趨化因子CXCL10在心肌細胞及巨噬細胞中的表達機制

李子南，翟 原，盧 靜，王 鉅

(1.首都醫(yī)科大學實驗動物科學部，北京 100069;2.加州大學洛杉磯分校醫(yī)學院外科學系器官移植中心，洛杉磯 CA91320)

趨化因子CXCL10在心肌細胞及巨噬細胞中的表達機制

李子南1，翟 原2，盧 靜1，王 鉅1

(1.首都醫(yī)科大學實驗動物科學部，北京 100069;2.加州大學洛杉磯分校醫(yī)學院外科學系器官移植中心，洛杉磯 CA91320)

目的 探討心肌缺血-再灌注損傷中趨化因子CXCL10的產生機制。方法 分別用LPS、H2O2、Ca2+載體A23187刺激原代培養(yǎng)的心肌細胞、骨髓來源的巨噬細胞或二者混合培養(yǎng)的共培養(yǎng)系統(tǒng)后，ELISA檢測培養(yǎng)基上清中的趨化因子 CXCL10和促炎性細胞因子 IL-1β、IL-6、TNF-α的含量，觀察其表達動力學。結果 ①大劑量(10 μg/mL)的LPS刺激心肌細胞主要產生趨化因子CXCL10;刺激骨髓來源巨噬細胞主要產生促炎性細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α。②H2O2、Ca2+通道激活劑并不能使產生趨化因子 CXCL10 或 IL-1β、IL-6、TNF-α 這些促炎性細胞因子。③骨髓來源的巨噬細胞促進心肌細胞表達趨化因子CXCL10;心肌細胞促進骨髓來源的巨噬細胞表達IL-6、TNF-α，但抑制IL-1β的表達。結論 心肌細胞是心肌缺血-再灌注損傷中CXCL10潛在的細胞來源;CXCL10的表達，主要依賴于TLR4的激活。

CXCL10;TLR4;心肌細胞;T細胞;缺血-再灌注損傷

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：心肌細胞原代培養(yǎng)采用Wistar大鼠，8周齡，雄性;骨髓來源巨噬細胞(bone marrowderived macrophages，BMMs)原代培養(yǎng)采用 Wistar大鼠，1日齡，雌雄不限。所有實驗動物均來源于首都醫(yī)科大學實驗動物科學部［SCXK(京)2005-0006］。

