高效液相色譜法測(cè)定人血液、尿液中的2，4-D丁酯

劉曉敏，廖林川，顏有儀，楊林，盛欣，鐘應(yīng)佳

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都610041）

高效液相色譜法測(cè)定人血液、尿液中的2，4-D丁酯

劉曉敏1，廖林川1，顏有儀1，楊林1，盛欣2，鐘應(yīng)佳1

（1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，四川成都610041；2.四川大學(xué)華西藥學(xué)院，四川成都610041）

目的建立檢測(cè)血液、尿液中2，4-D丁酯的高效液相色譜分析方法。方法采用正己烷為樣品萃取溶劑，色譜柱為Zorbax SB-Aq柱，流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（水）=60∶40。結(jié)果2，4-D丁酯在血液和尿液中的線性范圍分別為0.10～10.00 μg/mL（r≥0.999 8）和0.08～8.00 μg/mL（r≥0.999 5），檢測(cè)限分別為0.002 0 μg/mL和0.001 8 μg/mL，準(zhǔn)確度為94.5%～104.5%，日內(nèi)、日間精密度≤4.5%。結(jié)論本研究建立的血液、尿液中2，4-D丁酯的提取和HPLC檢測(cè)方法，可應(yīng)用于2，4-D丁酯中毒的快速檢驗(yàn)和中毒死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定。

2，4-D丁酯；高效液相色譜法；法醫(yī)毒物分析；生物樣品

Abstract：Objective To establish a HPLC method for determination of 2，4-D butyl ester in blood and urine.Methods Compound was extracted from blood and urine using ethyl acetate.Separation was achieved on Zorbax SB-Aq column using methanolwater（60∶40）as mobile phase.Results The calibration curve of 2，4-D butyl ester ranged from 0.10 μg/mL to 10.00 μg/mL in blood（r≥0.999 8）and 0.08 μg/mL to 8.00 μg/mL in urine（r≥0.999 5），respectively.The limits of detection for the analyte was 0.002 0 μg/mL and 0.001 8 μg/mL in blood and urine，respectively.The intra and inter day assay precision were no more than 4.5%.The mean recovery ranged from 94.5%to 104.5%.Conclusions The pre-treatment and HPLC analysis of 2，4-D butyl ester in blood and urine can be used for rapid diagnosis of 2，4-D butyl ester poisoning and forensic identification of 2，4-D butyl ester poisoning death.

Key words：2，4-D butyl ester；HPLC；forensic toxicological analysis；biological specimen

2，4-D丁酯是一種苯氧羧酸類激素型選擇性除草劑，具有較強(qiáng)內(nèi)吸傳導(dǎo)性、殺草譜廣、除草效果好等特點(diǎn)，主要適用于小麥、玉米田中防除多種一年生闊葉雜草。2，4-D丁酯雖屬于低毒類除草劑，但其中毒事件時(shí)有發(fā)生，尤其在農(nóng)村地區(qū)多見。常見為口服中毒，其表現(xiàn)先為消化道癥狀，然后出現(xiàn)感覺異常、嗜睡、肌肉無力和肌纖維顫動(dòng)，嚴(yán)重者出現(xiàn)抽搐、昏迷、大小便失禁和呼吸衰竭[1]。

目前對(duì)2，4-D丁酯的分析方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，且多是對(duì)蔬菜、水果等食品中殘留的2，4-D丁酯進(jìn)行檢測(cè)[2～4]。也有學(xué)者曾用家禽進(jìn)行有關(guān)2，4-D丁酯的動(dòng)物毒理學(xué)研究[5～7]，為了滿足法醫(yī)學(xué)毒物分析工作的需要，本研究嘗試用高效液相色譜法分析生物樣品中的該化合物，建立血液、尿液中2，4-D丁酯的高效液相色譜定性定量的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；UV紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；BS210S電子分析天平（德國Sartorius公司），感量0.1 mg；LD422醫(yī)用離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）。

2，4-D丁酯對(duì)照品（100.00 μg/mL，1.0 mL）；甲醇（色譜純，美國Fisher公司）；超純水（電阻率不小于18.2 MΩ.cm），其它試劑均為分析純。

1.2 對(duì)照品溶液的配制

取2，4-D丁酯對(duì)照品（100.00 μg/mL）1.0 mL于容量瓶中，用正己烷精密定容至10.0 mL。配成質(zhì)量濃度為10.00 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，4℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

