乳酸對(duì)外周血吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能影響的離體實(shí)驗(yàn)研究

董靜梅,陳佩杰,王 茹,于動(dòng)震,張亞軍,肖衛(wèi)華

乳酸對(duì)外周血吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能影響的離體實(shí)驗(yàn)研究

董靜梅1,2,陳佩杰1,王 茹1,于動(dòng)震1,張亞軍1,肖衛(wèi)華1

運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激可引起體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的變化,包括溫度,酸度、氧分壓、電解質(zhì)及其激素水平的變化,而內(nèi)環(huán)境的變化必然會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng),進(jìn)而影響到機(jī)體的一系列生理功能的改變,如機(jī)體免疫功能的變化,有大量的研究報(bào)道表明,運(yùn)動(dòng)可引起吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能的改變[7,11,13]。這些研究往往基于某些運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目的特異性和處于對(duì)機(jī)體不損傷的保護(hù)性考慮,難以對(duì)引起該功能變化的直接原因做出準(zhǔn)確直接地判斷和測(cè)定,其研究通常設(shè)計(jì)不同的運(yùn)動(dòng)類型訓(xùn)練模型,通過訓(xùn)練前后某種功能的改變和相應(yīng)指標(biāo)的變化來確定某種運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目對(duì)免疫功能的影響,而就其運(yùn)動(dòng)對(duì)免疫功能改變的直接原因和機(jī)理難以做出判斷,針對(duì)此問題,本實(shí)驗(yàn)針對(duì)運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境乳酸堆積引起的胞外酸性環(huán)境的變化,設(shè)計(jì)乳酸處理來改變離體外周血酸度并進(jìn)行全血孵育,利用流式儀和德國臨床吞噬功能測(cè)定試劑盒,準(zhǔn)確快速地測(cè)定外周血中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear neutrophil;PMN)和單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和吞噬功能,利用免疫細(xì)胞化學(xué)與共聚焦技術(shù)的合并使用,進(jìn)行NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基的蛋白定位,探討運(yùn)動(dòng)引起吞噬細(xì)胞功能改變的內(nèi)環(huán)境改變的直接因素,為運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)免疫功能改變的研究提供一定的理論。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

試劑:二聯(lián)苯碘(Diphenylene iodonium,DPI)、乳酸(DL-Lacticacid,La)、二甲亞砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)、DAPI染色液、胎牛血清 、RPMI-1640培養(yǎng)基均購自美國 SIGMA公司;氮藍(lán)四唑(NBT)、臺(tái)盼藍(lán)染液(rypan Blue Stain)購自美國 GIBCO公司;多型核細(xì)胞分離液(PolymorphprepTM)購自挪威 AXIS-SHIELD公司。抗體:gp91-phox(H-60)、P47-phox(c-20)購自美國 Sant cruz公司;CYTM5 Confugate山羊抗兔、FITC兔抗山羊(H+L)購自美國ZYMED公司。

試劑盒:呼吸爆發(fā)試劑盒(Burst-test kit)、吞噬功能試劑盒(Phago-test kit)均購自德國 Glycotope Biotechnology公司。

儀器:流式細(xì)胞儀(美國BeckmanCoulter公司)、便攜式運(yùn)動(dòng)血乳酸鹽儀(美國金泉 YSI公司)、熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、激光共聚焦顯微鏡(LSCM,德國蔡司公司)、酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸的體積的量與血乳酸值回歸方程的建立

取20名健康男性青年志愿者(年齡19～23歲)外周靜脈血10 ml(肝素抗凝),分成均等的10組(每組1 ml),每組加入1 M乳酸(表1)混勻,取5μl與乳酸鹽儀測(cè)定其乳酸值,并建立加入體積的量與血液乳酸測(cè)定值的回歸方程,需要說明的是,在預(yù)備試驗(yàn)中進(jìn)行了所用乳酸濃度梯度試驗(yàn),觀察不同濃度的乳酸對(duì)中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和吞噬功能的適應(yīng)試驗(yàn)濃度區(qū)間。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

