現(xiàn)代測序技術(shù)及其在海洋生物研究中的應(yīng)用

李建軍，王瑞

（1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041；2.北京百邁客生物科技有限公司，北京 101300）

現(xiàn)代測序技術(shù)及其在海洋生物研究中的應(yīng)用

李建軍1，王瑞2

（1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東 濰坊 261041；2.北京百邁客生物科技有限公司，北京 101300）

總結(jié)了目前常用的幾種DNA測序技術(shù)原理、特點及其在海洋生物中的應(yīng)用。展望了新技術(shù)的發(fā)展方向，以及對海洋生物研究的影響。DNA測序技術(shù)的快速發(fā)展，必將對海洋生物基礎(chǔ)研究產(chǎn)生重要推動作用，為分子育種技術(shù)的發(fā)展提供基礎(chǔ)支持，加快重要海水經(jīng)濟(jì)物種的新品種培育進(jìn)程。

現(xiàn)代測序技術(shù)；海洋生物；育種

Abstract: In this paper, principles and characteristics of the commonly used DNA sequencing technologies, as well as their applications in the marine biological research are summed up.It was discussed the prospects of modern sequencing technology development, and the impact on aquatic biological research.It was suggested that the rapid development of DNA sequencing technology would promote the basic research of marine life.Basic support will be offered to molecular breeding, and finally accelerate the breeding process of important economic species of aquaculture.

Keywords: modern sequencing technology; marine biology; breeding

引 言

全基因組測序和基于全基因組測序的相關(guān)研究呈現(xiàn)出日新月異的發(fā)展勢頭。自從末端終止法測序技術(shù)[1]發(fā)明以來，DNA測序技術(shù)在短短三十余年內(nèi)得到迅速發(fā)展，科學(xué)家們已經(jīng)向著人類千元（1000美元）基因組時代發(fā)起沖擊。最初由于高昂測序成本的限制，全基因組測序涉及的領(lǐng)域受到限制，只有細(xì)菌[2]等基因組很小的生物的全基因組被首先測定，線蟲[3]、果蠅[4]、擬南芥[5]等模式生物的基因組隨后被測定，人類基因組[6,7]計劃的實施推動了基因組學(xué)在全世界的快速發(fā)展。這些測序工作都是采用Sanger法進(jìn)行，項目實施耗時費力。隨著新一代測序技術(shù)（Next-generation sequencing, NGS）的出現(xiàn)，越來越多的物種啟動了全基因組測序計劃?；蚪M研究機(jī)構(gòu)也呈現(xiàn)了多極化發(fā)展趨勢，中國成為國際基因組研究的重要一員。新一代測序技術(shù)基于新的測序原理，目前，邊合成（連接）邊測序方法占據(jù)主導(dǎo)位置。此外，單分子測序技術(shù)也即將得到全面發(fā)展。

海洋生物是生物學(xué)研究的重要領(lǐng)域，美國自1997年就開始計劃投資開展羅非魚、對蝦和牡蠣等海洋生物基因組研究。多個海洋藍(lán)藻基因組計劃也相繼啟動[8]。隨著海膽基因組[9]項目的完成，目前已有多個海洋生物基因組計劃啟動或部分完成[10,11]。中國已經(jīng)啟動了扁藻、螺旋藻、牡蠣[12]、對蝦等基因組計劃，這些計劃充分體現(xiàn)了中國在海洋生物基因組學(xué)研究中所處的重要地位。

1 測序平臺及應(yīng)用

1.1 Sanger法測序平臺

Sanger測序是基于 Sanger等發(fā)明的末端終止法發(fā)展起來的測序技術(shù)。主要的測序平臺包括ABI基因分析儀系列（310、3100、3130、3700、3730等）和MegaBACE系列（MegaBACE 500、750、1000、1500、4000等）。其中3730是目前還在較為廣泛使用的Sanger法測序平臺。3730測序使用PCR反應(yīng)體系，包括DNA模板、單鏈寡核苷酸引物、DNA聚合酶、4種dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）、4種經(jīng)不同熒光標(biāo)記的 ddNTP（ddATP、ddGTP、ddTTP和ddCTP）和緩沖液等。每個PCR循環(huán)包括變性（90℃）、退火（50－55℃，視具體情況而定）和延伸（72 ℃）3個過程。反應(yīng)過程中，DNA聚合酶在模板鏈指導(dǎo)下，逐個將dNTP加到引物的 3’末端，使引物延伸，合成出與模板互補(bǔ)的DNA鏈。由于其雙脫氧核糖的 3’位置缺少一個羥基，不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵，因此在單鏈延伸時，如果有雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）加入，就會引起延伸終止。由此形成一系列長度不等的DNA單鏈混合物，這些單鏈具有相同的5’-引物端，并以ddNTP殘基為3’端，通過毛細(xì)管電泳將這些帶有熒光標(biāo)記的不同長度的DNA分子片段分離開，再通過 3730成像系統(tǒng)識別熒光標(biāo)記并轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的測序峰圖及堿基序列。

