毛茛皂苷的提取及其抑菌作用初步分析

蘇 波

(長(zhǎng)沙外國(guó)語(yǔ)學(xué)校,湖南長(zhǎng)沙 410001)

毛茛皂苷的提取及其抑菌作用初步分析

蘇 波

(長(zhǎng)沙外國(guó)語(yǔ)學(xué)校,湖南長(zhǎng)沙 410001)

采用D-101大孔樹脂吸附和正丁醇萃取兩種不同的方法對(duì)毛茛皂苷進(jìn)行提取分離,對(duì)分離純化后的樣品采用紫外可見(jiàn)光全波長(zhǎng)掃描分析和高效液相色譜純度和含量鑒定1結(jié)果表明分離純化后的毛茛皂苷在209 nm處有最大吸收峰,正丁醇萃取的毛莨皂苷含量比大孔樹脂吸附分離的較高.以毛茛皂苷對(duì)9種不同細(xì)菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),顯示毛茛皂苷對(duì)綠膿桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸球菌、金黃色葡萄球菌均具有較明顯的抑菌作用.

毛茛皂苷; 大孔樹脂吸附; 正丁醇萃取; 抑菌作用

毛茛(Ranunculus japonicusThunb)是毛茛科(Ranunculaceae)毛茛屬(Ranunculus)植物,以帶根全草入藥,又名老虎腳跡、五虎草等.生于田溝旁和林緣路邊的濕草地上,除西藏外,在我國(guó)各省區(qū)廣布1味辛,性溫,有毒.具有利濕、消腫、止痛、退豁、截瘧、殺蟲之功效,中醫(yī)臨床用于主治瘧疾、黃疽、偏頭痛、胃痛、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、鶴膝風(fēng)、癰腫、惡瘡、疥癬、牙痛、火眼等疾病.毛茛始載于《本草拾遺》,在《本草綱目》中也有記載,應(yīng)用歷史悠久[2]1

毛茛種類多,在我國(guó)分布廣,其藥用價(jià)值逐漸得到重視,迄今為止,國(guó)已內(nèi)相繼從毛茛中分離得到了20個(gè)化合物.近年來(lái)對(duì)毛茛的研究表明其具有抗菌殺菌、抗組胺、抗腫瘤、松弛血管或子宮平滑肌以及在農(nóng)業(yè)方面具有殺滅病蟲害等作用[1]1皂苷廣泛分布于自然界,包括三萜皂苷和甾體皂苷,因水溶液振搖后可生成膠體溶液,并有持久性似肥皂溶液的泡沫而得名[2].藥理研究證明,皂苷具有抗炎、抗腫瘤、抗菌和抗病毒、降低膽固醇、降血糖和免疫調(diào)節(jié)等多方面的生物活性和藥理作用[3].由于毛茛皂苷提取物往往被認(rèn)為有效成分含量低、雜質(zhì)多、質(zhì)量不穩(wěn)定,用藥多建立在經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,難以與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)接軌1為解決這個(gè)問(wèn)題,研究并優(yōu)化毛茛皂苷的提取與純化工藝十分必要.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 材料采集與處理

本研究所用材料于2009年7-9月份采自當(dāng)?shù)靥镆?、道?經(jīng)專家鑒定為毛茛(Ranunculus japonicus Thunb)1毛茛采回后用自來(lái)水洗凈,去根,置于陰涼通風(fēng)處自然干燥,然后用DS—1組織粉碎機(jī)粉碎,40目篩子過(guò)篩并保藏待用1

1.1.2 供試菌種及試劑

供試大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸桿菌、副甲硫桿菌、雞沙門氏菌9菌種均來(lái)自于湖南師范大學(xué);實(shí)驗(yàn)藥品均為國(guó)產(chǎn)試劑1

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 毛茛粗提物制備

精密稱取50 g毛茛粉末兩份(分別用于正丁醇萃取和樹脂吸附制備皂苷),分別加500 ml 70%乙醇浸泡24小時(shí)后超聲波輔助提取(超聲波條件t=45 min,T =30℃,W=750 w,超聲間隙2 s),然后用四層紗布過(guò)慮.將濾渣再加500 ml 70%乙醇重復(fù)此操作,合并提取液1將提取液抽濾后,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(130 pa,60℃)濃縮,得到毛茛粗提液.將粗提液先用等體積的石油醚萃取1-2次,再用等體積的乙酸乙酯萃取4-5次,直至上層(乙酸乙酯)為淺綠色,留下層液待用(待用液).

