三種檢測系統(tǒng)測定糖化血紅蛋白相關(guān)性分析及偏倚評估

童華誠,劉 慧,張 美,馬敏敏

(南京同仁醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗科,江蘇 南京211101)

糖化血紅蛋白是血紅蛋白與糖類經(jīng)非酶促反應(yīng)結(jié)合而成的.它的合成過程是緩慢且不可逆的,其血液濃度反映測定前2-3個月機體平均血糖水平。血液糖化血紅蛋白水平被視為糖尿病血糖控制的“金標準”,在臨床上得到廣泛應(yīng)用[1]。

目前臨床實驗室常用的HbA1c測定方法主要是離子交換高效液相色譜法(HPLC)、免疫法及親和層析法三大主流方法?，F(xiàn)階段,我國臨床實驗室不同檢測系統(tǒng)之間測定HbA1c的結(jié)果往往差異很大,臨床上難以作出合理評價,應(yīng)用受到嚴重限制[2]。

本文針對目前臨床上有代表性的三種檢測系統(tǒng)測定HbA1c的結(jié)果作比較研究,對HbAlc測定值的可比性和偏倚程度予以分析報告。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集本院門診及住院糖尿病患者和健康體檢者EDTA抗凝全血,共64份,血標本在采集后6 h內(nèi)檢測完畢。

1.1.2 儀器和試劑 (1)檢測系統(tǒng)一:美國Bio-Rad D-10 HPLC糖化血紅蛋白分析儀及其原裝試劑和校準品(試劑批號:1號液,AA01911;2號液,AA01912;wash液,AA01913。校準品批號:Level 1-AA00927,Level 2-AA00928);(2)檢測系統(tǒng)二:瑞士羅氏公司Roche Cobas全自動生化分析儀,免疫法,Roche公司Tina-Quant HbA1cⅡ試劑和校準品(批號:158507-01)。(3)挪威Axis-Shield公司Afinion AS100分析儀,親和色譜法,原裝進口的配套測試卡及校準品(批號:10146319);(5)質(zhì)控品:檢測系統(tǒng)一、二均使用伯樂公司HbA1c質(zhì)控品(批號:Level 1-33801,Level 2-33802);檢測系統(tǒng)三使用Afinion AS100分析儀專用質(zhì)控品(批號:260311)。

1.2 方法

1.2.1 操作方法 D-10 HPLC法及Afinion親和色譜法測定糖化血紅蛋白為全自動分析,按儀器使用說明書操作;Roche免疫法需要對全血樣本進行預(yù)處理后上機測定。

1.2.2 相關(guān)性分析 參照 CLSI EP9-A2評價方案[3],每天收集新鮮標本8份,分別用4種檢測系統(tǒng)對這8份樣本按順序1→8進行樣本測定,再按相反順序8→1重復(fù)測定,8天共完成64份樣本測定,記錄測定結(jié)果。HPLC法是目前公認測定HbAlc的參考方法,本試驗以D-10離子交換HPLC法測定結(jié)果為參照,計算每個樣本3種方法測定結(jié)果的均值、每個樣本3種方法重復(fù)測定值間差值的絕對值及其他2種方法(Y)與參考方法測定結(jié)果(X)均值間的差值,按EP9-A2文件進行方法內(nèi)及方法間離群值檢查并去除離群值,計算線性回歸方程Y=bX+a。參考檢測系統(tǒng)(X)的測定范圍是否合適,可用相關(guān)系數(shù)(r)做粗略估計,如r≥0.975(或r2≥0.95),則認為X的分析范圍合適,可以用直線回歸計算斜率、截距,依據(jù)已給定的HbA1c醫(yī)學(xué)決定水平Xc,計算待驗證的檢測系統(tǒng)(Y)與參考檢測系統(tǒng)(X)之間的相對偏差(SE%)。如r＜0.975,則使用配對t檢驗對測定結(jié)果進行分析,并計算出待驗證的檢測系統(tǒng)與參考檢測系統(tǒng)均值的相對偏倚。相對偏倚可接受性判斷參照衛(wèi)生部臨床檢驗中心公布的HbAlc室間質(zhì)量評估的允許誤差,允許偏倚根據(jù)公式:(Xc×允許誤差)/2計算,Xc為HbA1c的醫(yī)學(xué)決定水平,預(yù)期偏倚計算公式:a+(b-1)Xc。計算比對系統(tǒng)(Y)與參考系統(tǒng)(X)之間的相對偏差(SE%)。如果預(yù)期偏倚小于允許偏倚則為可接受,否則為不可接受[4]。