Sanger測序法仍然為分子生物學(xué)研究提供著重要的測序平臺。廣泛的應(yīng)用于海洋生物功能基因研究、分子標(biāo)記開發(fā)等領(lǐng)域。

表1 各種常用測序平臺及其特點Tab.1 Sequencers and their characters

1.2 Illumina/Solexa’s GA 測序平臺

Solexa測序技術(shù)是由 Solexa公司首席科學(xué)家David Bentley負(fù)責(zé)研發(fā)的高通量測序方法（第二代測序技術(shù)）。該技術(shù)利用可逆的熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行邊合成邊測序。首先將DNA打斷，對純化后的DNA片段進(jìn)行修飾后在兩端加上特定的接頭，然后通過瓊脂糖凝膠電泳選取所需長度范圍的DNA片段。芯片（flow cell）表面連接有一層與接頭互補(bǔ)的單鏈引物，經(jīng)處理后的片段與芯片上的引物進(jìn)行互補(bǔ)連接，被“固定”在芯片上。經(jīng)過多輪PCR反應(yīng)后，單一片段經(jīng)過大量擴(kuò)增，形成單克隆的 DNA簇（cluster），這些簇以雙鏈橋的形式固定在芯片上，每個簇就是信息收集照片上的一個亮點。對這些簇進(jìn)行線性化、3’端阻斷等處理后作為模板使用，然后加入測序引物、DNA聚合酶、連接了阻斷基團(tuán)和熒光標(biāo)記基團(tuán)的4種dNTP等進(jìn)行擴(kuò)增合成。由于dNTP連接了阻斷基團(tuán)，因此一次合成只能加入一個堿基，通過拍照的方法捕獲數(shù)據(jù)。每反應(yīng)一次拍照4次（A、C、G、T各一次），獲得每個DNA簇新加入的堿基信息。拍照后洗去反應(yīng)液，去除3’末端的阻斷基團(tuán)和熒光標(biāo)記基團(tuán)，重新加入反應(yīng)體系，繼續(xù)獲取堿基信息，如此反復(fù)，得到大量DNA片段序列信息。Solexa目前可以檢測75 bp左右的片段長度，由于可以進(jìn)行paired-end測序，因此每個DNA簇可以檢測兩端一共150 bp左右的堿基序列。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，單向的讀長甚至可以達(dá)到100bp。

Solexa是高通量測序平臺，一次單通道的測序可以得到不低于200萬條的序列；測序成本低廉，每堿基的測序成本約為 Sanger法的 1%；此外，Solexa測序具有分辨率高、精確度高、操作簡便等特點。由于具有以上優(yōu)勢，Solexa測序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在全基因組de novo測序和重測序、轉(zhuǎn)錄組、表達(dá)譜、Small RNA、表觀遺傳學(xué)、性狀相關(guān)分子標(biāo)記開發(fā)等研究領(lǐng)域。Solexa測序技術(shù)目前在海洋生物中已經(jīng)得到大規(guī)模利用，用于藍(lán)藻全基因組測序、螺旋藻全基因組測序、海洋扁藻全基因組測序、牡蠣全基因組測序、對蝦全基因組測序、牡蠣轉(zhuǎn)錄組研究、藻類、扇貝、文昌魚、大黃魚表達(dá)譜研究以及紫菜、魚類小RNA研究等（個人交流）。

1.3 Life/APG’s SOLiD測序平臺

Solid測序技術(shù)是由美國Agencourt私人基因組學(xué)公司（APG）研發(fā)的新一代高通量測序方法，該技術(shù)的主要技術(shù)特點是“邊連接邊測序”。首先根據(jù)實驗?zāi)康模瑢⒒蚪MDNA打斷后，在短片段兩端加上SOLiD接頭制備片段文庫，或者經(jīng)過DNA環(huán)化、酶切、加接頭等步驟制備末端配對文庫。用制備的文庫片段作為模板，采用油包水PCR技術(shù)對這些片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增得到的單克隆片段簇固定在單一的磁珠上。這些磁珠被共價結(jié)合在SOLiD玻片表面，作為測序的最小單元。SOLiD采用雙堿基編碼，即采用4種熒光探針的顏色編碼16種堿基對，這些堿基對位于反應(yīng)底物的第 1、2位，反應(yīng)底物由8堿基組成，每次測序反應(yīng)連接上一個反應(yīng)底物。反應(yīng)底物的3-5位是隨機(jī)堿基，6-8位是可以與任何堿基配對的特殊堿基，因此底物序列由1-5位的堿基決定，也即SOLiD連接反應(yīng)共有45種底物。單向SOLiD測序包括五輪測序反應(yīng)，每輪反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)。第一輪測序反應(yīng)獲得目標(biāo)片段的第1-2、6-7、11-12等位置的堿基信息；第二輪測序反應(yīng)所用連接引物比上一輪所用引物在 3’位置上減少一個堿基，因此這輪測序反應(yīng)的第一次連接反應(yīng)獲得上輪反應(yīng)所用引物的3’末端最后一個堿基（第0位）和目標(biāo)序列第1位堿基的信息，隨后的反應(yīng)得到5-6、10-11等位置的堿基信息。五輪測序反應(yīng)完成后，就能獲得“0，1，2，3……”組成的SOLiD原始顏色序列。由于一種顏色編碼4種堿基對信息，并非一一對應(yīng)的關(guān)系，但是知道堿基對中第一個堿基后，就可以通過顏色編碼讀出第二個堿基，因此，通過第0位的已知堿基和獲得的顏色序列，可以推理出所有的堿基。