1.1.2 儀器：CO2培養(yǎng)箱(美國 MMM公司)，熒光倒置顯微鏡(重慶 COIC公司)，離心機(美國 Sigma公司)。

1.1.3 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗、L-谷氨酰胺均為美國HyClone公司產品，特級胎牛血清為德國 Biochrom AG公司產品，BrdU、多粘菌素 B、HEPES為德國 Merck公司產品，膠原酶Ⅱ為美國Worthington公司產品，胰蛋白酶為美國 Amresco公司產品，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、鈣離子載體(calcium ionophore)A23187為美國Sigma公司產品，H2O2為北京現代東方精細化學品有限公司產品，Rat CXCL10檢測試劑盒為武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司產品，Rat IL-1β、IL-6、TNF-α 檢測試劑盒為北京四正柏生物科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：①心肌細胞原代培養(yǎng)：75%乙醇消毒新生大鼠體表，開胸取出心臟，在無菌PBS中洗去血液，并剪成1 mm3的小塊，隨后將這些組織塊移入50 mL離心管中，加入8 mL心肌組織消化液(0.05% 胰酶，0.05% 膠原酶 II，0.5%BSA)，放在恒溫搖床上37℃搖5min消化組織。將離心管取下后自然沉淀后吸取上清，沉淀的組織塊中繼續(xù)加入新鮮的組織消化液。重復上述消化步驟數次直至大部分組織塊被消化完。除第一次外，其余次消化得到的上清立即加入等體積的心肌細胞培養(yǎng)基(含10%血清、1%雙抗、2 mol/L L-谷氨酰胺、0.01 mol/L BrdU、50 mg/L多粘菌素 B的 DMEM)中和消化，并1000 r/min離心6 min，獲得的沉淀大部分為心肌細胞。用培養(yǎng)基重懸細胞，過200目細胞篩，并接種在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)90 min使非心肌細胞貼壁，而后收集上清中未貼壁的心肌細胞，以2×106個/皿的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，5%CO2、37℃培養(yǎng)48h，換液，進行下步實驗。LPS組的培養(yǎng)基中不加入多粘菌素B。②L929條件培養(yǎng)基的制備：以5×105個/瓶的密度將L929系細胞接種于75cm2細胞培養(yǎng)瓶中，并補充 L929培養(yǎng)基(含10%特級胎牛血清、1% 雙抗、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L L-谷氨酰胺的 DMEM)至50 mL。5%CO2、37℃培養(yǎng)7d后收集培養(yǎng)基上清，過0.45 μm濾器，濾液便為 L929條件培養(yǎng)基(L929-conditioned medium)。③骨髓來源巨噬細胞原代培養(yǎng)：脫頸處死動物，75%消毒體表，取出兩側完整股骨，放入盛有酒精的無菌培養(yǎng)皿中浸泡。之后剪斷股骨，暴露骨髓腔，用5mL注射器吸取BMM培養(yǎng)基(含20%L929條件培養(yǎng)基、10%血清、1%雙抗、1%多粘菌素 B的 DMEM)，將骨髓腔中的骨髓沖出，獲得其中的造血干細胞。收集洗液，充分吹打后以5×106個/皿的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，在5%CO2、37℃下培養(yǎng)7 d，并每3 d更換一次培養(yǎng)基。第8天時將分化成熟的BMM消化下來，以5×105個/孔的密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。24h后換液，進行下步實驗。LPS組的培養(yǎng)基中不加入多粘菌素B。④共培養(yǎng)系統(tǒng)建立：兩種細胞原代培養(yǎng)方法同上。獲得成熟的 BMM后，將其消化下來，與新制備的心肌細胞懸液混合，最終以1×106心肌細胞混合5×105BMM/孔的密度，接種于6孔細胞培養(yǎng)板中。培養(yǎng)基使用心肌細胞培養(yǎng)基，LPS組的培養(yǎng)基中不加入多粘菌素B。

1.2.2 實驗分組：按不同藥品(PBS、低劑量LPS、高劑量 LPS、H2O2、鈣離子載體 A23187)刺激三種細胞(心肌細胞、BMMs、共培養(yǎng)系統(tǒng))后三個時間點(6 h、12 h、24 h)，分為 39 組(BMM、共培養(yǎng)系統(tǒng)均不做1 μg/mL LPS 組)，每組 3 皿細胞。

1.2.3 藥品劑量：H2O2是一種典型的氧自由基，常用于模擬由各種自由基造成的應激狀態(tài)或損傷;而鈣離子載體A23187是一種常用的鈣離子通道激活劑，可使培養(yǎng)基中包含 Ca2+通過鈣通道進入細胞內，造成細胞內鈣超載。為了模擬再灌注損傷過程中的氧化應激以及鈣超載，H2O2和離子載體A23187的應用濃度應使細胞處于一種應激狀態(tài)，而不應該引起明顯的細胞死亡。通過查閱文獻以及預實驗結果，二者濃度均選取為 0.02 μmol/L［4，10］。低劑量 LPS組采用 1 μg/mL，高劑量 LPS組采用10 μg/mL。上述濃度均為在培養(yǎng)基中的終濃度。

