′-ACGAT TTAGGTGACACTATAG-3′。

表1 土壤理化性質(zhì)Table 1 The soil samples tested in this study

表2 擴(kuò)增古菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因所用引物Table 2 Primers for amplifying archaeal 16S rRNA and fungal 18S rRNA genes

1.5 序列測定及序列分析

1.5.1 古菌ARDRA分型和測序

將鑒定為陽性克隆的古菌菌液 PCR產(chǎn)物進(jìn)行rDNA擴(kuò)增片段限制性內(nèi)切酶分析 (Amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)，用HinfⅠ和Hae Ⅲ對菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物37 ℃酶切2 h，根據(jù)酶切圖譜，將陽性克隆分成若干個(gè)可操作分類單元 (OTU)，統(tǒng)計(jì)OTU的種類和各OTU所含陽性克隆的數(shù)量[9]，將每一個(gè)OTU類型送3~5個(gè)進(jìn)行測序分析，測序工作由北京諾賽生物技術(shù)公司完成。

1.5.2 真菌克隆文庫的測序

真菌克隆文庫插入片段較小，小于580 bp，不利于 ARDRA分型后的電泳檢測，酶切條帶呈輻射狀，不利于觀察，因此，我們隨機(jī)挑取 200個(gè)真菌陽性克隆進(jìn)行測序，測序工作同樣由北京諾賽生物技術(shù)公司完成。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹的構(gòu)建和物種豐度分析

1.6.1 古菌系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹的構(gòu)建

序列相似性≥97%的認(rèn)為是一個(gè)同樣的類型并且用一個(gè)單獨(dú)的序列來代表[10]，即用單個(gè)的OUT來代表, 將每個(gè)OTU代表序列在NCBI進(jìn)行序列比對，并下載一致性最高的序列作為參比序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用Mega4.0軟件包[11]，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.6.2 真菌界系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹的構(gòu)建

將真菌克隆文庫中已測得的 176條序列，在NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/Vecscreen.html) 中在線去除載體序列，并截取500 bp的片段后，在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，由Blastn去掉同源性比對相同的結(jié)果，選取文庫中代表單一OTU的基因序列，采用Mega4.0軟件包[11]，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接提取和純化土壤微生物總DNA

直接法提取的微生物總 DNA更能代表樣品的微生物群落，能夠比較全面地了解、鑒定土壤中微生物的多樣性。但是提取DNA的同時(shí)也提取了其他有機(jī)土壤成分，比如腐質(zhì)酸和褐菌酸等。本試驗(yàn)采用上海申能博彩公司生產(chǎn)的 DNA柱純化試劑盒進(jìn)行純化后可獲得高質(zhì)量的土壤微生物總DNA，且片段大小＞23 kb (圖1)，適合進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)。

圖1 純化后的土壤微生物總DNAFig. 1 Extraction and purification of total soil microbial DNA.M: DNA marker λHind ; 1Ⅲ?7: DNA template.

2.2 PCR擴(kuò)增古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因

經(jīng)探索，擴(kuò)增兩種基因時(shí)，DNA濃度稀釋倍數(shù)在30~100倍之間均可以達(dá)到較理想的擴(kuò)增效果。本試驗(yàn)將7份DNA原液稀釋50倍作為模板，擴(kuò)增古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因，每次PCR反應(yīng)設(shè)置3次重復(fù)，將21次重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合后，利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收。結(jié)果分別得到900 bp和580 bp大小的片段 (圖2A、2B)。將各類回收的PCR產(chǎn)物分別連接在PGEM-T載體上，用于構(gòu)建古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因克隆文庫。

2.3 基因克隆文庫的構(gòu)建

2.3.1 古菌16S rRNA基因克隆文庫的構(gòu)建

通過連接，轉(zhuǎn)化，藍(lán)白斑篩選，挑白斑，搖菌，挑取672個(gè)古菌克隆，用引物T7和SP6進(jìn)行陽性克隆菌液PCR反應(yīng)檢測，603個(gè)插入目的片段的古菌克隆，陽性率分別為90%。通過ARDRA分析，得到40個(gè)不同的可操作分類單元 (OTUs)，其中有15個(gè)OTU類型代表單克隆，最多的RFLP類型包括86個(gè)克隆。反映古菌豐度的稀缺性曲線見圖3A。