1.2.3 不精密度測定 檢測系統(tǒng)一和二均使用伯樂公司提供的高低兩個水平的質(zhì)控品,檢測系統(tǒng)三Afinion AS100分析儀只適用挪威Axis-Shield公司提供的專用高低兩個水平質(zhì)控品,每批每個濃度雙份測定,相隔2 h以上,每天2次,連續(xù)測定20天,檢測其批內(nèi)不精密度和批間不精密度。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 統(tǒng)計學(xué)分析采用Microsoft Excel 2007,SPSS 13.0統(tǒng)計軟件?；貧w分析采用Passing-Bablok回歸,回歸線性檢測采用Cusum方法檢測,P＜0.05表示線性回歸偏倚有統(tǒng)計學(xué)意義。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān),P＜0.05表示相關(guān)具有統(tǒng)計學(xué)意義。偏倚分析采用Bland-Altman方法。

2 結(jié)果

2.1 三種檢測系統(tǒng)測定糖化血紅蛋白相關(guān)性和相對偏倚分析結(jié)果 對三種檢測系統(tǒng)測定64例血液樣本HbA1c的數(shù)據(jù)經(jīng)方法內(nèi)離群點的檢驗及方法間配對結(jié)果離群點的檢驗,均未發(fā)現(xiàn)離群點。以D-10 HPLC法測定值(X)為參照,對 Roche免疫法結(jié)果(Y)進行回歸統(tǒng)計得到方程Y=0.9704X+0.3545,r=0.992,P＜0.01;對Afinion親和色譜法測定值進行回歸統(tǒng)計得到方程Y=1.032X-0.061,r=0.996,P＜0.01,相關(guān)系數(shù)均大于0.975,P＜0.01,提示Roche免疫法、Afinion親和色譜法與D-10 HPLC法測定結(jié)果具有顯著相關(guān)性,并表明D-10 HPLC法測定值(X)的分布范圍符合要求,可以用b和a作誤差的估計(見圖1、2)。衛(wèi)生部臨床檢驗中心公布的HbA1c室間質(zhì)量評估允許誤差為總體均值±20%,根據(jù)允許偏倚公式:(Xc×允許誤差)/2計算,Xc為HbA1c檢測試驗的醫(yī)學(xué)決定水平,因此,HbA1c檢測的允許偏倚為(6.2%×±20%)/2=±0.62%,依據(jù)預(yù)期偏倚計算公式:a+(b-1)Xc,Roche免疫法和Afinion親和色譜法測定結(jié)果預(yù)期偏倚絕對值分別為0.17%和0.13%,均小于允許偏倚0.62%。

2.2 不精密度測定結(jié)果 三種檢測系統(tǒng)分別測定高低兩個水平的質(zhì)控品每批每個濃度雙份測定,D-10 HPLC法和Afinion親和色譜法平均總CV分別為2.0%、1.6%和1.7%、1.3%;Roche免疫法測定HbA1c總CV%分別為4.1%和3.7%,約為另外兩個檢測系統(tǒng)CV%的1倍以上,三種檢測系統(tǒng)平均批內(nèi)、批間和總CV%見表1。

圖1 Roche免疫法與D-10 HPLC法線性分析

表1 三種檢測系統(tǒng)測定HbA1c(%)的變異系數(shù)

