非水相細(xì)胞催化研究進(jìn)展

侯丹丹，于煒婷，戴小敏，劉袖洞，馬小軍

（1大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；2中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023）

進(jìn)展與述評

非水相細(xì)胞催化研究進(jìn)展

侯丹丹1，于煒婷2，戴小敏1，劉袖洞1，馬小軍2

（1大連大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 大連 116622；2中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，遼寧 大連 116023）

非水相細(xì)胞催化可提高水不溶化合物溶解度，改變熱力學(xué)平衡以利于產(chǎn)物合成，是生物催化的重要組成部分。本文介紹了非水相細(xì)胞催化體系中溶劑和催化劑的篩選，如lgP值法和以產(chǎn)物高萃取率為目標(biāo)的計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)，以及催化劑的溶劑耐受性；綜述了提高非水相細(xì)胞催化活性的方法，包括極端微生物的篩選和構(gòu)建、細(xì)胞固定化等，以及非水相細(xì)胞催化反應(yīng)在香料、藥物及藥物中間體等方面的應(yīng)用現(xiàn)狀；最后從生物學(xué)和工程學(xué)角度展望了非水相細(xì)胞催化研究的努力方向。

非水相；細(xì)胞催化；細(xì)胞固定化

Abstract：Nonaqueous whole cell-based biocatalysis，as an important part of biocatalysis，which can enhance the solubility of poorly soluble compounds，change the thermodynamic equilibrium in favor of product synthesis and so on. In this paper，we introduce the selection of organic solvents and biocatalysts in nonaqueous whole cell biocatalysis system，such as lgP method，computer aided molecule design based on high product extractability，and solvent resistance of biocatalysts. Moreover，we review the methods to improve cell catalytic activity in nonaqueous media，including screening and construction of extreme microorganisms，cell immobilization，and recent application of nonaqueous whole cell-based biocatalysis in spices，drugs and medicine intermediates. Finally，we propose the main efforts on nonaqueous whole cell-based biocatalysis in view of biology and engineering.

Key words：nonaqueous media；whole cell-based biocatalysis；immobilized cell

生物催化因具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好的特性而成為生物技術(shù)中一個(gè)快速發(fā)展的領(lǐng)域[1]。在過去的幾十年中，生物催化技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為工業(yè)合成大宗化學(xué)品、醫(yī)藥中間體、活性藥物等物質(zhì)的重要工具，并有望在醫(yī)藥、精細(xì)化工等領(lǐng)域取代傳統(tǒng)的化學(xué)合成路徑成為主要合成手段[2]。但對于一些工業(yè)上重要的化合物，其底物或產(chǎn)物大多數(shù)是水溶解度差或幾乎不溶于水的，因此生物催化過程常受到底物溶解度低、底物/產(chǎn)物抑制生物催化劑活性、產(chǎn)物進(jìn)一步降解等限制[1]，從而阻礙了生物催化技術(shù)在一些重要工業(yè)過程中的應(yīng)用。為解決這些問題，廣大研究者將注意力轉(zhuǎn)移到有機(jī)溶劑、水-有機(jī)溶劑兩相體系、超臨界流體、離子液體等非水相生物催化的研究中，取得了很好的效果。特別是水-有機(jī)溶劑系統(tǒng)，已經(jīng)開展了相當(dāng)全面的研究。王軼雄等[3]對非水相細(xì)胞生物催化反應(yīng)進(jìn)行了回顧，分別總結(jié)了產(chǎn)物為醇、甾體、有機(jī)酸、生物大分子及其它各類反應(yīng)的研究進(jìn)展。并從溶劑和細(xì)胞兩種角度對主要的研究方法進(jìn)行了闡述。