通過ARDRA獲得的CoverageC[12]值相對較高，為 97.5%。CoverageC理論上表示克隆文庫中包含的微生物種類 (OTU) 占樣品中全部微生物種類的比例，它的計(jì)算式如下：(a) C=1?n1/N，N代表文庫的庫容，n1代表在克隆文庫中僅出現(xiàn)一次的 OTU數(shù)量。如果 CoverageC很高，甚至達(dá)到 100%，說明庫容已經(jīng)飽和。

然而，ARDRA分型有其局限性，且通過對酶切后的電泳膠圖的觀察，誤差較大。為盡可能地覆蓋所有古菌類型，挑取了310個(gè)古菌陽性克隆進(jìn)行測序，測序共得到297條古菌序列。

用 DOTUR軟件分析，把序列相似性≥97%的定義為同一個(gè)OTU[10]。這樣測得的297條古菌序列歸屬為45個(gè)OTU。其中有19個(gè)OTU只有1個(gè)克隆，最多的 5個(gè) OTU類型分別含有 39、28、24、20和18個(gè)克隆。利用DOTUR軟件生成的數(shù)據(jù)，繪制稀缺性曲線 (圖3B)，分析表明，這些克隆代表了文庫中大多數(shù)古菌的多樣性。

古菌文庫中部分克隆尚難確定其分類地位，可能代表新的屬和種。這些序列已在GenBank中登錄，并獲得核酸序列登錄號。已獲得的古菌序列登錄號有：FJ455763-FJ455766、FJ490632-FJ490675、GU394949-GU394952、GU434679-GU434688。

圖2 古菌16S rRNA基因 (A) 和真菌18S rRNA基因 (B) 的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig. 2 PCR amplification results of total DNA with archaeal 16S rRNA universal primers (A) and PCR amplification of total DNA with fungal 18S rRNA universal primers (B). M1, M2: DNA marker DL2000; 1–7: PCR amplication of archaeal 16S rRNA; 8?12: PCR amplication of fungal 18S rRNA.

圖3 ARDRA分析繪制的古菌稀缺性曲線 (A) 和DOTUR軟件分析繪制的古菌稀缺性曲線 (B) (DNA水平上有3%的序列差異，則認(rèn)為不同的OTU)Fig. 3 Rarefation curves generated for 16S rRNA genes in the archeal clone library by analysis of ARDRA (A) and rarefation curves generated for 16S rRNA genes in the archeal clone library by DOTUR software (B). OTUs were defined as groups of sequences differing by 3% at the DNA level.

2.3.2 真菌18S rRNA基因克隆文庫的構(gòu)建

隨機(jī)挑選400個(gè)克隆，通過鑒定，共有386個(gè)插入目的片段的克隆，陽性率達(dá)到 96.5%。為盡可能地覆蓋環(huán)境樣品中真菌類型，挑取196個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序。測序共得到176 個(gè)真菌18S rRNA基因序列。

運(yùn)用 DOTUR軟件進(jìn)行分析，176 個(gè)真菌 18S rRNA基因序列歸屬25個(gè)OTUs，其中11 個(gè)OTU只有1個(gè)克隆，最多的3個(gè)OTU類型分別含有71、59和 10個(gè)克隆。利用 DOTUR軟件繪制真菌18S rRNA基因克隆文庫稀缺性曲線 (圖4)，分析表明，文庫的CoverageC為94%，這些克隆代表了大多數(shù)真菌的多樣性。

圖4 DOTUR軟件分析繪制的真菌18S基因克隆文庫稀缺性曲線Fig. 4 Rarefation curves generated for 18S rRNA genes in the clone library by DOTUR software. OTUs were defined as groups of sequences differing by 3% at the DNA level.