1.2.2 毛茛皂苷的制備

[2]中皂苷的提取,將以上待用液用等體積的正丁醇萃取2-3次,合并萃取液后低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏,加20 ml蒸餾水溶解得到棕紅色水溶液,其濃度為215 g/ml1

將用5%NaOH處理好的D-101大孔樹脂裝填層析柱后,按文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行毛茛皂苷的分離提取.將三次乙醇洗脫液合并后低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至20 ml,得到棕紅色液體,其濃度為215 g/ml.

1.2.3 毛茛皂苷的鑒定與分析

采用泡沫試驗(yàn)法鑒定毛茛皂苷[2]1

將上述制備得到的棕紅色液體(皂苷溶液)稀釋100倍,在波長(zhǎng)為200～800 nm下紫外全程掃描,記錄其最大吸收峰的波長(zhǎng)1以此最大吸收峰的波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行高效液相色譜分析.用HNTX-Ⅲ為內(nèi)標(biāo).

1.2.4 抑菌實(shí)驗(yàn)

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)9種供試細(xì)菌,將每一菌種均同時(shí)劃線接種于一個(gè)斜面培養(yǎng)基和兩個(gè)平板固體培養(yǎng)基上,37℃恒溫培養(yǎng)24 h1用藥敏紙片擴(kuò)散法[5]對(duì)有效菌株的篩選,測(cè)定抑菌圈直徑;采用二倍稀釋法[6]測(cè)最低抑菌濃度(MIC)1

2 結(jié)果

2.1 毛茛皂苷的鑒定

經(jīng)正丁萃取和經(jīng)大孔樹脂吸附所得的棕紅色液體加熱煮沸約10 min后過(guò)濾于一試管中,劇烈振蕩,產(chǎn)生大量泡沫并長(zhǎng)時(shí)間不消失(大于30 min),說(shuō)明該液體含有高濃度皂苷.

2.2 毛茛皂苷的提取分析

對(duì)提取得到的毛茛皂苷在200～800 nm下紫外全程掃描顯示,其最大紫外吸收波長(zhǎng)為209 nm(圖1).

經(jīng)HPLC分析,內(nèi)標(biāo)HNTX-III和毛茛皂苷的HPLC各峰保留時(shí)間與各峰面積分別見(jiàn)圖2與圖3,其量化數(shù)據(jù)如表1所示.

圖1 毛茛皂苷的紫外掃描圖譜

圖2 內(nèi)標(biāo)和毛茛皂苷的HPLC峰保留時(shí)間圖譜

圖3 內(nèi)標(biāo)和毛茛皂苷的HPLC峰面積圖譜

從圖2、3與表1可見(jiàn),正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品比樹脂吸附分離得到的毛茛皂苷粗品的成分要復(fù)雜,前者共有10個(gè)明顯的保留峰.根據(jù)各峰的保留時(shí)間,初步可推斷樹脂吸附分離得到的毛茛皂苷粗品HPLC中的1、2、3、4、5、6號(hào)分別對(duì)應(yīng)正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品HPLC中的1、2、5、8、9、10號(hào)峰,說(shuō)明正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品中還存在其他4種不同的雜質(zhì)成分1根據(jù)峰面積大小基本判斷1號(hào)峰為毛茛皂苷的保留峰(主峰),正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品和樹脂吸附分離得到的毛茛皂苷粗品的HPLC中1號(hào)峰與內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間相近,且與內(nèi)標(biāo)1號(hào)峰的相對(duì)面積之比分別為0.1961和0.8789,可見(jiàn)正丁醇萃取毛茛皂苷收獲率是樹脂吸附分離毛茛皂苷收獲率的4148倍,且與毛茛皂苷粗品中其他成分比較,正丁醇萃取毛茛皂苷的純度整體大于樹脂吸附分離毛茛皂苷的純度.