回歸方程建立后,另取10名健康男性青年志愿者(年齡19～23歲)外周靜脈血 20ml(肝素抗凝)分 2組(Ctr組、E組),各組再均分10小組(每小組取1 ml全血分為 C0、C1、C2…C9及 E0、E2、E3…E9)。其中 E組按表1的量加入濃度為1 M乳酸,同時(shí)給Ctr組中每小組在加入同 E組等量的乳酸時(shí)再加入終濃度為2μMDPI(DPI濃度參考 Helmy[8])作為對(duì)照組后,2組同時(shí)在37℃水浴箱中孵育10 min后,分別去100μl全血用流式細(xì)胞儀測(cè)定呼吸爆發(fā)和吞噬功能的測(cè)定,剩余部分血液用于分離中性粒細(xì)胞的分離。

1.2.3 呼吸爆發(fā)與吞噬功能的測(cè)定

各取100μl全血于專用流式管中,分別按呼吸爆發(fā)與吞噬測(cè)定試劑盒各步驟加入刺激劑和裂解紅細(xì)胞制備樣液,由于萃取時(shí)間和溫度對(duì)結(jié)果影響,所以,要特別注意各步驟時(shí)間和溫度的精準(zhǔn)度。激發(fā)波長488 nm,每樣取50 000個(gè)中性粒細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),利用熒光強(qiáng)度來表示呼吸爆發(fā)與吞噬功能的變化,全血流式測(cè)定方法參考Lyapina M(2004)[12]。

1.2.4 中性粒細(xì)胞的分離

按多型核細(xì)胞分離液說明取分離液1 ml與離心管中,將血液小心鋪與分離液液面上后離心(450 g,35 min,18℃～22℃),取中性粒細(xì)胞后用0.45%NaCl低滲液洗2次,用 PBS洗1次后加入0.4%胎盼藍(lán)染色計(jì)數(shù),調(diào)細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/L,活細(xì)胞數(shù)不低于96%后懸浮于預(yù)冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。

1.2.5 NADPH氧化酶活性的測(cè)定

每組取5×106個(gè)細(xì)胞懸浮于 NBT溶液中(4 mg/ml),37℃水浴鍋中保濕孵育 20 min,加入 1 M HCl終止反應(yīng) ,離心(2 500 rpm、5 min、18℃～22℃)后加入400μl的DMSO穩(wěn)定形成三苯基甲酯,移入酶標(biāo)板在560 nm處測(cè)定吸光度(OD),OD值越大表明NADPH氧化酶活性越高。

作者單位:1.上海體育學(xué)院,上海200438;2.蘭州城市學(xué)院體育學(xué)院,甘肅 蘭州 730070

表1 各小組分組標(biāo)號(hào)與加入乳酸的體積量一覽表Table 1 The Volume of LA in Different G roup (μl)

1.2.6 激光共聚焦對(duì)NADPH氧化酶亞基p47-phox的定位

取分離好的中性粒細(xì)胞200μl(細(xì)胞濃度1×104個(gè)/L)加入1%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min,之后用 TritonX-100和胎羊血清改變細(xì)胞通透性,再依次封閉,加一抗,二抗。最后爬片,在激光共聚焦顯微鏡觀察染色定位結(jié)果,其中共聚焦顯微鏡物鏡放大倍數(shù)為×200。激發(fā)波長488 nm,發(fā)散波長510 nm。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 加入不同體積的乳酸測(cè)得的血乳酸的值及回歸方程

根據(jù)表1測(cè)得的乳酸值可得出在1 ml外周血中加入的乳酸的體積的量與血乳酸值回歸方程為:Y=0.0652X+3.5528(R2=0.9904)。

2.2 吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和吞噬功能

2.2.1 吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能的流式細(xì)胞測(cè)定

按試劑盒制備流式細(xì)胞檢測(cè)樣品,每樣鎖定5 000白細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),利用熒光強(qiáng)度來表示呼吸爆發(fā)與吞噬功能的變化,其流式圖見圖1。