同樣地，少部分真菌克隆尚難確定其分類地位，可能代表新的屬和種。這些序列已在GenBank中登錄，并獲得核酸序列登錄號：GU395091-GU395093，GU394948。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

2.4.1 古菌16S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

利用Clustalx對297條古菌16S rRNA基因序列進(jìn)行全局比對，并將產(chǎn)生的phylip文件，輸入phylip軟件中進(jìn)行排序分析，產(chǎn)生相應(yīng)的輸出文件(Outfile)，然后將該輸出文件 (Outfile) 變成DOTUR軟件中的輸入文件(Infile)，序列相似性≥97%的定義為一個(gè)古菌序列，共得到45種不同類型的古菌。

通過對古菌16S rRNA基因克隆文庫進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹分析 (圖5) 發(fā)現(xiàn)，該文庫主要覆蓋了嗜泉古菌 (Crenarchaeota)、未分類的古菌 (Unclassified_Archaea) 和廣域古菌 (Euryarchaeota)。其中 232個(gè)克隆屬于嗜泉古菌 (Crenarchaeota)，占克隆文庫的78.1%，56個(gè)克隆屬于未分類的古菌 (Unclassified_Archaea)，占克隆文庫的19.2%，另外，還有9個(gè)克隆屬于未純培養(yǎng)的廣域古菌 (Uncultured Euryarchaeota)，占克隆文庫的 2.7%，并且，這 9個(gè)克隆序列與NCBI中廣域古菌 (Euryarchaeota) 甲烷菌 (Methanococci) 的序列相似性在 91%~98 %之間，克隆HBA287 (FJ490663) 與未培養(yǎng)的廣域古菌克隆 (Uncultured euryarchaeote clone CFS-F12)序列相似性為96%，克隆HBA29 (GU434686) 相似性更低，僅為94%。

從系統(tǒng)發(fā)育樹來看 (圖 5)，嗜泉古菌(Crenarchaeota) 占了 3大部分，其中，有一部分與廣域古菌 (Euryarchaeota) 親緣關(guān)系較近，未鑒定的古菌與嗜泉古菌、廣域古菌的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且與從 NCBI上下載的極端環(huán)境 (火山口) 未鑒定的古菌序列相似性較高。

另外，所獲得的全部古菌序列在核糖體數(shù)據(jù)庫(Ribosomal Database Project，RDP) 中進(jìn)行比對，除了9條序列屬于廣域古菌 (Euryarchaeota) 外，其他288條古菌序列都屬于熱變形菌綱 (Thermoprotei)，其中包括4個(gè)目，分別是脫琉球菌目 (Desulfurococales)、硫化葉菌目 (Sulfolobales)、暖球形菌目 (Caldisphaerales)和熱變形菌目 (Thermoproteales)，分別占文庫中嗜泉古菌 (Crenarchaeota) 的比例分別為48.5%、20.5%、17.8%和13.2%。

2.4.2 真菌18S rRNA基因系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析

利用DOTUR軟件分析測序得到的176個(gè)真菌18S rRNA基因序列，把序列相似性≥97%的定義為一個(gè)真菌序列[10]。選取文庫中代表不同OUT的序列與環(huán)境樣品中的序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 (圖6)。這些環(huán)境樣品中的序列來自森林土壤[13]、mojave沙漠土壤[7]、草地土壤[14]、火炬松山地土壤[15]等。

圖5 古菌16S rRNA基因克隆文庫系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹 (自舉數(shù)據(jù)集1 000次)Fig. 5 Phylogenetic tree based on archaeal 16S rRNA sequences of the clones obtained from greenhouse soil samples. The tree was constructed via the neighbor-joining method, bootstrap values above 1 000 are shown as percentage.

圖6 溫室土壤真菌18S rRNA基因克隆文庫系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹 (自舉數(shù)據(jù)集1 000次)Fig. 6 Phylogenetic tree based on fungal 18S rRNA sequences of the clones obtained from Beijing greenhouse soil samples. The tree was constructed via the neighbor-joining method, bootstrap values above 1 000 are shown as percentage.

通過對真菌 18S rRNA基因克隆文庫進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育 (圖6) 分析發(fā)現(xiàn)，文庫包含了子囊菌亞門 (Ascomycotina)、接合菌亞門 (Zygomycotina)、鞭毛菌亞門 (Mastigomycotina)、半知菌亞門(Deuteromycotina) 和未分類的不可純培養(yǎng)真菌(Uncultured fungi)，未發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌亞門 (Basidiomycotina)真菌。子囊菌亞門 (Ascomycotina) 是土壤真菌的優(yōu)勢菌群，在測定的176條真菌18S rRNA基因序列中，有 155條序列屬于該菌群，占克隆文庫的88.1%，12個(gè)克隆屬于半知菌亞門 (Deuteromycotina)，占克隆文庫的8.5%，鞭毛菌亞門 (Mastigomycotina)、接合菌亞門 (Zygomycotina) 和不可純培養(yǎng)真菌(Uncultured fungi) 克隆分別為5個(gè)、4個(gè)和4個(gè)，分別占克隆文庫的2.8%、2.3%和2.3%。