1.2.4 ELISA：①分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。設標準孔7孔，依次加入100 L不同濃度的標準品?？瞻卓准?00 μL標準品/樣品稀釋液，其余孔加細胞培養(yǎng)上清100 mL，酶標板加上覆膜，37℃溫育2。②棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素化二抗(臨用前配制)100 mL，酶標板加上覆膜，37℃溫育1 h。③棄去孔內液體，每孔用400 μL的洗滌液洗滌，浸泡1～2 min，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)，重復洗板3次。最后一次洗滌后，要把孔內的洗滌液完全甩干。④每孔加酶結合物(臨用前配制)100 μL，加上覆膜，37℃ 溫育 30 min。⑤棄去孔內液體，甩干，洗板5次。⑥每孔加底物溶液90 μL，酶標板加上覆膜，37℃避光顯色(反應時間控制在15～25 min，不要超過30 min。當標準孔的前3～4孔有明顯的梯度藍色，后3～4孔梯度不明顯時，即可終止)。⑦每孔加終止溶液50 μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現顏色不勻一，請輕輕晃動酶標板以使溶液混合均勻。在確保酶標板底無水滴及孔內無氣泡后，立即用酶標儀在450 nm波長測量各孔的吸光度(A值)。⑧各標準品及樣本值扣除空白孔值后作圖(七點圖)。以標準品的濃度為縱坐標，A值為橫坐標，繪出標準曲線，計算出回歸方程。將樣品的 A值代入方程式，計算出樣品濃度。

2 結果

2.1 TLR4通路介導趨化因子CXCL10的表達

用不同劑量 LPS刺激心肌細胞，并對CXCL10的表達進行動力學監(jiān)測。如圖1所示，隨著刺激時間的增加，心肌細胞CXCL10的表達量不斷增加，在10 μg/mL LPS組中，CXCL10的表達量從 6 h的216 pg/mL，上升到 24h的 828 pg/mL(P＜0.01)。此外，心肌細胞CXCL10的表達呈現出明顯的劑量反應，在24h時，低劑量組(1 μg/mL)CXCL10表達量為213 pg/mL，高劑量組(10 μg/mL)的表達量為828 pg/mL，是低劑量組的4倍(P＜0.01)。

用10 μg/mL的LPS(此劑量可明顯的使心肌表達CXCL10)刺激BMM，并檢測其CXCL10的表達從6h到24h一直保持在低水平(150 pg/mL到200 pg/mL之間)。

用10 μg/mL LPS刺激共培養(yǎng)系統(tǒng)，檢測在6、12、24 h時趨化因子CXCL10的表達量，均比心肌細胞高。雖然這種差異沒有統(tǒng)計學意義，但是值得注意的是，在共培養(yǎng)系統(tǒng)中，心肌細胞的數量只是單純培養(yǎng)心肌細胞的一半(106個/孔)，但卻產生相同甚至更多的CXCL10。

2.2 氧化應激、鈣離子超載對CXCL10表達的影響

用H2O2刺激細胞模擬氧化應激，或用鈣離子載體A23187刺激細胞模擬鈣離子超載，對于心肌細胞不能刺激其產生CXCL10(所有時間組表達量均未超過50 pg/mL)。但是二者可以刺激巨噬細胞產生CXCL10，在12 h組最為明顯，其表達量分別是對照組(PBS組)的4倍(P＜0.05)和6倍(P＜0.05)。

圖1 用LPS刺激細胞后，培養(yǎng)上清中CXCL10含量(s，pg/mL)Fig.1 CXCL10 concentrations in the medium at 6 h，12 h and 24 h after LPS stimulation(s，pg/mL)

圖2 用H2O2或鈣離子載體A23187刺激細胞后，不同時間培養(yǎng)上清中CXCL10含量(s，pg/mL)Fig.2 CXCL10 concentration in the medium at 6 h，12 h and 24 h after H2O2or calcium ionophore A23187 stimulation(s，pg/mL)

2.3 TLR4 通路介導 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細胞因子的表達

與CXCL10相比，LPS并不能明顯的刺激心肌使其產生 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細胞因子，只有在24 h組中IL-6這個指標與對照組(PBS組)有統(tǒng)計學差異。