表2 各小組加入乳酸的體積量對(duì)應(yīng)測(cè)定的乳酸值一覽表Table 2 The Volume of LA and Value of LA in Different G roup

圖1 流式細(xì)胞儀測(cè)定吞噬細(xì)胞的熒光強(qiáng)度示圖與細(xì)胞選取示意圖Figure 1 The Fluorescence Intensity and Cell in Flow Cytoneter

2.2.2 流式細(xì)胞儀測(cè)試不同酸度梯度對(duì)全血中中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與吞噬功能的變化

圖2表示,在每小組加入不同的酸度梯度時(shí),全血中中性粒細(xì)胞爆發(fā)功能在最初的幾個(gè)濃度梯度略有降低,根據(jù)前期的回歸關(guān)系,可以對(duì)應(yīng)的計(jì)算出在血液中乳酸濃度低于4.81 mmol/L時(shí),而后則隨著乳酸濃度梯度的增加,中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)功能則明顯升高,但當(dāng)血乳酸濃度達(dá)到8.14 mmol/L時(shí),呼吸爆發(fā)功能卻明顯下降,出現(xiàn)急劇下降的拐點(diǎn)。

圖2 不同濃度的乳酸梯度下對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的變化曲線圖Figure 2 The Change of Respiattory Burst of Neutrophil with Different LA and the Inhibition of DPI in Whole Blood

圖3 不同濃度的乳酸梯度下對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞吞噬功能的變化曲線圖Figure 3 The Change of Phagocytosis Function of Neutrophil with Defferent LA and the Inhibiion of DPI in Whole Blood

圖3表示,在不同的濃度梯度時(shí)全血中性粒細(xì)胞的吞噬功能,可以發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞的吞噬功能與呼吸爆發(fā)功能的變化趨勢(shì)呈大致相似的變化,但其急劇下降的拐點(diǎn)的乳酸濃度要低于呼吸爆發(fā)的拐點(diǎn)7.69 mmol/L。圖2、圖3的對(duì)照組的呼吸爆發(fā)和吞噬功能雖有所變化,但與 E組相比,都低于同濃度乳酸的 E組的變化。

2.3 不同酸度梯度的乳酸處理對(duì)外周血單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與吞噬功能的影響

圖4、圖5表明,不同梯度的乳酸濃度對(duì)全血單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和呼吸功能與中性粒細(xì)胞的影響基本相似,即低濃度的乳酸抑制了單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與吞噬功能的爆發(fā),之后隨著乳酸濃度的增加,其呼吸爆發(fā)和吞噬功能相應(yīng)增加,但其呼吸爆發(fā)和吞噬功能分別在8.14 mmol/L、7.69 mmol/L時(shí)出現(xiàn)急劇下降的趨勢(shì)。同時(shí)與 E組相比,對(duì)照組的單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)和吞噬功能雖有所變化,但低于同濃度乳酸的E組的變化。

圖4 不同乳酸濃度梯度下對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)的變化曲線圖Figure 4 The Change of Respiratory Burst of Monocyte with Different LA and the Inhibition of DPI in Whole Blood

圖5 不同乳酸濃度梯度下對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組單核細(xì)胞吞噬功能的變化曲線圖Figure 5 The Change of Phagocytosis Function of Monocyte with Different LA and the Inhibition of DPI in Whole Blood

2.4 酸度變化對(duì)中性粒細(xì)胞中NADPH氧化酶活性的測(cè)定

根據(jù)NADPH氧化酶活性測(cè)定方法,通過分離提純的中性粒細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶,采用分光光度法測(cè)得吸光度(OD)值如圖6,OD值越高說明其NADPH氧化酶的活性越高。其NADPH氧化酶活性的變化也和中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與吞噬功能的變化趨勢(shì)吻合。

圖6 不同乳酸濃度梯度下對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組NADPH氧化酶活性的變化曲線圖Figure 6 The Value of OD for NADPH Oxidase in Neutrophil from Blood with the Different LA