與水相生物催化相比，非水相生物催化具有無法比擬的優(yōu)勢[4]：如可以提高水不溶化合物的溶解度；改變化學(xué)平衡，使反應(yīng)向有利于產(chǎn)物合成的方向進(jìn)行等。與酶催化相比，非水相中利用微生物活細(xì)胞作為催化劑具有更多的優(yōu)點(diǎn)，它可以避免酶的分離和提純，并且對于需要輔酶參與和多個(gè)酶催化的反應(yīng)，細(xì)胞催化更容易實(shí)現(xiàn)[5-7]。但是，眾所周知，大多數(shù)的細(xì)胞在有機(jī)溶劑中活性降低，甚至失活，這在很大程度上限制了細(xì)胞催化在非水相介質(zhì)中的研究和應(yīng)用。因此，細(xì)胞在非水相介質(zhì)中的活性和穩(wěn)定性是非水相細(xì)胞催化需要解決的關(guān)鍵問題。

近幾年來，隨著計(jì)算機(jī)輔助溶劑篩選技術(shù)、新型耐有機(jī)溶劑極端微生物的篩選和構(gòu)建及非水相中固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，非水相細(xì)胞生物催化的研究日益深入，一些典型的非水相細(xì)胞催化反應(yīng)的例子如表1所示。本文簡要介紹了非水相細(xì)胞催化體系中溶劑和催化劑篩選過程，并且就近幾年來，提高非水相細(xì)胞催化活性的方法和非水相細(xì)胞催化反應(yīng)的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

表1 典型的非水相細(xì)胞催化反應(yīng)實(shí)例

1 非水相細(xì)胞催化的特征

盡管包括超臨界流體、離子液體等新溶劑已經(jīng)被用作生物催化的非水相介質(zhì)，有機(jī)溶劑仍是非水相細(xì)胞催化常用的反應(yīng)介質(zhì)。除了能很好地解決底物不溶性問題外，還有一些催化上的其它優(yōu)點(diǎn)，但不可否認(rèn)也存在一些缺點(diǎn)。

1.1 非水相細(xì)胞催化優(yōu)點(diǎn)[4]

①可提高反應(yīng)物質(zhì)的溶解度；②抑制不必要的副反應(yīng)；減少底物和產(chǎn)物抑制；③提高催化的穩(wěn)定性；④利于產(chǎn)物和催化劑的回收；⑤影響反應(yīng)的選擇性（底物選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性）；⑥有利于產(chǎn)物分離，提高產(chǎn)率；⑦改變化學(xué)平衡，使反應(yīng)向有利于產(chǎn)物合成的方向進(jìn)行等。

1.2 非水相細(xì)胞催化缺點(diǎn)[18]

①有機(jī)溶劑對細(xì)胞有毒性，降低活性；②對細(xì)胞無毒害的有機(jī)溶劑多是非極性的，因此溶解底物/產(chǎn)物的能力較差，降低了反應(yīng)速率；③在水中和有機(jī)溶劑溶解性都較差的反應(yīng)物會在兩相界面沉淀出來；④增加了反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性；⑤為了確保下游處理和反應(yīng)器中應(yīng)用的安全性，成本會增加；⑥存在廢水處理或有機(jī)溶劑循環(huán)使用的問題。⑦與傳統(tǒng)工藝不同，兩相體系大規(guī)模應(yīng)用沒有經(jīng)驗(yàn)可以借鑒。

2 非水相細(xì)胞催化體系的構(gòu)建

生物催化系統(tǒng)主要由底物及產(chǎn)物、反應(yīng)介質(zhì)、生物催化劑3個(gè)基本要素構(gòu)成。在有機(jī)介質(zhì)中微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵是介質(zhì)和催化劑的選擇。

2.1 介質(zhì)的選擇

篩選有機(jī)溶劑的兩個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)是：具有良好生物相容性和對產(chǎn)物的高萃取率。其它要求包括：溶劑的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性好，與水相不容易形成乳化液，不易生物降解，對環(huán)境毒害小和廉價(jià)易得等[4，19]。因此，具有合適物化性能和生物相容性的有機(jī)溶劑篩選并不是一個(gè)簡單的工作。

許多研究者在探索有機(jī)溶劑的物性參數(shù)與生物相容性的關(guān)系方面做了大量的工作，研究表明Laane等[20]提出的Hansch參數(shù)法（lgP法）是關(guān)聯(lián)溶劑物化性質(zhì)與生物相容性之間關(guān)系較為理想的方法。大量實(shí)驗(yàn)表明：溶劑的 lgP值和其對細(xì)胞的毒性成反比，即溶劑的 lgP值越高，其對細(xì)胞的毒性越小。但是疏水性溶劑更容易滲透或破壞細(xì)胞膜，進(jìn)而影響細(xì)胞催化[21]。因此最終要通過實(shí)驗(yàn)確定適于細(xì)胞保持最佳活性的有機(jī)溶劑，工作量仍很大。

