利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法研究Snap23和Munc 18C在CHO細(xì)胞中的相互作用

趙 岳,宋 瑩,徐凱成*,趙吉生

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院,吉林 長春130033;2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院)

囊泡相關(guān)膜蛋白synaptobrevin/VAMP和syntaxin相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)特異性囊泡運(yùn)輸[1,2]。synaptobrevin/VAMP與突觸小體相關(guān)蛋白Snap25共同形成復(fù)合體[3,4],Snap25主要存在于腦組織,其同源體廣泛分布于于各個(gè)組織。其中Snap23的結(jié)構(gòu)和功能與Snap25相似,分子量為23 KD,與多種syntaxins/VAMPS緊密結(jié)合,參與囊泡的定向靶向和囊泡與細(xì)胞膜的融合過程。Snap23可與許多蛋白相互作用。本研究應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法,檢測(cè)snap23與Munc 18c是否有相互作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 pEYFP-N1質(zhì)粒購自Clontech,RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自QIAGEN;PECFPMunc 18c由德國惠贈(zèng)。XhoⅠ和KpnⅠ內(nèi)切酶、小規(guī)模質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化劑盒購自TAKARA。PfuTaq酶、Lipofectamine Plus Reagent購自 ROCHE。GFP抗體購買自Santa Cruz公司。PCR引物合成及DNA測(cè)序由TAKARA公司完成。胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基購自HYCLONE。CHO細(xì)胞購買自中科院上海細(xì)胞所,DH5α菌由本院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 Snap23基因的擴(kuò)增 自人肌肉組織中提取總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下:Senseprimer:5'-GGGCTCGAGATGGATAATCTGTCATCAGAAG,Antisense primer:5'-GGGGACGTCTTAGCTGTCAATGAGTTTCTT。反應(yīng)條件如下 :50 μ l 反 應(yīng)體 系,cDNA 模板 2 μ l,dNTP(2.5 μ mol/l)5 μ l,引物(20 μ mol/l)各 1 μ l,pfuTaq 酶(5 ×106U/L)0.5 μ l,10×Pfu buffer 5 μ l,其余用水補(bǔ)足 。熱循環(huán)程序:預(yù)變性95℃5min,94℃變性1min,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,總35個(gè)循環(huán),最后一次72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳分析。

1.3 pEYFP-Snap23載體克隆與鑒定 PCR產(chǎn)物切膠回收后進(jìn)行雙酶切,反應(yīng)體系如下:XhoⅠ 1 μ l,KpnⅠ 1 μ l,10×buffer 4 μ l,PCR 產(chǎn)物34 μ l,37℃下酶切5小時(shí);34 μ L pEYFP-N1載體(240 ng/ul)在相同條件下進(jìn)行酶切,分別回收目的基因片段及線性化載體片段并用T4DNA酶連接16 h,轉(zhuǎn)入DH5a感受態(tài)細(xì)胞,37℃培養(yǎng)過夜后在LB板(100 g/l氨芐)上挑取8個(gè)陽性克隆分別加入3 mL LB培養(yǎng)基中(100 g/l卡那)37℃水浴250RPM 震蕩16 h,提取質(zhì)粒酶切鑒定分析,選取4個(gè)克隆測(cè)序。

1.4 pEYFP-Snap23質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞 CHO細(xì)胞培養(yǎng) 含有10%胎牛血清的IMDM培養(yǎng)基,37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),傳代次數(shù)控制在30代之內(nèi),質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:轉(zhuǎn)染前日將細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)板中,每孔細(xì)胞約2×104。當(dāng)融合率達(dá)70-80%時(shí),更換無血清培養(yǎng)基,取 pEYFP-Snap23 質(zhì)粒約 1 μ g,經(jīng) Lipofectamine plus regent作用3 h,加入10%胎牛血清培養(yǎng),同時(shí)轉(zhuǎn)染PEYFP-N1質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。

1.5 熒光觀察免疫印跡鑒定 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察并拍照后,細(xì)胞提取總蛋白進(jìn)行免疫蛋白印跡分析。具體過程:冰上收集細(xì)胞,加入100 μ L RIPA 裂 解液 (10 mM NaPO4pH 7.4,0.3 M NaCl,0.1%SDS,1%NP-40,1%DOC,2 mM EDTA,2 mM PMSF),4℃震蕩裂解30 min后,15 000 g離心30 min回收上清液并檢測(cè)蛋白濃度后,總上樣量50 μ g行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶封閉1 h,加入鼠抗人GFP抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜,洗脫后加入羊抗鼠IgG(1∶1 000)孵育1 h,TBST洗滌后掃描并拍照。

1.6 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

1.6.1 pECFP-Munc 18c和 pEYFP-Snap23共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞。CHO細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板,pECFPMunc 18c和PEYFP-Snap23共轉(zhuǎn)染48h后接種于多聚賴氨酸包被過夜的培養(yǎng)玻片上。

1.6.2 選擇性受體漂白熒光共振能量轉(zhuǎn)移條件YFP excitation:514 nm;Emission,545/40 nm;CFP:Excitation,457 nm;Emission,485/30 nm。

2 結(jié)果

2.1 以Snap23特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后,電泳圖譜顯示在0.7 kb處見到有一處特異性很強(qiáng)的條帶,見圖1。

圖1 人Snap23 PCR結(jié)果

2.2 在pEGFP-snap23 LB培養(yǎng)板上選取轉(zhuǎn)化后8個(gè)陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定,經(jīng)XhoⅠ和KPNⅠ雙酶切后,可見克隆2,3,4,5,6出現(xiàn)0.7 KB的特異性DNA片段。選取2,3,4,5克隆經(jīng)寶泰克公司自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列分析,證明所獲得的cDNA片段與genebank序列完全符合,見圖2。