2.5 吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與NADPH氧化酶活性的相關(guān)性測(cè)定

從圖2、圖4的中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)隨血乳酸濃度變化的曲線與圖6反映NADPH氧化酶活性的OD值,隨乳酸濃度變化的曲線不難看出其變化的相關(guān)性,為此我們做了不同乳酸濃度處理后中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)的變化與NADPH氧化酶活性變化的相關(guān)性研究,圖8表示不同乳酸濃度處理后單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與NADPH氧化酶活性的相關(guān)性。

圖7、圖8分別是不同乳酸濃度處理后,中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能與NADPH氧化酶活性關(guān)系的研究,其中圖7、圖8所示在不同濃度的乳酸處理后中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能與NADPH氧化酶活性呈線性相關(guān),其相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到0.89和0.73。說明吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與NADPH氧化酶活性具有一定的相關(guān)性,且中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能與NADPH氧化酶的活性的相關(guān)程度要高于單核細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能。

圖7 不同乳酸濃度處理后中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與NADPH氧化酶活性的相關(guān)性示意圖Figure 7 The Correlation of between the Activity of NADPH Oxidase and the Function of Respiatory Burst in Neutrophil with Different LA treatment

圖8 不同乳酸濃度處理后單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與NADPH氧化酶活性的相關(guān)性示意圖Figure 8 The Crooelation of between the Activity of NADPH Oxidase and the Function of Respiatory Burst in Monocytes after Different LA Treatment

2.6 NADPH氧化酶激活的蛋白定位的細(xì)胞免疫化學(xué)的共聚焦實(shí)驗(yàn)

通過流式細(xì)胞儀對(duì)吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和吞噬功能的檢測(cè)和NADPH氧化酶的活性測(cè)定,我們發(fā)現(xiàn)不管是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞,其呼吸爆發(fā)的最高點(diǎn)和最大NADPH氧化酶活性點(diǎn)的乳酸處理濃度相同,即同在血乳酸濃度為7.69 mmol/L時(shí)NADPH氧化酶活性與呼吸爆發(fā)功能上調(diào)至最高點(diǎn),于是,我們?cè)诖藵舛葘?duì)2組的外周血孵育30 min后分別分離中性粒細(xì)胞,利用免疫細(xì)胞化學(xué)方法分別對(duì)中性粒細(xì)胞核染色和NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox與p47phox熒光染色的共定位,圖9為對(duì)照組,圖10為乳酸處理組,其中,A圖為DAPI染色的藍(lán)色細(xì)胞核顯色、B圖胞漿中p47phox綠色顯色、C圖為胞膜中的gp91phox紅色顯色、D圖為融合后為gp91phox與p47phox蛋白共定位顯色。從乳酸處理后的圖10的D圖中可以看出,出現(xiàn)了gp91phox與p47phox蛋白共定位黃色顯色。而圖9的D圖中未出現(xiàn)gp91phox與p47phox蛋白共定位黃色顯色。

圖9 對(duì)照組中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91-phox與p47-phox未定位示圖(×200)