量取血液（尿液）0.5 mL，渦旋混勻后，加入飽和氯化鈉溶液0.5 mL，加入正己烷1.0 mL，渦旋5 min后，以離心半徑6 cm，3000 rpm/min，離心5 min。取上層液體，以離心半徑3 cm，12 000 rpm/min，高速離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為Zorbax SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），預(yù)柱為C18填料的短柱（8 mm×4 mm），流動(dòng)相為V（甲醇）∶V（水）=（60∶40），流速為1 mL/min，柱溫為25℃，檢測(cè)波長為245 nm，同時(shí)收集190～360 nm的紫外吸收光譜，進(jìn)樣量為20 μL。

2 結(jié)果

2.1 專屬性的考察

按“1.3.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，2，4-D丁酯能得到很好地分離，血液和尿液中的內(nèi)源性組分不干擾測(cè)定，2，4-D丁酯的保留時(shí)間約為7.8 min，理論板數(shù)＞6.4×103。其色譜圖見圖1。

圖1 血液、尿液中2，4-D丁酯的色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0.5 mL空白血液或0.5 mL空白尿液數(shù)份，加入一定量不同質(zhì)量濃度的2，4-D丁酯對(duì)照品，配成含系列質(zhì)量濃度2，4-D丁酯的血液和尿液樣品。血液中2，4-D丁酯質(zhì)量濃度分別為0.10、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg/mL。尿液中2，4-D丁酯質(zhì)量濃度分別為0.08、0.20、0.40、0.80、2.00、4.00、8.00 μg/mL。按“1.3.1”項(xiàng)進(jìn)行處理后進(jìn)樣，記錄峰面積。以2，4-D丁酯的峰面積（y）與其相應(yīng)質(zhì)量濃度（x）作線性回歸，得2，4-D丁酯的回歸方程，見表1。在所測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，2，4-D丁酯在血液和尿液中的線性關(guān)系均良好（r≥0.999 5）。

2.3 檢測(cè)限

配制質(zhì)量濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線末端逐漸降低的系列生物樣品，按“1.3.1”項(xiàng)進(jìn)行前處理后進(jìn)樣，記錄峰面積。以S/N≥3計(jì)，獲得血液與尿液中2，4-D丁酯的檢測(cè)限（表1）。

表1 血液、尿液中2，4-D丁酯的線性范圍及檢測(cè)限

2.4 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取1.0 mL空白血液和1.0 mL空白尿液數(shù)份，添加2，4-D丁酯對(duì)照品，配成高、中、低3種質(zhì)量濃度的血液和尿液樣品，按“1.3.1”項(xiàng)進(jìn)行前處理。每質(zhì)量濃度的樣品于一天內(nèi)平行分析5次，得到日內(nèi)精密度；于5日內(nèi)分別重復(fù)測(cè)定3種質(zhì)量濃度的樣品，每日各平行測(cè)定3份，得到日間精密度；以測(cè)得的質(zhì)量濃度除以實(shí)際添加的質(zhì)量濃度，得方法回收率，即準(zhǔn)確度，結(jié)果見表2。

表2 血液、尿液中2，4-D丁酯的準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)（n=5，%）

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制數(shù)份含2，4-D丁酯高、中、低質(zhì)量濃度的血液和尿液樣品?？疾鞓悠吩谑覝叵路胖?、8、12 h（見表3），反復(fù)凍融兩次以及在-20℃下貯存5、10、20 d的穩(wěn)定性。按“1.3.1”項(xiàng)進(jìn)行樣品的前處理后，進(jìn)樣分析。以測(cè)得的平均質(zhì)量濃度對(duì)實(shí)際添加質(zhì)量濃度的相對(duì)誤差來衡量藥物測(cè)定質(zhì)量濃度的變化。結(jié)果表明，樣品在室溫下放置質(zhì)量濃度變化≤15.1%，-20℃下貯存質(zhì)量濃度變化≤13.5%，基本穩(wěn)定。

表3 2，4-D丁酯在血液與尿液中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（n=5，μg/mL）