近幾年來，隨著計(jì)算機(jī)輔助生物相容性分子設(shè)計(jì)研究的深入，有望簡化有機(jī)溶劑的篩選工作。Wang和 Achenie[22]引入了計(jì)算機(jī)輔助分子設(shè)計(jì)框架，以高萃取效率為目標(biāo)，設(shè)計(jì)了用于乙醇萃取發(fā)酵的生物相容性溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)高萃取效率需要太多的溶劑，即不能同時(shí)滿足溶劑體積的最小化和最大萃取效率之間的匹配。但是，在實(shí)際應(yīng)用時(shí)，性能要求并不是一個(gè)簡單值，而需要權(quán)衡設(shè)計(jì)程序以達(dá)到最佳結(jié)果。為此Cheng和Wang[23]引入了一個(gè)權(quán)衡優(yōu)化程序，用于乙醇發(fā)酵的生物相容性溶劑設(shè)計(jì)。將最優(yōu)設(shè)計(jì)的問題明確表達(dá)為一個(gè)混合-整數(shù)非線型計(jì)劃模型，而性能的要求反映在目標(biāo)和限制條件上，因此，最終乙醇萃取發(fā)酵中最佳有機(jī)溶劑的篩選轉(zhuǎn)化為靈活的目標(biāo)實(shí)現(xiàn)問題?？傮w來說，在用于萃取發(fā)酵生物相容性溶劑設(shè)計(jì)時(shí)，該方法較為簡單、可行，有望應(yīng)用于萃取發(fā)酵其它小分子物質(zhì)的溶劑篩選過程。

2.2 催化劑的篩選

細(xì)胞生物催化的成功與否首先取決于合適的微生物。通過經(jīng)典方法篩選新的生物催化劑來完成生物催化反應(yīng)仍然是最主要的方法之一。近幾年，生物信息學(xué)的發(fā)展，有利于生物催化劑的高效篩選。研究者一般通過以下手段獲得特定反應(yīng)適宜的催化劑：從收藏的菌種庫中篩選，土壤樣品、克隆庫和宏基因組篩選。但是不同于水相細(xì)胞催化，非水相細(xì)胞催化中，細(xì)胞除了要含有反應(yīng)所需的酶系外，還要求對有機(jī)溶劑有一定的耐受性。

以甾體轉(zhuǎn)化為例，可用于該轉(zhuǎn)化的微生物種類繁多，包括細(xì)菌、霉菌等。由于不同菌種所產(chǎn)酶的種類不同，不同菌種作用于同一底物可表現(xiàn)出不同的催化活性和立體選擇性。因此使用種類繁多的微生物庫和有效的篩選方法，篩選出高效菌株，可以提高反應(yīng)活性和立體選擇性。Kieslich[24]首次利用膽固醇和植物甾醇為唯一碳源，從土壤中分離出分支桿菌NRRL B-3683。大量研究表明，分枝桿菌（Mycobacterium sp.）具有較強(qiáng)的側(cè)鏈降解能力，是降解甾醇C-17位側(cè)鏈的重要菌種。并且，近來研究發(fā)現(xiàn)分支桿菌對有機(jī)溶劑表現(xiàn)出一定的耐受性[25-26]。De Carvalho等[25-26]系統(tǒng)考察了分支桿菌在一系列水溶性和水不溶性有機(jī)溶劑中的行為和耐受性，研究表明在兩相體系中，細(xì)胞傾向于收縮和降低表面粗糙度來減少表面積，這可能是細(xì)胞保護(hù)自身免受兩相界面張力的一種適應(yīng)方式。

3 提高非水相細(xì)胞催化活性的方法

細(xì)胞在非水相中的活性和穩(wěn)定性是非水相細(xì)胞催化需要解決的關(guān)鍵問題。近年來，人們研究的解決方法包括：新型耐有機(jī)溶劑極端微生物的篩選和構(gòu)建，細(xì)胞的固定化以及一些其它的輔助方法。