3 分析與討論

3.1 外周血吞噬細(xì)胞的吞噬作用與NADPH氧化酶的活性調(diào)控

外周血中由中性粒細(xì)胞與單核細(xì)胞組成的吞噬細(xì)胞是機(jī)體重要的天然免疫細(xì)胞,其殺滅入侵病原微生物的方式是通過NADPH氧化酶介導(dǎo)“氧化爆發(fā)”產(chǎn)生大量活性氧(ROS,reactive oxygen species)而構(gòu)成機(jī)體抵抗病原體的第一道防線,此過程也被稱為 PMN的呼吸爆發(fā),并認(rèn)為是吞噬細(xì)胞能夠進(jìn)行宿主防御的主要機(jī)制,是機(jī)體進(jìn)行非特異性細(xì)胞免疫的主要途徑[14]。其中的NADPH氧化酶現(xiàn)已證明是細(xì)胞質(zhì)膜上主要的 ROS來源途徑,數(shù)年后,在非吞噬細(xì)胞的質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)了NADPH氧化酶的同源物家族,即gp91phox的同源物,分別稱其為 NOX1,NOX2,NOX3,NOX4,NOX5,DUOX1,DUOX2,后來被命名為NOX的蛋白家族[1]。人吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶是由質(zhì)膜結(jié)合成分gp91phox,p22phox,小 GTP酶結(jié)合蛋白 Rap1A,胞漿成分p47phox,p67phox,p40phox,小GTP酶結(jié)合蛋 Rac2,Cdc42,以及最新鑒定的p29peroxiredoxin組裝成的一種高度調(diào)節(jié)的多亞基氧化酶復(fù)合體。

圖10 實(shí)驗(yàn)組中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox與p47phox共定位示圖(×200)

當(dāng)細(xì)胞受到胞內(nèi)外環(huán)境的刺激后,胞漿內(nèi)的p47phox磷酸化并與p67phox和Rac1/Rac2一起移位到質(zhì)膜,與細(xì)胞色素b558結(jié)合,參與NADPH氧化酶的活化?；罨蟮腘ADPH氧化酶以NADPH為遞氫體,催化反應(yīng):NADPH+2O2→NADP++H++2O-2,O-2在超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)催化下生成過氧化氫(H2O2)。在中性粒細(xì)胞的嗜天青顆粒中存在著髓過氧化物酶(MPO),在有氯化物存在的條件下,該酶可將 H2O2還原生成次氯酸 HOCL·,HOCL·是強(qiáng)氧化劑和殺菌因子[10]。因此,吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)主要是通過NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS來實(shí)施對(duì)入侵病原微生物的吞噬作用。

現(xiàn)已證明,多種因素可激活NADPH氧化酶亞基,引起亞基磷酸化、轉(zhuǎn)位,完成復(fù)合體的組裝,涉及多種蛋白的相互作用和多種激酶、磷酸酶、脂肪酶的信號(hào)通路,其中每一細(xì)小環(huán)節(jié)對(duì)于NADPH氧化酶發(fā)揮正常功能都很重要,吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶是受調(diào)節(jié)亞基、上游調(diào)節(jié)子等多重因素的調(diào)控下活化發(fā)生呼吸爆發(fā),實(shí)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在天然免疫系統(tǒng)中的殺菌行為和清除外源異物的重要功能[3]。

運(yùn)動(dòng)作為一種應(yīng)激,可引起體內(nèi)環(huán)境的變化,在運(yùn)動(dòng)應(yīng)激狀態(tài)下如胞外低氧、高溫、高糖,胞質(zhì)中高 H2O2和炎癥性細(xì)胞因子白介素-1(IL-1)、和白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子(TNF-a)都可能成為激活NADPH氧化酶產(chǎn)生ROS的激發(fā)因子,其中,胞質(zhì)缺氧和乳酸堆積引起的酸性環(huán)境是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練尤其是過度運(yùn)動(dòng)時(shí)由于乳酸的生成最可能形成的細(xì)胞外環(huán)境[5],因此,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以乳酸引起血液的酸度變化,離體研究不同酸度對(duì)吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能的影響。

3.2 乳酸引起的血液酸度變化對(duì)吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能的影響

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表示不同濃度的乳酸處理后的吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)功能和吞噬功能均發(fā)生一定的變化,其變化的共同特點(diǎn)是:外周血中低濃度(低于4.81 mmol/L)的乳酸處理可抑制中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與吞噬功能,較高濃度的乳酸處理后吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和吞噬功能發(fā)生了不同步的變化,其中當(dāng)乳酸濃度為4.81 mmol/L～8.41 mmol/L之間處理后吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)隨著乳酸濃度的增加而提高,之后急劇下降,而吞噬功能則在乳酸濃度4.81 mmol/L～7.69 mmol/L處理后隨著乳酸濃度的增加而提高,但較呼吸爆發(fā)提前一個(gè)濃度梯度而急劇下降。