對于BMM，雖然大劑量的LPS不能刺激其產生趨化因子CXCL10，但是卻可以產生其他促炎性的細胞因子，IL-1β(12 h組和 24 h組)、IL-6(6 h組)、TNF-α(12 h組)均與其對照組(PBS組)有統(tǒng)計學差異。

圖3 用LPS刺激細胞后，不同時間培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量(s，pg/mL)Fig.3Concentrations of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the medium at 6 h，12 h and 24 h after LPS stimulation(s，pg/mL)

從共培養(yǎng)系統(tǒng)組可以看出，對于LPS誘導的IL-6、TNF-α表達，心肌細胞與 BMM表現出協(xié)同作用。對于 IL-6 和 TNF-α，在 6、12、24 h 時共培養(yǎng)系統(tǒng)的表達量均高于心肌細胞和巨噬細胞單獨培養(yǎng)(P＜0.05)。而對于IL-1β這個指標來說，共培養(yǎng)系統(tǒng)組卻要低于單獨培養(yǎng)的BMMs組(P＜0.05)。

2.4 氧化應激、鈣離子超載對促炎性細胞因子表達的影響

圖 4 顯示，對于 IL-1β、IL-6、TNF-α 這三個指標，心肌細胞、巨噬細胞或共培養(yǎng)系統(tǒng)的H2O2組及鈣離子載體 A23187組均與對照組(PBS組)無統(tǒng)計學差異。

3 討論

課題組前研究已證實，在發(fā)生缺血-再灌注損傷的心肌組織中有趨化因子 CXCL10 的表達［7，8］;但是，心肌組織是由心肌細胞(實質細胞)、固有的巨噬細胞(間質細胞)等多種細胞成分組成，所以CXCL10的細胞學來源并不確定。本次實驗利用細胞培養(yǎng)的方法發(fā)現，與肝臟不同［13］，心肌細胞作為心肌組織中的實質細胞可以表達趨化因子 CXCL10，但這種表達需要大劑量的LPS刺激才可以產生。

在細胞實驗中，LPS可以特異性的激活 TLR4通路;而在動物實驗中，當再灌注發(fā)生時，受損的組織所釋放內源性配體(如熱休克蛋白、高遷移率族蛋白1等)可激活TLR4［11］，介導多種促炎性的細胞因子、趨化因子的表達。除TLR4被激活外，再灌時恢復氧氣供給的心肌組織中會有大量的氧自由基產生，造成細胞的氧化應激甚至損傷，引起心肌細胞一系列基因表達的改變［9］;并且，缺氧造成的能量代謝障礙也會引起細胞內外離子交換紊亂，Ca2+在細胞內聚集，即“鈣超載”(Ca2+overload)，Ca2+作為一種重要的第二信使，其在細胞內的累積勢必影響相關信號通路下游的基因表達改變。

綜上所述，除 TLR4通路外，氧化應激、鈣離子超載也可能引起趨化因子CXCL10的表達，故在本次實驗中設置了H2O2組以及鈣離子載體 A23187組。本次實驗結果顯示，H2O2誘導的氧化應激、鈣離子載體A23187誘導的鈣離子超載，二者均不能刺激心肌表達任何的趨化因子或細胞因子。這說明，當心肌發(fā)生再灌注損傷時，CXCL10以及其他促炎性因子的產生主要是由TLR4通路介導的。

TLR4主要在單核/巨噬細胞的細胞膜上表達，有報道稱在心肌細胞上同樣有 TLR4的表達［15］。本次研究發(fā)現，大劑量(10 μg/mL)的LPS可以激活心肌細胞上的TLR4，而且主要引起CXC10的表達，而不是表達IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細胞因子，提示在大劑量LPS誘導心肌細胞TLR4激活后，選擇性激活其下游的MyD88非依賴性通路產生CXCL10。相反，10 μg/mL LPS不能使 BMM 產生 CXCL10，但是卻能使其表達 IL-1β、IL-6、TNF-α 等促炎性細胞因子，提示BMM上的TLR4被大劑量LPS激活后，主要通過 MyD88依賴性通路表達 IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性細胞因子。