3.1 新型耐有機(jī)溶劑極端微生物的篩選和構(gòu)建

3.1.1 極端條件下耐受性微生物的分離

大自然的馴化賦予微生物以多樣性，耐有機(jī)溶劑極端微生物能適應(yīng)有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性或結(jié)構(gòu)破壞，具有獨(dú)特的抵抗惡劣環(huán)境的多種能力。因此，耐有機(jī)溶劑極端微生物的分離和研究可大大推動脂溶性物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的進(jìn)步與發(fā)展。

Irvan 等[27]以甲苯為唯一碳源，從活性污泥中分離出一株惡臭假單胞菌，該菌能利用丁醇、甲苯、二甲苯等多種有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，其突變體能在3%（體積分?jǐn)?shù)）甲苯和7%（體積分?jǐn)?shù)）辛醇中生長，是疏水性底物生物轉(zhuǎn)化兩相體系中的潛力菌株。

Yamashita等[28]從汽油污染的土壤樣本中分離出一株紅球菌 B-4，該菌有較高的疏水性，且對碳?xì)浠衔锉憩F(xiàn)出較高的親和力，因此對許多有機(jī)溶劑（正烷烴和單芳香化合物）有很高的耐受性，有望于用于石油污染物的降解和疏水性化合物合成。Hamada等[29]以重組大腸桿菌JM109和紅球菌 B-4分別作為親水性和疏水性催化劑，以單芳香化合物的羥基化反應(yīng)為模型，研究了細(xì)胞表面疏水性對菌體在水-水不溶性有機(jī)溶劑中轉(zhuǎn)化的影響。研究表明，相對于重組大腸桿菌JM109，紅球菌 B-4對油相中疏水性底物親和力更強(qiáng)，因此對單芳香化合物表現(xiàn)出較高的轉(zhuǎn)化效率。

3.1.2 溶劑耐受性微生物的構(gòu)建

近幾年來，人們嘗試以耐有機(jī)溶劑菌種為宿主細(xì)胞，通過基因工程手段，引入所需要的酶反應(yīng)體系進(jìn)行非水相細(xì)胞催化反應(yīng)。

當(dāng)產(chǎn)品形成是非生長耦合的，相比生長細(xì)胞，休眠細(xì)胞的制備是有優(yōu)勢的[30-31]。當(dāng)采用依賴于NAD（P）H的氧化還原酶時(shí)，輔酶再生可以在酶代謝中完成。Resnick等[32]報(bào)道了應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)重組萘雙加氧酶來優(yōu)化萘氧化生產(chǎn)萘二羥。研究表明，休眠細(xì)胞比生長細(xì)胞的生產(chǎn)力強(qiáng)，且兩相反應(yīng)狀態(tài)可以增加產(chǎn)量和選擇性提取產(chǎn)物。以時(shí)間為函數(shù)，人們研究了休眠細(xì)胞的活力和再生能力；并對其它參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，包括溶劑的選擇和相比例等。該優(yōu)化研究可以擴(kuò)展到其它氧化酶系統(tǒng)，而且它代表了環(huán)境溫和氧化過程重要進(jìn)展。近幾年來，非水相利用休眠細(xì)胞催化的例子屢見不鮮[15，29，33]。

在很多生物技術(shù)領(lǐng)域比如生物脫硫過程中，微生物對有機(jī)溶劑具有較高的耐受性是非常重要的。Tao等[34]從脫硫細(xì)菌R.erythpolis.XP的基因組中分別擴(kuò)增dszA、dszB、dszC和dszD基因，并插入到宿主質(zhì)粒 pMMB66EH 中，得到重組質(zhì)粒pMMABCD。進(jìn)而通過三親本雜交轉(zhuǎn)移法將此重組質(zhì)粒導(dǎo)入P.putida Idaho中，構(gòu)建了具有溶劑耐受性的脫硫細(xì)菌P.putida A4，結(jié)果表明：通過基因工程構(gòu)建的P.putida A4能降解多種多環(huán)芳烴硫雜環(huán)化合物，例如二苯并噻吩、苯并噻吩等，甚至在體積分?jǐn)?shù)達(dá)50%的對二甲苯中仍能保持脫硫活性。