3.3 外周血乳酸引起的酸度變化對(duì)中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶激活的直接證據(jù)

NADPH氧化酶活化后胞漿亞基p47phox,p67phox和p40phox轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜與Cyto b558復(fù)合體結(jié)合,本實(shí)驗(yàn)在血乳酸濃度為7.69 mmol/L時(shí),NADPH氧化酶的胞漿中的亞基p47phox移位至胞膜與gp91phox實(shí)現(xiàn)共定位,這是激活NADPH氧化酶的直接證據(jù)[17],而NADPH氧化酶的激活可介導(dǎo)產(chǎn)生大量的ROS是中性粒細(xì)胞產(chǎn)生呼吸爆發(fā)的一個(gè)顯著特點(diǎn),中性粒細(xì)胞正是通過其呼吸爆發(fā)產(chǎn)生ROS來實(shí)施吞噬功能的[4]。外周血酸度的變化可引起中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶的激活并導(dǎo)致其呼吸爆發(fā)與吞噬功能的改變,從而影響其吞噬功能。

3.4 不同梯度的乳酸濃度引起外周血吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能變化的原因分析

吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)與吞噬功能的改變?cè)诤艽蟪潭壬先Q于細(xì)胞外的pH的變化及NADPH氧化酶的活性,而胞外pH變化影響PMN呼吸爆發(fā)有賴于離子交換系統(tǒng)的激活,其中一個(gè)主要的離子交換系統(tǒng)是膜上的Na+/H+ATP酶。Na+/H+ATP酶是以胞外Na+與胞內(nèi) H+交換,從而將 H+泵出去使 PMN胞內(nèi)維持正常的酸堿平衡。細(xì)胞外酸性環(huán)境抑制了Na+/H+的交換,使細(xì)胞內(nèi)持續(xù)在酸性pH下,不利于O-2的產(chǎn)生[18]。同時(shí),胞外 H+的增加不利胞漿中Ca2+的攝取,而吞噬細(xì)胞胞漿Ca2+在NADPH氧化酶的活化調(diào)控中起著關(guān)鍵的作用,因?yàn)閰⑴cNADPH氧化酶活性調(diào)節(jié)的許多蛋白的活化都是Ca2+依賴的,如蛋白激酶C(Protein kinase C,PKC),促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)和酪氨酸激酶,Ca2+的增多能觸發(fā)氧化酶亞基的磷酸化、轉(zhuǎn)位和組裝必需的許多信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),抑制Ca2+的釋放或內(nèi)流就抑制了氧化酶的活化[9]。

因此,看似胞外酸性環(huán)境抑制了吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā),但在抑制PMN產(chǎn)生O-2的同時(shí),卻能促進(jìn) H2O2的產(chǎn)生和髓過氧化酶(MPO)的釋放[2]。T onetti等(1991年)[19]報(bào)道用短鏈羧酸孵育PMN,胞內(nèi)pH下降,O-2的產(chǎn)生明顯減少,但 H2O2的產(chǎn)生則明顯增加。而 H2O2的產(chǎn)生和MPO的增加卻像扣動(dòng)了NADPH氧化活化的扳機(jī),觸發(fā)了吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶的激活的鎖鏈,H2O2激活膜細(xì)胞中NF-κB,NF-κB又能上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白-1的表達(dá),單核細(xì)胞滲出引起的炎癥反應(yīng),促進(jìn)炎癥性細(xì)胞因子IL-1、和 IL-6和 TNF-a的釋放,擴(kuò)大了炎癥反應(yīng),而炎癥細(xì)胞因子也能激活中性粒細(xì)胞NADPH氧化酶,進(jìn)而擴(kuò)大產(chǎn)生ROS[6].