從系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹 (圖6) 上可以看出，部分未純培養(yǎng)的真菌克隆 (Uncultured fungus clone) 的親緣關(guān)系比較接近鞭毛菌亞門 (Mastigomycotina)，部分離子囊菌亞門 (Ascomycotina) 較近。子囊菌亞門(Ascomycotina) 中，盤菌 Pezizomycotina和毛殼菌Chaetomium是其優(yōu)勢菌，分別占到子囊菌亞門(Ascomycotina) 的52.3%和33.5%。青霉菌Penicillium和鐮孢菌Fusarium是半知菌亞門 (Deuteromycotina)的優(yōu)勢菌，分別占54.8%和39.7%。

3 討論

本研究結(jié)合 ARDRA分析和基因克隆文庫序列測定的方法來研究溫室黃瓜近根土壤古菌多樣性，能夠快速而準(zhǔn)確地對克隆文庫中古菌種類進(jìn)行分型，將相同酶切圖譜的克隆劃分為一種類型 (OTU)，然后，在每類 OTU中選取有代表性的克隆進(jìn)行測序，這樣就避免了克隆測序的盲目性，減少了測序數(shù)量以及人力、物力和財(cái)力的使用。兩者在分析OTUs時(shí)存在一定的誤差，這可能因?yàn)闃?gòu)建的庫容較大，利用 ARDRA分型后，觀察結(jié)果時(shí)存在誤差，需要借助計(jì)算機(jī)才能更快更準(zhǔn)確地完成分型工作，減少誤差。

古菌的鑒定，是我們了解古菌在其小生境中的生態(tài)功能重要的一步，對全面地分析微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性有十分重要的作用。因此，古菌多樣性的研究越來越受到人們的重視。近年來，人們從極地海洋[16]、淡水湖[17]、紅樹林土壤[18]和西藏米拉山口[9]等不同的環(huán)境樣品取樣，研究古菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，同時(shí)，鑒定了大量新奇的古菌類型。此外，通過比較系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育分析，揭示了古菌群體典型地系統(tǒng)發(fā)育特征。因此，為評價(jià)溫室古菌土壤多樣性，本研究直接以純化后的溫室土壤總DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增，構(gòu)建古菌16S rRNA基因克隆文庫。

通過對文庫進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，嗜泉古菌(Crenarchaeota) 占78.1%，未分類的古菌 (Unclassified_Archaea) 占19.2%，古菌多樣性非常豐富，且有少部分未培養(yǎng)的廣域古菌 (甲烷菌)。這一情況的可能與溫室長期高溫高濕，有機(jī)質(zhì)含量相對豐富，整個(gè)土壤長期處于高溫發(fā)酵，缺氧的狀態(tài)有關(guān)。這一結(jié)果與Leclerc等[19]的報(bào)道是相符合的。Sekiguchi等[20]也報(bào)道高溫發(fā)酵缺氧的消化池中的古菌大部分是廣域古菌 (甲烷菌)。

在嗜泉古菌 (Crenarchaeota) 中，脫琉球菌(Desulfurococales) 和硫化葉菌 (Sulfolobales) 是其優(yōu)勢菌亞群。在環(huán)境樣品中，硫化還原型細(xì)菌和古菌均能將有機(jī)碳礦化成CH4和CO2，且大多數(shù)可培養(yǎng)的硫化還原細(xì)菌對醋酸纖維素和 H2有高度地親和力[21]。因此，本研究中脫琉球菌 (Desulfurococales)和硫化葉菌 (Sulfolobales) 與溫室土壤碳和硫的循環(huán)有關(guān)。至于以何種方式參與碳和硫的循環(huán)有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。