由于SOLiD技術(shù)得到的序列長度較小，測序成本較低，因此適合用于具有reference基因組序列的物種進(jìn)行重測序，或者在具有基因組序列且轉(zhuǎn)錄本注釋較好的物種中開展轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究具有較大的優(yōu)勢。目前，中國科學(xué)院海洋研究所組建的海洋生物基因組高通量測序平臺就是基于 SOLiD測序技術(shù)構(gòu)建的。

1.4 Roche/454’s GS FLX Titanium測序平臺

454 GS FLX測序技術(shù)主要以焦磷酸法進(jìn)行基因組序列測定，該技術(shù)把堿基的加入與發(fā)光過程偶聯(lián)在一起[13]。首先，DNA樣品被打斷成300 bp-800 bp的片段，在DNA片段兩端加上A、B兩個接頭，這兩個接頭各自含有20個堿基的PCR引物序列，20個堿基的測序引物序列，以及4個堿基的對照序列（TACG）。DNA通過這些接頭連接到特定的磁珠上，然后在擴(kuò)增試劑中乳化形成油包水的混合物。每個DNA片段在油包水的微環(huán)境下進(jìn)行獨立擴(kuò)增，在磁珠上產(chǎn)生幾百萬個相同的拷貝。隨后，將擴(kuò)增后的DNA磁珠放入PTP板中測序。每個PTP孔只能容納一個磁珠，孔中載有反應(yīng)所需的各種酶和底物。測序開始時，依次加入T、A、C、G 4種堿基，如果某種堿基可以與模板發(fā)生配對，就會在DNA聚合酶的作用下連接到合成鏈的末端，每次連接反應(yīng)都會在ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶的協(xié)同作用下釋放一次熒光信號。光信號會被CCD照相機(jī)捕獲，從而通過熒光信號的有無和強(qiáng)度實時測定DNA序列。

GS FLX系統(tǒng)在高通量測序平臺中具有最長的讀長，已經(jīng)在全基因組de novo測序、重測序、宏基因組學(xué)研究、考古學(xué)、SNP開發(fā)、小分子 RNA研究、轉(zhuǎn)錄組分析、基因表達(dá)調(diào)控研究等領(lǐng)域得到大量應(yīng)用。

2 新一代測序技術(shù)對海洋生物研究的影響及展望

新技術(shù)的出現(xiàn)開創(chuàng)了新的時代，生物學(xué)研究的新突破也促進(jìn)了新技術(shù)的涌現(xiàn)。Polonator G.007測序平臺、Helicos BioSciences的Heliscope測序平臺已經(jīng)開始得到應(yīng)用。Pacific Biosciences的新型測序平臺預(yù)計 2010年將投入市場[14]。目前已有十余個公司在開發(fā)新的測序技術(shù)。2009年底，中國科學(xué)院北京基因組研究所和浪潮集團(tuán)宣布開始聯(lián)合研發(fā)第三代基因測序儀。

新一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，為水產(chǎn)科學(xué)的發(fā)展奠定了堅實的基礎(chǔ)。搭建起海洋生物基因組研究和資源開發(fā)平臺，培養(yǎng)一批海洋生物基因組學(xué)研究人才，推動整個水產(chǎn)研究領(lǐng)域較快地開展基因組學(xué)研究工作。使得以全基因組測序為核心的海洋生物基因組學(xué)研究變?yōu)榭赡堋楹Ｑ髣游锏幕A(chǔ)生物學(xué)和育種研究提供大量的基因組水平信息和資源，極大的促進(jìn)了包括種質(zhì)評估、育種、病害防治等各種應(yīng)用研究的快速發(fā)展。在基因組測序的推動下，分子育種技術(shù)將日漸成熟，從而推動高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆等優(yōu)良水產(chǎn)品系選育工作的發(fā)展。

致謝：中國科學(xué)院海洋研究所許飛、李莉老師為文章修改提出寶貴意見，北京百邁客生物科技有限公司鄭洪坤為文章完成提供大力幫助，在此一并致謝。

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Modern sequencing technology and its application in the marine biological research

LI Jian-jun1, WANG Rui2

(1.Weifang Entry Exit Inspection and Querantine Bureau, Shandong Weifang 261041, China; 2.Biomarker Technologies Limited, Beijing 101300, China)

P735

A

1001-6932(2011)01-0104-04

2010-03 -04 ；收修改稿日期：2010-04-05

男，碩士，工程師。

王瑞。電子郵箱：wangrui529@gmail.com。