因此,胞外低濃度的乳酸可輕度抑制中性粒及單核細(xì)胞的呼吸爆發(fā),但隨著乳酸濃度的增多引起的胞外酸性環(huán)境急劇變化,使其產(chǎn)生過多的 H2O2和 MPO,而使 NADPH氧化酶激活鏈的發(fā)生,這樣過多的 ROS產(chǎn)生必將大幅度的上調(diào)了吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā),但NADPH氧化酶介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS對(duì)吞噬細(xì)胞的分泌、分化、增殖和凋亡具有雙向調(diào)節(jié)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用,可雙向調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生物學(xué)功能[16]。

因此,一方面,過多 ROS的產(chǎn)生可誘發(fā)吞噬細(xì)胞的凋亡甚至死亡;另一方面,細(xì)胞外酸性增加必會(huì)引起細(xì)胞的酸中毒而影響其生理功能,因此本實(shí)驗(yàn)中,吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)并不是隨著胞外乳酸濃度的增加而持續(xù)加大,而是當(dāng)胞外乳酸濃度達(dá)到7.69 mmol/L后就急劇下降,而吞噬細(xì)胞的吞噬功能因?yàn)檫^多ROS的產(chǎn)生并不是與呼吸爆發(fā)同步上升,而是較其呼吸爆發(fā)提前至胞外乳酸濃度在6.57 mmol/L時(shí)急劇下降。

4 結(jié)論

1.離體外周血酸度的變化可以通過激活或抑制吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶的活性而影響中性粒細(xì)胞吞噬與呼吸爆發(fā)功能,并隨著外周血酸度的變化,其呼吸爆發(fā)和吞噬功能呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律。

2.伴隨著外周血乳酸濃度的變化中性粒呼吸爆發(fā)于吞噬功能并不是非常同步的發(fā)生變化,表現(xiàn)為低濃度的乳酸濃度時(shí),中性粒細(xì)胞呼吸與吞噬功能同步受到抑制,隨著乳酸濃度的增加,中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和吞噬功能開始上升,但隨著乳酸濃度進(jìn)一步增加,吞噬功能則提前呼吸爆發(fā)出現(xiàn)轉(zhuǎn)折性下降。此正好驗(yàn)證了我們前期提出的假設(shè),既由于中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量的 ROS可能會(huì)影響使機(jī)體的過氧化使其吞噬功能減弱。

3.NADPH氧化酶的活性受多種因素多種因子的調(diào)節(jié),每一細(xì)小環(huán)節(jié)都可能引起其活性的變化而調(diào)控呼吸爆發(fā)及吞噬功能,由于本實(shí)驗(yàn)是采用外周血的離體進(jìn)行,血液自身的緩沖體系無法得以實(shí)施其對(duì)體液各成分的平衡作用.運(yùn)動(dòng)因?yàn)槠溥\(yùn)動(dòng)形式和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的變化而使體內(nèi)環(huán)境呈現(xiàn)多變性,因而對(duì)于胞外乳酸引起的酸度變化對(duì)PMN的呼吸爆發(fā)和吞噬功能具有一定的局限性。要闡明運(yùn)動(dòng)引起的各種環(huán)境因子影響PMN呼吸爆發(fā)的規(guī)律和作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

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Effect of Lactic Acid on the Function Phagocytosis and Respiratory Burst of Phagocytic Cell in Peripheral Blood in Vitro

DONG Jing-mei1,2,CHEN Pei-jie1,WANG Ru1,YU Dong-zhen1,ZHAN G Ya-jun1,XIAO Wei-hua1