子囊菌 (Ascomycotina) 是土壤真菌的優(yōu)勢菌群，占克隆文庫的 88.1%，其次為半知菌(Deuteromycotina)，占克隆文庫的 8.5%，鞭毛菌(Mastigomycotina)、接合菌 (Zygomycotina) 和不可純培養(yǎng)真菌 (Uncultured fungus) 分別占克隆文庫的2.8%、2.3%和2.3%，未發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌 (Basidiomycotina)。這與近幾年來其他研究人員利用18S rRNA 基因克隆文庫的方法對土壤樣品進(jìn)行分析所獲得的結(jié)果有所區(qū)別。Hunt等[14]利用18S rDNA途徑研究草地土壤真菌多樣性，分析發(fā)現(xiàn)該環(huán)境樣品中土壤真菌包括接合菌 (Zygomycotina)、擔(dān)子菌 (Basidiomycotina) 和子囊菌 (Ascomycotina)，而無鞭毛菌 (Mastigomycotina)和半知菌 (Deuteromycotina)。O’Brien等[15]構(gòu)建了真菌ITS和18S rRNA基因克隆文庫，分析土壤樣品真菌多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種文庫中的子囊菌(Ascomycotina) 和擔(dān)子菌 (Basidiomycotina) 所占的比例基本相當(dāng)，而無其他3種類型的真菌。

該環(huán)境樣品中未發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌亞門真菌(Basidiomycotina)，可能有以下兩方面的原因：其一，擔(dān)子菌亞門真菌 (Basidiomycotina) 在該環(huán)境樣品中的豐度極低，200條測序樣品，甚至增加測序樣品到400或1 000條都難找到一個(gè)擔(dān)子菌亞門真菌(Basidiomycotina) 序列，因此，可以認(rèn)為擔(dān)子菌對該基因克隆文庫中總的真菌物種豐度不會有影響；其二，前茬作物一直為黃瓜，少數(shù)真菌種群在近根選擇性富集，另一部分種群由于不適應(yīng)此微環(huán)境變化而數(shù)量逐漸減少。作為該環(huán)境中弱勢種群的擔(dān)子菌亞門真菌 (Basidiomycotina)，其豐度逐漸減少，甚至檢測不出來，很可能與不適應(yīng)近根微環(huán)境的變化有關(guān)。隨連作茬次增加，選擇性富集于此土壤微環(huán)境的真菌類群開始形成優(yōu)勢菌群，并對其他種群產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致真菌多樣性水平降低，并趨于平穩(wěn)。這與胡元森等[22]的報(bào)道是一致的。

到目前為止，雖無文獻(xiàn)報(bào)道農(nóng)事操作會影響土壤真菌群落結(jié)構(gòu)，但是，土壤真菌群落結(jié)構(gòu)會隨季節(jié)的變化而變化[23]。大多數(shù)植物真菌性病害是由子囊菌亞門真菌引起的，冬季，這些病原物已經(jīng)成熟，以子囊殼和菌核的形式在土壤中越冬，成為來年的初侵染源。因而，子囊菌亞門的物種數(shù)相對較多，土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)組成會相應(yīng)地發(fā)生變化。這也是該克隆文庫中子囊菌是優(yōu)勢菌群的重要原因。

本研究應(yīng)用SSU rRNA基因克隆文庫技術(shù)分別構(gòu)建了溫室黃瓜近根土壤古菌16S和真菌18S rRNA基因克隆文庫，弄清了溫室黃瓜近根土壤古菌和真菌群落的組成情況。但由于病毒無高度保守的序列結(jié)構(gòu)，還不能全面認(rèn)識，需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，為徹底弄清高強(qiáng)度利用條件下溫室土壤微生物的多樣性和動(dòng)態(tài)變化情況，還需考慮土壤理化性質(zhì)、作物種類、施肥情況以及人事操作對微生物的影響等。

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Diversity analysis of archaeal and fungal communities in adjacent cucumber root soil samples in greenhouse by small-subunit rRNA gene cloning

Zhixiang Zhao1,2, Xiaofei Lu1, Guohua Chen1, Zhenchuan Mao1, Yuhong Yang1, Erming Liu2,and Bingyan Xie1

Received: April 19, 2010; Accepted: July 27, 2010

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2010CB833603), National Natural Science Foundation of China (No.30872404).

Corresponding author: Jiye Cai. Tel/Fax: +86-20-85223569; E-mail: tjycai@jnu.edu.cn

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2010CB833603)，國家自然科學(xué)基金 (No. 30872404) 資助。