3.2 細(xì)胞固定化

在非水相細(xì)胞催化中，應(yīng)用細(xì)胞固定化有明顯優(yōu)勢[18]，細(xì)胞固定化不僅有利于細(xì)胞分離和實(shí)現(xiàn)重復(fù)利用，而且防止了細(xì)胞和有機(jī)溶劑直接接觸，避免了細(xì)胞凝聚和有機(jī)溶劑的相毒性，有利于提高細(xì)胞在非水相中的活性和穩(wěn)定性。羅明芳等[35]研究表明：在非水相微生物催化除硫中，細(xì)胞固定化對促進(jìn)油品生物深度脫硫技術(shù)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展有重要意義。

不同固定化細(xì)胞的制備方法對反應(yīng)的傳質(zhì)、細(xì)胞活性和反應(yīng)的特性有不同影響。雖然固定方法種類很多，新方法也不斷出現(xiàn)，但仍沒有一種通用的、理想的方法。一般認(rèn)為，非水相催化反應(yīng)中固定化細(xì)胞制備方法應(yīng)該具有如下特點(diǎn)[9，36-41]：①能夠控制固定化細(xì)胞大小和孔隙度；②固定化所用原料要便宜易得；③固定化方法簡單易行；④固定化細(xì)胞具有良好穩(wěn)定性；⑤用于固定化細(xì)胞載體應(yīng)為惰性，不損傷細(xì)胞，不與有機(jī)介質(zhì)起反應(yīng)；⑥具有良好傳質(zhì)性能；⑦細(xì)胞在載體中分布要有利于反應(yīng)。然而，對于具體反應(yīng)，選用的固定化細(xì)胞制備方法和載體不可能都具備上述要求。因此要綜合考慮選擇合適方法。

目前，用于非水相生物催化的常見細(xì)胞固定化方法包括吸附、包埋和復(fù)合固定化等幾種方法。

3.2.1 吸附法

吸附法是依據(jù)帶電的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電、表面張力和黏附力的作用，而使微生物細(xì)胞固定在載體表面和內(nèi)部的方法。常見載體材料有：硅藻土、溫石棉、硅膠、蒙脫土等。此法操作簡單，細(xì)胞活力損失較小，但細(xì)胞直接與有機(jī)溶劑接觸，受到有機(jī)溶劑毒害大，細(xì)胞活性保持很大程度上依賴于有機(jī)溶劑的選擇。

在非水相細(xì)胞催化甾體轉(zhuǎn)化中，吸附法應(yīng)用較多，但至今為止，還沒有一種固定化材料可用于非水相細(xì)胞催化甾體轉(zhuǎn)化的工業(yè)生產(chǎn)中。目前，固定化細(xì)胞制備過程對細(xì)胞活性影響，以及非水相中固定化材料的重復(fù)利用性仍是科學(xué)家選擇固定化材料的主要依據(jù)。Dias等[36]考察了在有機(jī)溶劑中利用分支桿菌細(xì)胞選擇性降解谷甾醇支鏈的可能性，并且比較了不同固定化方法（硅藻土吸附、κ-卡拉膠包埋和聚氨酯泡沫包埋）對反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：無論在鄰苯二甲酸酯還是水相中，硅藻土固定化細(xì)胞降解谷甾醇的活性均較高，有機(jī)相底物摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)70%。但是，目前為止硅藻土固定化分支桿菌只能用于分批模式，且在連續(xù)分批操作時(shí)固定化細(xì)胞的催化活性下降較多，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證原因可能是固定化細(xì)胞重復(fù)利用造成細(xì)胞氧化能力損耗[37]。Wendhausen等[38]利用一種低成本無機(jī)材料溫石棉固定化分支桿菌，并以水-油兩相中β-谷甾醇微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)雄烯二酮（AD）為反應(yīng)模型，考察了固定化對產(chǎn)物產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化速率的影響。結(jié)果表明：在兩相介質(zhì)中，溫石棉固定化細(xì)胞催化反應(yīng)，產(chǎn)物產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化速率與游離細(xì)胞相比沒有區(qū)別，這表明固定化細(xì)胞不受傳質(zhì)影響。在連續(xù)攪拌罐反應(yīng)器中，溫石棉固定化細(xì)胞催化反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行一個(gè)月，產(chǎn)物產(chǎn)量穩(wěn)定。因此，該研究表明溫石棉是很好的細(xì)胞固定化材料，可有效提高細(xì)胞操作穩(wěn)定性，并且可進(jìn)一步通過優(yōu)化反應(yīng)條件來提高產(chǎn)物產(chǎn)量。