2.3 利用脂質(zhì)體法將PEYFP-SNAP23轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中,熒光顯微鏡下可見明顯熒光,可見Snap23蛋白是一種可溶性蛋白,主要表達(dá)細(xì)胞核以外的細(xì)胞質(zhì)上。轉(zhuǎn)染PEYFP-N1質(zhì)粒作為對(duì)照,可見EYFP蛋白分布在包括細(xì)胞核在內(nèi)的整個(gè)細(xì)胞上,見圖3。

2.4 利用western-blot方法鑒定pEYFP-Snap23在CHO細(xì)胞中的表達(dá),Western結(jié)果顯示pEYFP-Snap23成功表達(dá),見圖4。

2.5 熒光共振能量轉(zhuǎn)移結(jié)果表明,Munc 18c和snap25存在相互作用,FRET為15.87%+0.5562(N=89),較對(duì)照組(ECFP-與YFP-N1)FRET(5.8%+0.082)明顯增高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見圖5。

圖2 XhoⅠ和KpNⅠ酶切鑒定 pEGP-Snap23

圖3 A PEYFP-Snap23轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中

圖3 B pEYFP-N1轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中

圖4 免疫蛋白即跡檢測(cè)pEYFP-Snap23蛋白表達(dá)

圖5 CFP-Munc 18c和YFP-Snap23熒光共振能量轉(zhuǎn)移結(jié)果

3 討論

囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)在細(xì)胞內(nèi)成分和信息交換過程中起到重要作用,在轉(zhuǎn)運(yùn)過程中,而囊泡與質(zhì)膜融合的胞吐過程是由可溶性N-乙基-敏感因子連接物復(fù)合體(Soluble N-ethyl-maleimide-sensitive fusion factor attachment protein receptor,SNARE)。SNAREs是一個(gè)多功能的蛋白家族,根據(jù)亞細(xì)胞定位不同,分為囊泡上的VSNARE和質(zhì)膜上的T-SNARE,V-SNARE和T-SNARE形成復(fù)合體,共通催化膜融合。Snap23是T-SNAER的亞類蛋白,表達(dá)于多種組織,在非神經(jīng)細(xì)胞的胞吐中起重要作用。已有研究證明:snap23蛋白和多種蛋白有相互作用,包括 STX2,NAPA,KIF5B,STX6,SYBL1,VMP3,STX4等[5]。近些年發(fā)現(xiàn),SNARE蛋白間的結(jié)合也可能通過其他蛋白,如Rab,munc18,SNIP和synip[6]進(jìn)行調(diào)節(jié)。Munc 18是一種在調(diào)節(jié)囊泡錨定,融合和胞吐作用中扮演重要角色的蛋白質(zhì)。哺乳動(dòng)物Munc 18蛋白由三種亞類組成,分別是Munc 18a,Munc18b和Munc 18c[7],有研究表明Munc 18C與STX4結(jié)合從而抑制囊泡錨定與融合。本研究通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移明確Munc 18C是否可以與Snap23蛋白有相互作用。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移是近些年發(fā)展起來的新技術(shù),是研究蛋白質(zhì)相互作用的有力武器。其基本原理是:當(dāng)供體熒光分子受到激發(fā)時(shí),其發(fā)射光譜與受體熒光分子的激發(fā)光譜有重疊部分,并且二者距離很近(＜10 nm)時(shí),受體可被供體所激發(fā),熒光增強(qiáng)[8]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們以CFP和YFP作為配對(duì)來研究Munc 18C和Snap23之間有無相互作用。結(jié)果證明,當(dāng)CFP-Munc 18C被激發(fā)時(shí),可以將能量傳遞給YFP-Snap23,即發(fā)生FRET,證明二者之間可能存在相互作用,但是相互作用的機(jī)制以及其影響因素還需進(jìn)一步研究。

[1]Mollinedo F,Lazo PA.Identification of two isoforms of the vesicle-membrane fusion protein SNAP-23 in human neutrophils and HL-60 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,1997,231(3):808.

[2]Ravichandran V,Chawla A,Roche PA.Identification of a novel syntaxinand synaptobrevin/VAMP-binding protein,SNAP-23,expressed in non-neuronal tissues”[J].J Biol Chem,1996,271(23):13300.

[3]Sonia M A,Rachel R,Marcella V,et al.A dual mechanism controlling the localization and function of exocyticv-SNAREs”[J].Proc Natl Acad Sci,2003,100(15):9011.

[4]Rual,Jean-Franois,Venkatesan Kavitha,Hao Tong,et al.Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network[J].Nature,2005,437(7062):1173.

[5]Martín-Martín B,Nabokina SM,Blasi J,et al.Involvement of SNAP-23 and syntaxin 6 in human neutrophil exocytosis[J].Blood,2000,96(7):2574.

[6]Diefenbach R J,Diefenbach E,Douglas M W,et al.The heavy chain of conventional kinesin interacts with the SNARE proteins SNAP25 and SNAP23”[J].Biochemistry,2002,41(50):14906.

[7]Jewell J L,Oh E,Thurmond D C.Exocytosis mechanisms underlying insulin release and glucose uptake:conserved roles for Munc18c and syntaxin 4[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2010,298:517.

[8]Damelin M,Silver P.Analysis of Protein Interactions In Vivo with Fluorescence Resonance Energy Transfer(FRET)[J].Cold Spring Harb Protoc,2006;doi:10.1101/pdb.prot4581