尾加壓素Ⅱ促NRK-49F細胞增殖及ECM分泌作用

張 丹,李希寧,孫 波

(1.長春市中心醫(yī)院心內(nèi)科,吉林 長春130051;2.吉林大學藥學院)

尾加壓素Ⅱ(urotensinⅡ,UⅡ)是一種進化上高度保守的生長抑素樣環(huán)肽,最早從硬骨魚脊髓尾部下垂體中分離而來,其分布具有種屬普遍性。Matsushita等[1]研究發(fā)現(xiàn)腎臟富含UⅡmRNA,現(xiàn)已證明,UⅡ?qū)δI臟來說是一個自分泌或旁分泌的生長因子[2],可能與人類腎臟系統(tǒng)及其疾病的病理生理學有關(guān)。本研究通過體外培養(yǎng)大鼠腎臟成纖維細胞株NRK-49F,觀察不同濃度UⅡ?qū)Υ笫竽I成纖維細胞增殖及細胞外基質(zhì)的影響,并且通過預先加入UⅡ抗體、尼莫地平和EDTA,觀察其對UⅡ誘導NRK-49F細胞Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原mRNA表達的影響,旨在探討UⅡ在腎間質(zhì)纖維化中可能發(fā)生的作用。

1 材料和方法

1.1 細胞來源 大鼠腎臟成纖維細胞株NRK-49F細胞購自中國科學院上海生科院細胞資源中心,以含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑 UⅡ(Sigma),逆轉(zhuǎn)錄酶SuperScriptⅡ(Invitrogen),TaqDNA聚合酶(北京天根生物技術(shù)公司),山羊抗大鼠UⅡ多克隆抗體、兔抗大鼠Ⅰ型膠原(collagen Ⅰ,colⅠ)、Ⅲ型膠原(collagen Ⅲ,colⅢ)及纖連蛋白(fibronectin,FN)多克隆抗體(美國Santa Cruz公司),其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 MTT法檢測不同濃度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol?L-1)對NRK-49F 細胞增殖的影響。

1.4 ELISA法檢測不同濃度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol?L-1)對NRK-49F 各組培養(yǎng)上清colⅠ、colⅢ及FN含量的影響。

1.5 RT-PCR法檢測各組培養(yǎng)細胞colⅠ、colⅢ及FN mRNA表達 根據(jù)加入條件培養(yǎng)基不同將細胞分為5組,對照組(常規(guī)培養(yǎng))、UⅡ組(用含10-8UⅡmol?L-1培養(yǎng)液培養(yǎng));U Ⅱ抗體組(用 10-5mol?L-1UⅡ抗體培養(yǎng)液預處理60 min后,換含UⅡ10-8mol?L-1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng))、尼莫地平組(以10-5mol?L-1尼莫地平預處理5 min后,換含UⅡ10-8mol?L-1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng));EDTA 組(用2×10-3mol?L-1EDTA預處理30 min后,換含UⅡ10-8mol?L-1培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng))。引 物序 列 如下:GAPDH上游 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′,擴增片段長 450 bp;ColⅠ :上游 5′-GCCACCTCAAGAGAAGTC-3′, 下 游 5′-ATAGCGACATCGGCAGGATC-3′,擴增片段長度為 441 bp;ColⅢ 上 游 5′-ATGGTGGCTTTCAGTTCAG-3′,下 游 5′-CAATGTCATAGGGTGCGATA-3′,擴增產(chǎn)物長 351 bp;FN 下游 5′-AAGGACCACAGGAGCAG T-3′,下 游 5′-CCTTTCTGAGCAGCAACC-3′,擴增片段長411 bp。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析 所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進行單因素方差分析(one way ANOVA)進行比較,組間兩兩比較采用最小顯著差(least significant difference,LSD)法。

2 結(jié)果

2.1 UⅡ?qū)RK-49F細胞增殖的影響 含不同濃度UⅡ(1×10-10,1×10-9,1×10-8,1×10-7mol?L-1)培養(yǎng)基作用NRK-49F 24 h后,MTT結(jié)果可見,與對照組比較,不同濃度UⅡ刺激組A值均明顯增加,且當 UⅡ濃度為1×10-10、1×10-9和 1×10-8mol?L-1時,A值隨著UⅡ濃度增加而增加,當UⅡ濃度為1×10-8mol?L-1時 ,A 值最大,見表1。

表1 不同濃度UⅡ?qū)RK-49F增殖能力的影響

2.2 UⅡ?qū)RK-49F分泌colⅠ 、colⅢ 及FN能力的影響 ELISA法檢測各組培養(yǎng)上清colⅠ、colⅢ及FN結(jié)果見表 2。10-9及 10-8mol?L-1UⅡ組 colⅠ、colⅢ 及FN含量均明顯增加,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(*P＜0.05,**P＜0.01)。10-7mol?L-1UⅡ組上述三者含量與對照組比較,未見統(tǒng)計學意義。

表2 UⅡ?qū)RK-49F分泌colⅠ、colⅢ 及FN能力的影響

2.3 UⅡ?qū)RK-49F colⅠ、colⅢ 及 FN mRNA表達影響 與正常對照組比較,10-8mol?L-1UⅡ組colⅠ、colⅢ 及FN mRNA表達量明增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);與10-8mol?L-1UⅡ組比較,UⅡ抗體組上述三者mRNA表達量明均明顯降低(P＜0.01)。尼莫地平組和 EDTA組colⅠ、colⅢ mRNA表達量明顯低于10-8mol?L-1UⅡ組,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),但FN mRNA表達量與10-8mol?L-1UⅡ組比較差異未見顯著性,見圖1。