3 討論

3.1 樣品前處理

2，4-D丁酯生物樣品前處理鮮有報(bào)道，有文獻(xiàn)報(bào)道采取氯仿進(jìn)行提取，并于70℃水浴氮?dú)獯蹈蒣8]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)考察萃取劑乙酸乙酯、乙醚、氯仿和正己烷，發(fā)現(xiàn)正己烷作為萃取溶劑的效果最好。乙酸乙酯、乙醚萃取回收率均低于正己烷（乙酸乙酯平均萃取回收率為61.85%，乙醚為58.74%，氯仿為70.45%，正己烷為80.55%）。因氯仿毒性較大，在尿液的提取中容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象且萃取效果不如正己烷，故將其排除在外。且采用正己烷提取生物檢材的雜質(zhì)較少。此外，本實(shí)驗(yàn)考察在濃縮時(shí)，比較水浴加空氣流吹干，發(fā)現(xiàn)效果均不理想，這與2，4-D丁酯揮發(fā)性很強(qiáng)有關(guān)。綜合考慮2，4-D丁酯極性較小，揮發(fā)性較強(qiáng)等性質(zhì)問題，本實(shí)驗(yàn)選用同樣極性較小的正己烷作萃取溶劑，不濃縮方式進(jìn)樣分析。于樣品中加入0.5 mL飽和NaCl防止乳化現(xiàn)象的發(fā)生。

同時(shí)考察穩(wěn)定性時(shí)，結(jié)果表明在室溫條件下存放含2，4-D丁酯樣品的穩(wěn)定性略差（室溫下放置質(zhì)量濃度變化≤15.1%），這與2，4-D丁酯揮發(fā)性較強(qiáng)有關(guān)，因此在法醫(yī)工作中，應(yīng)注意檢材的保存，并且應(yīng)盡快處理檢材。

3.2 定量方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)曾考慮用內(nèi)標(biāo)法對(duì)2，4-D丁酯進(jìn)行定量，選擇了與其結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)相近且2，4-D丁酯乳油中不會(huì)混有的藥物-氯貝丁酯、貝諾酯等作為內(nèi)標(biāo)。但結(jié)果表明，采用內(nèi)標(biāo)法定量，其準(zhǔn)確性與外標(biāo)法所得結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)樣品預(yù)處理簡單，用外標(biāo)法顯示樣品多次測(cè)定的重現(xiàn)性好，各份樣品的操作易平行一致。故本實(shí)驗(yàn)采取外標(biāo)法進(jìn)行定量，該方法簡便可行，結(jié)果準(zhǔn)確，可應(yīng)用于生物樣品中2，4-D丁酯的定量檢測(cè)。

3.3 色譜條件的選擇

以往對(duì)2，4-D丁酯的研究主要是應(yīng)用氣相色譜法、GC/MS方法檢測(cè)，而采取高效液相色譜法對(duì)生物樣品進(jìn)行分析未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2，4-D丁酯的性質(zhì)，采用甲醇-水系統(tǒng)，分別考察了V（甲醇）∶V（水）為80∶20、75∶25、70∶30、60∶40時(shí)的色譜行為。結(jié)果表明，以V（甲醇）∶V（水）=60∶40作為流動(dòng)相時(shí)，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測(cè)定，2，4-D丁酯保留時(shí)間也比較合適。

4 案例應(yīng)用

文中所建2，4-D丁酯生物樣品分析方法，已用于法醫(yī)學(xué)毒物分析工作中。某女，56歲，某日發(fā)現(xiàn)死于自家臥室內(nèi)，死因未明，搜索現(xiàn)場(chǎng)，發(fā)現(xiàn)家中有裝2，4-D丁酯乳油的塑料空瓶。法醫(yī)提取其心血送檢，采用所建方法進(jìn)行檢測(cè)，死者心血中檢出2，4-D丁酯質(zhì)量濃度為7.9 μg/mL。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所建方法簡便、快速、成本低，且準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，適用于2，4-D丁酯中毒的快速檢驗(yàn)診斷和中毒死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定工作。

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（本文編輯：卓先義）

Determination of 2，4-D Butyl Ester in Blood and Urine by HPLC

LIU Xiao-min1，LIAO Lin-chuan1，YAN You-yi1，YANG Lin1，SHENG Xin2，ZHONG Ying-jia1
（1.West China School of Preclinical and Forensic Medicine，Sichuan University，Chengdu 610041，China；2.West China School of Pharmacy，Sichuan University，Chengdu 610041，China）

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2011.01.005

1671-2072-（2011）01-0023-03

2010-07-23

劉曉敏（1984-），女，碩士研究生。

廖林川，教授，主要從事法醫(yī)毒物（藥物）分析研究。E-mail：linchuanliao@163.com。