目的:探討乳酸引起的酸度變化對(duì)外周全血吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與吞噬功能的影響及發(fā)生機(jī)制。方法:1)取20名健康男性外周靜脈血10 ml,分10份建立乳酸體積量與血乳酸值的回歸方程;2)另取10名健康男性外周靜脈血20 ml分為對(duì)照組(Ctr組)、乳酸處理組(E組),各組再分10小組,按照第一步建立的回歸方程加入不同體積的乳酸,同時(shí)Ctr組給予DPI處理,2組同時(shí)孵育10 min后各小組每份取100μl全血用流式細(xì)胞儀測(cè)定呼吸爆發(fā)和吞噬功能;3)分別取Ctr組、E組第6小組的血液分離中性粒細(xì)胞,利用免疫細(xì)胞化學(xué)與共聚焦技術(shù)進(jìn)行NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基gp91phox與p47phox的共定位實(shí)驗(yàn)。結(jié)果:1)低濃度(低于4.81 mmol/L)的乳酸抑制吞噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)和吞噬功能,中度濃度(4.81 mmol/L～8.14 mmol/L)的乳酸濃度可引起吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)依賴乳酸濃度的增加而增加,高于此濃度可引起吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)與急劇下降,而吞噬功能提前急劇下降;2)吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶活性的改變與呼吸爆發(fā)的變化呈高度的相關(guān)性;3)乳酸濃度為8.14 mmol/L時(shí)中性粒細(xì)胞 NADPH氧化酶關(guān)鍵亞基p47phox移為至質(zhì)膜與gp91phox出現(xiàn)共定位。結(jié)論:乳酸引起的外周血酸度的變化可以通過調(diào)控NADPH氧化酶活性的改變影響其吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)和吞噬功能。

乳酸;吞噬細(xì)胞;吞噬功能;呼吸爆發(fā);活性氧;NADPH氧化酶

Objective:To investigate the impact of acidity change caused by lactic acid on the phagocytes cell respiratory burst and the phagocytic function in peripheral whole blood and mechanism.Method:1)10ml peripheral whole blood from 20 healthy male,was divided into 10 portions(1ml per portion)to establish the regression equation between concentration land the volume lactic acid.2)20ml peripheral whole blood from another 10 healthy male,was divided into group Ctr and E,each group was further separated into 10 portions and added in the different volume of lactic acid according to the first step,the group Ctr was treated with DPI additionally.The blood of two groups was incubated for 10 minutes and then 100ul whole blood was taken from each portion to detect the function of respiratory burst and phagocytosis of neutrophils and mononuclear cell respectively by flow cytometery.3.The neutrophils from the sixth portion blood of group Ctr and E were taken and observed the co-localization of the gp91phox and p47phox in NADPH-oxidase using immunocytochemistry and confocal technology.Result:1)Low concentration(less than 4.81mmol/L)of lactic acid can inhibit the function of phagocytosis and respiratory burst of phagocytic cells,moderate concentration(4.81 mmol/L～8.14mmol/L)of lactic acid can lead to the increase respiratory burst of phagocytic cells.The curve of respiratory burst can be declined sharply while above this concentration lactic acid and the curve of sharp decline of the function of phagocytosis was early than the curve of respiratory burst.2)It is a high degree of correlation between the activity NADPH oxidase and the respiratory burst in phagocytic cells.3)There is co-localization between the subunit p47phox and the gp91phox in NADPH-oxidase on the plasma membrane in neutrophils when the lactic acid concentration in blood is 8.14mmol/L.Conclusion:The acidity induced by lactic acid in peripheral blood can regulate the activity NADPH oxidase and lead to the change of the phagocytosis function and respiratory burst in phagocytic cells.

lactic acid;phagocytic cells;phagocytosis f unction;respiratory burst;radical;ROS;NA D P H-oxidase

G804.5

A

1000-677X(2011)03-0037-07

2010-12-10;

2011-01-18

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30971422);上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)資助項(xiàng)目(S30802)。

董靜梅(1969-)女,甘肅慶陽人,副教授,在讀博士研究生,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與健康促進(jìn),Tel:(021)35080378,E-mail:lzdjm119@sohu.com;陳佩杰 (1962-),男 ,浙江舟山人,教授,博士,博士研究生導(dǎo)師,研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)與免疫,Tel:(021)51253626,E-mail:chenpeijie1961@hotmail.com。

1.Shanghai Sports College,Shanghai 200438,China;

2.Institute ofPhysicalEducation,Lanzhou 730070,China.