表1 HPLC圖譜分析數(shù)據(jù)

2.3 毛茛皂苷的抑菌能力分析

利用HPLC對(duì)正丁醇萃取的毛茛皂苷粗品進(jìn)行多次純化得到較純凈的毛茛皂苷用作抑菌試驗(yàn)1在選取的九種菌株中,毛茛皂苷對(duì)綠膿桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸球菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌作用,測(cè)得其平均抑菌圈的大小與空白對(duì)照的比值分別為215、210、117、115(表2),而對(duì)其他5種細(xì)菌沒(méi)有明顯的抑制生長(zhǎng)的效果.由此可知毛茛皂苷對(duì)綠膿桿菌抑制能力最大,其次分別是產(chǎn)氣腸球菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌.其中綠膿桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌均為革蘭氏陰性菌,所以毛茛皂苷可能對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制力大于對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用.

通過(guò)二倍稀釋法測(cè)定了毛茛皂苷對(duì)篩選的4種有效菌株的最低抑菌濃度(MIC),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,毛茛皂苷對(duì)糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為62.50 mg/ml,而對(duì)其他2種細(xì)菌的MIC都為31.25 mg/ml(表2).同樣可證明毛茛皂苷對(duì)綠膿桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌生長(zhǎng)的抑制作用比對(duì)糞腸球菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的抑制作用要強(qiáng).

表2 毛茛皂苷的抑菌效果

3 討 論

通過(guò)用正丁醇萃取法和大孔樹脂吸附分離法對(duì)毛茛皂苷提取含量和純度進(jìn)行綜合比較,盡管大孔樹脂吸附分離法得到的毛茛皂苷樣品含雜質(zhì)較少,但毛茛皂苷的相對(duì)含量不高,按HPLC峰面積計(jì)算,毛茛皂苷的峰面積與其他雜質(zhì)總峰面積比為1.243(1079558/ 868502);相反,正丁醇萃取法得到的毛茛皂苷樣品含雜質(zhì)成分個(gè)數(shù)雖然較多些,但毛茛皂苷的相對(duì)含量明顯較前者高,其與其他雜質(zhì)總峰面積比為2.997 (4839328/1614965)1因此,正丁醇萃取對(duì)毛茛皂苷的提取率明顯高于大孔樹脂吸附的分離.而且,結(jié)合HPLC的多次純化,單位數(shù)量的原材料毛茛中可更多地收獲到較高純度的毛茛皂苷.然而,正丁醇萃取法需要耗費(fèi)較多的劑試,提取成本較,且對(duì)環(huán)境有一定的污染.因而,如何更加有效地獲取毛茛皂苷還需更近一步研究.

抑菌結(jié)果顯示毛茛皂苷對(duì)綠膿桿菌、糞腸球菌、產(chǎn)氣腸球菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用,而對(duì)其他5種菌株沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)抑制性,說(shuō)明其缺乏廣譜抑菌作用.然而,它對(duì)綠膿桿菌和產(chǎn)氣腸球菌的MIC都僅為31.25 mg/ml,明顯小于其他植物成分抑菌的MIC[6-8],表明它對(duì)綠膿桿菌和產(chǎn)氣腸球菌生長(zhǎng)可能存在較特異的抑制作用,為其藥理藥學(xué)開發(fā)起到一定的提示作用1

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[8]樊明濤,陳錦屏.百里香提取物抑菌特性的研究[J].微生物學(xué)報(bào),2001,41(4),499-504.

Abstract:Saponin was extracted and purified by D-101 macroporous resin adsorption and n-buoh alcohol extraction fromRnauneuusl.And saponin was analyzed through Uv,which indicate that its maximum absorption wavelength is 209 nm.As the same time,the purity and content of saponin which obtained by two different methods were tested by HPLC.The results showed that the effect of n-butyl alcohol extraction is better than that of the macroporous resin adsorbent.Then,the saponin was to be examined its preliminary bacteriostasis abilityon 9 different bacteria by measuring the size of the circle of bacteriostasis,the results showed thatsaponinhas the obviousbacteriostaticaction onBacillussubtilis,P.aeruginosa,E.faecalis,Gasaureus Staphyloccocus aureus Rosenbach.

Key words:saponin of Ranunculus japonicus; macroporous resin adsorption; n-butyl alcohol extraction; bacteriostasi

A Research on the Extraction of Saponin fromRnauneuusl and Its Preliminary Bacteria Functions

SU Bo
(School of Foreign Languages in Changsha,Changsha,Hunan 410001)

R284

A

1671-9743(2011)02-0053-04

2011-02-11

蘇 波(1969-),男,湖南岳陽(yáng)人,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士生,主要研究環(huán)境生物學(xué).