3 討論

圖1 UⅡ?qū)RK-49F colⅠ 、colⅢ及FN mRNA表達影響

研究發(fā)現(xiàn),除血流動力學效應(yīng)外,UⅡ還是體內(nèi)重要的促有絲分裂原,能夠促進血管平滑肌細胞、心臟成纖維細胞及氣道平滑肌細胞等多種細胞增殖[3]。新生大鼠離體心肌研究表明,UⅡ可呈劑量依賴性促進心肌纖維化,推測其在心肌肥大及纖維化過程中起調(diào)控作用[4]。UⅡ在腎臟中的高表達提示其在腎臟具有特殊功能,可能與腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。本研究從其刺激腎間質(zhì)成纖維細胞增殖及細胞外基質(zhì)(Extracellar matrix,ECM)分泌的角度進行探討,結(jié)果表明,一定濃度范圍內(nèi)(1×10-10,1×10-9,1×10-8mol?L-1),UⅡ可呈劑量依賴性刺激NRK-49F的增殖,并刺激其分泌colⅠ、colⅢ 及FN等ECM成分,本研究中,當UⅡ濃度達到1×10-7mol?L-1時,盡管其仍表現(xiàn)出明顯的刺激NRK-49F增殖能力,但培養(yǎng)細胞的ECM分泌能力未見明顯增加。

為探討UⅡ刺激腎臟成纖維細胞增殖及分泌ECM機制,本研究用＜去(NRK-49F)＞尼莫地平及EDTA對 1×10-8mol?L-1UⅡ刺激 NRK-49F合成ECM作用進行干預,結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼莫地平及EDTA均可明顯降低NRK-49F colⅠ、colⅢ 及FN mRNA的表達。尼莫地平屬雙氫吡啶類鈣拮抗劑,可阻斷細胞膜上的鈣離子通道,從而抑制細胞外鈣離子內(nèi)流,使細胞內(nèi)鈣離子水平降低,EDTA是一種重要的Ca2+絡(luò)合劑,可使細胞外Ca2+濃度降低,二者均可使細胞外Ca2+內(nèi)流減少。有研究發(fā)現(xiàn),UⅡ可促進腎小管上皮細胞(NRK52E)的增殖,其機制與其刺激細胞質(zhì)Ca2+濃度升高密切相關(guān),尼莫地平及EDTA可顯著抑制此效應(yīng)[5]。Iglewski等發(fā)現(xiàn),UⅡ與其受體結(jié)合,可激活第二信使三磷酸肌醇(inositol triphosphate,I P3)及二酯酰甘油(diacylglycerol,DG),并導致血管平滑肌細胞內(nèi)Ca2+增加,Ca2+內(nèi)流增加導致Ca2+依賴的激酶(Ca2+-dependent kinases,CaMK)活性增加,從而引起細胞增殖[6]。這些研究結(jié)果提示UⅡ的促絲裂原效應(yīng)通過Ca2+來介導。但有關(guān)UⅡ刺激細胞合成和分泌ECM的研究尚未見報道。本研究中,尼莫地平和EDTA均可明顯抑制UⅡ介導的NRK-49F colⅠ、colⅢ mRNA高表達,即抑制腎臟成纖維細細胞的ECM合成能力,表明UⅡ的促腎間質(zhì)纖維化的作用也可能與Ca2+介導的信號通路有關(guān)。

綜上所述,可以推測UⅡ通過與G蛋白耦聯(lián)受體相結(jié)合,促進細胞外鈣內(nèi)流及細胞內(nèi)鈣貯釋放,使細胞質(zhì)Ca2+增加,并激活多種信號轉(zhuǎn)導途徑,激活初始應(yīng)答基因,表達轉(zhuǎn)錄因子,從而引起細胞增殖及ECM的過度表達,因此,UⅡ可能成為抑制腎間質(zhì)纖維化治療的一個新靶標,當然其具體機制尚需進行更深入探討。

[1]Matsushita M,Shichiri M,Imai T,et al.Co-expression of urotensinⅡand its receptor(GPR14)in human cardiovascular and renal tissues[J].Hypertens,2001,19(12):2185.

[2]Matsushita M,Shichiri M,Fukai N,et al.urotensinⅡis an autocrine/paracrine growth factor for the porcine renal epithelial cell line,LLCPK1[J].Endocrinology,2003,144(5):1825.

[3]張勇剛,陳亞紅,馬春艷,等.尾加壓素的促絲裂作用[J].中國動脈硬化雜志,2001,9(1):14.

[4]Tzanidis A,Hannan RD,Thomas WG,et al.Direct action of urotensinⅡon the heart:implications for cardiac fibrosis and hypertrophy[J].Circres,2003,93(4):246.

[5]Tian L,Li C,Qi J,et al.Diabetes-induced upregulation of urotensin II and its receptor plays an important role in TGF-beta1-mediated renal fibrosis and dysfunction[J].Am J Physiol Endocrinol Metab,2008,295(5):E1234.

[6]Iglewski M,Grant RS.Urotensin II-induced signaling involved in proliferation of vascular smooth muscle cells[J].Vasc Health Risk Manag,2010,6:723.