近期，已有國外研究小組報道，微量(10 ng/mL)的LPS就可以刺激BMM產生CXCL10以及IL-6、TNF-α［13］;但本研究小組研究發(fā)現，大劑量 (10 μg/mL)的 LPS刺激 BMM后，卻未觀察到明顯的CXCL10表達的上調，提示 BMM，LPS誘導的 TLR4下游通路的選擇與劑量有關，即微量 LPS刺激時MyD88依賴性及非依賴性通路都被激活，而高劑量LPS抑制MyD88非依賴性通路，而不影響MyD88依賴性通路。

共培養(yǎng)系統(tǒng)對大劑量LPS的反應性結果表明，心肌細胞、巨噬細胞在對趨化因子CXCL10以及促炎性細胞因子 IL-6、TNF-α的表達中表現出協(xié)同作用;在IL-1β的表達中表現出拮抗作用。二者之間的這種協(xié)同或抑制作用可能是由別的分子(如IFN-β)或通路(如JAK-STAT通路)介導，其機制還需要進一步研究證明。

圖4 用H2O2或鈣離子載體A23187刺激細胞后，不同時間培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量(s，pg/mL)Fig.4 Concentration of IL-1β，IL-6 and TNF-α in the medium at 6 h，12 h，24 h after H2O2or calcium ionophore A23187 stimulation(，pg/mL)

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Mechanism of CXCL10 expression in cardiac myocytes and bone marrow-derived macrophages

LI Zi-nan1，ZHAI Yuan2，LU Jing1，WANG Ju1
(1.Department of Laboratory Animal Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China;2.Dumont-UCLA Transplantation Center，Department of Surgery，UCLA School of Medicine，Los Angeles，CA 91320，USA)

Objective To investigate the mechanism of CXCL10 expression during myocardial ischemia-reperfusion injury.Methods To stimulate cardiac myocytes，bone marrow-derived macrophages(BMMs)and co-culture system with LPS，H2O2or calcium ionophore A23187 respectively，and then test the CXCL10，IL-1β，IL-6，TNF-α levels in the supernant of medium by ELISA.Results ①High dose(10 μg/mL)LPS could induce cardiac myocytes to express CXCL10 as well as BMMs to produce IL-1β，IL-6，TNF-α. ②H2O2，calcium ionophore A23187 failed to induce CXCL10 expression or IL-1β，IL-6，TNF-α expression，either on cardiac myocytes or on BMMs. ③BMMs promote CXCL10 induction of cardiac myocytes，while cardiac myocytes promote IL-6 and TNF-α induction of BMMs.Oppositely，the IL-1β induction of BMMs was inhibited by cardiac myocytes in this research.Conclusion Cardiac myocytes could be the potential cellular resource during myocardial ischemia-reperfusion injury.It is mainly the activation of TLR4 that cause CXCL10 expression.

Ischemia-reperfusion injury;Cardiac myocyte;TLR4;T cell;CXCL10

CXCL10;TLR4

A

1005-4847(2011)01-0059-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.014

CXCL10屬于趨化因子中CXC亞家族，可趨化多種炎性細胞，包括T淋巴細胞、單核細胞和自然殺傷(NK)細胞等進入炎癥部位，從而介導Th1型炎癥反應性疾?。?-3］。在本課題組之前的研究中已證明，發(fā)生再灌注損傷的心肌組織中有CD4+T細胞的浸潤，這種浸潤伴隨著T細胞特異性的趨化因子CXCL10 表 達 上 調［7，8］。本 次 研 究 主 要 探 討：①TLR4通路是否參與了CXCL10的表達?②CXCL10產生的細胞學機制。

李子南(1985-)，男，碩士研究生。研究方向：再灌注損傷的免疫損傷機制。

王鉅，教授。E-mail：wangju@ccmu.edu.cn

2010-11-08