圖2 Afinion親和色譜法與D-10 HPLC法線性分析

3 討論

糖化血紅蛋白的測定方法有幾十種之多,這些檢測方法基本上可分為兩大類:一類是基于糖化血紅蛋白與血紅蛋白電荷不同,如離子交換層析法、電泳法;另一類是基于血紅蛋白上糖化基團的結(jié)構(gòu)特點,如親和層析法、免疫法、離子捕獲法和酶法等[2]。各種方法和檢測設(shè)備測定HbA1c結(jié)果的準確度、精密度都有所差異,而實現(xiàn)同一檢驗項目在不同檢測系統(tǒng)之間測定結(jié)果的可比性是臨床實驗室質(zhì)量管理的最終目標。國際臨床化學(xué)與檢驗學(xué)聯(lián)合會(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine,IFCC)于1995年成立了糖化血紅蛋白標準化工作組,經(jīng)過多年研究探索,研發(fā)了糖化血紅蛋白的參考物質(zhì)和參考測定方法[5-6],極大地促進了HbA1c測定的標準化進程。

方法學(xué)比對試驗是實現(xiàn)測量結(jié)果準確度溯源和患者標本檢驗結(jié)果可比性的重要途徑。本研究參照EP9-A2文件,對三種檢測系統(tǒng)測定HbAlc結(jié)果進行比對和偏倚評估。本實驗結(jié)果表明,三個檢測系統(tǒng)測定HbAlc的不精密度均符合美國國家糖化血紅蛋白標準化項目(NGSP)確定的小于5%的要求。實驗方法與參考方法的比對結(jié)果可以接受,則可認為實驗方法的準確度可以溯源,不同檢測系統(tǒng)的檢驗結(jié)果具有可比性。實驗檢測系統(tǒng)與參考檢測系統(tǒng)之間的相對偏倚低于允許偏倚,因此實驗檢測系統(tǒng)測定HbAlc結(jié)果是可靠的,不需要重新校準。

Bio-Rad D-10全自動糖化血紅蛋白儀和Afinion AS100分析儀分別使用使用HPLC法及親和色譜法全自動測定HbA1c,結(jié)果不易受到人為因素影響,在臨床應(yīng)用過程中應(yīng)按照儀器使用手冊的指導(dǎo)加強維護保養(yǎng)并定期校準。應(yīng)用免疫學(xué)方法在生化分析儀上測定HbA1c,需要手工吸取血樣本與溶血素混合,徹底破壞紅細胞后上機測定,易引入人為因素誤差來源。本實驗表明,免疫法較HPLC法或親和色譜法總不精密度高出1倍以上,免疫法測定結(jié)果應(yīng)定期與HPLC法或親和色譜法進行比對。如果使用免疫法檢測糖化血紅蛋白,應(yīng)采用多點定標方式,密切關(guān)注室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果的變化,確保在試劑的開瓶有效期內(nèi)使用。如果采用非配套的儀器、試劑和校準品等則應(yīng)按照CLSI標準化文件要求作自建檢測系統(tǒng)的性能驗證,以確保檢驗結(jié)果的準確可靠以及與其他實驗室、其他檢測系統(tǒng)之間結(jié)果報告的一致性。

[1]International Expert Committee.International Expert Committee reporton the role of the HbA1c assay in the diagnosis of diabetes[J].Diabetes Care,2009,32:1327.

[2]王冬環(huán),張傳寶,陳文祥,等.應(yīng)重視糖化血紅蛋白測定技術(shù)及其量值溯源[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志,2008,31:965-968.

[3]Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI).Method comparison and bias estimation using patient samples[S].ApprovedGuideline-second edition.Document EP9-A2[S].Wayne,PA.2003.

[4]李義龍,單戰(zhàn)海,韓 冰,等.酶法糖化血紅蛋白試劑盒方法學(xué)比對評價[J].中國實驗診斷學(xué),2010,14(8):1336.

[5]Jeppsson JO,Kobold U,BarrJ,et al.Approved IFCC reference method for the measurement of HbAlc in human blood[J].Clin Chem Lab Med,2002,40(1):78.

[6]Hoelml W,Weykemp C,Jeppmon JO,et al.IFCC reference system for hemoglobin Alc in human blood and the national standardization schemes In the United States,Japan,and Sweden:method-comparison study[J].Clin Chem,2004,50(1):166.