3.2.2 包埋法

包埋法是將細(xì)胞包裹在凝膠網(wǎng)格結(jié)構(gòu)或半透性聚合物薄膜內(nèi)，小分子底物和產(chǎn)物可自由擴(kuò)散，而細(xì)胞卻不會擴(kuò)散到周圍介質(zhì)中去的一種方法，它是非水相細(xì)胞催化常用固定化方法。常見載體材料有：海藻酸鈉，瓊脂，κ-卡拉膠，聚氨酯等。該法操作簡單，對細(xì)胞活性影響小，但是除了海藻酸鈉以外，天然凝膠在有機(jī)溶劑中的不穩(wěn)定性，分配、傳質(zhì)限制和機(jī)械穩(wěn)定性低等缺點(diǎn)限制了其在非水相細(xì)胞催化中的應(yīng)用[4]。海藻酸鈣凝膠因制備條件溫和，且在有機(jī)溶劑中穩(wěn)定，在非水相細(xì)胞催化中得到了廣泛應(yīng)用[12，39-42]。

Arabi等[42]以蘚類念珠藻細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成雄性激素為模型，研究了海藻酸鈉、瓊脂、κ-卡拉膠、聚丙烯酰胺、聚乙二醇5種材料及固定化方法對生物催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的影響。結(jié)果表明：海藻酸鈣凝膠包埋細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化率最高，達(dá) (72±2.3)%，而其它固定化方法轉(zhuǎn)化率不超過35%。因此，海藻酸鈣凝膠是包埋細(xì)胞較好的固定化載體。這主要因?yàn)槌Ｔ逅徕}凝膠以外，其它凝膠在制備過程中，由于溫度較低或單體對細(xì)胞的毒害作用，使凝膠的強(qiáng)度或細(xì)胞活性下降，所以海藻酸鈣固定化細(xì)胞的轉(zhuǎn)化活性較高。然而海藻酸鈣凝膠是親水性材料，對于疏水性物質(zhì)有傳質(zhì)限制，并且雖然海藻酸鈣固定化細(xì)胞可以克服有機(jī)溶劑的相毒性，但不能避免溶劑的分子毒性[15]。另外，Li等[43]利用硫酸纖維素鈉/聚二烯丙基二甲基氯化銨（NaCS/PDMDAAC）微囊固定化簡單節(jié)桿菌，用于兩相介質(zhì)中 11α-羥基-16α,17-環(huán)氧孕酮脫氫反應(yīng)的研究，考察了溶劑和表面活性劑添加量對反應(yīng)產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：反應(yīng)最佳條件是己烷為最適有機(jī)溶劑，吐溫80添加量2.13%，在氣升式環(huán)流反應(yīng)器中反應(yīng)產(chǎn)率達(dá)97.54%。在半連續(xù)化操作5次后，微囊化細(xì)胞內(nèi)酶活性仍較高，產(chǎn)物產(chǎn)率大于95%?？傊?，目前包埋法固定化細(xì)胞研究中反映出的最大缺點(diǎn)是物質(zhì)的擴(kuò)散限制。雖然，外擴(kuò)散傳質(zhì)限制可通過調(diào)節(jié)動力學(xué)條件減小或去除，內(nèi)擴(kuò)散傳質(zhì)限制也可通過減小固定化載體尺寸的方法在一定程度上有所減小，但這不是解決擴(kuò)散限制的根本辦法。因此，研究新型固定化材料、合適的固定化方法及載體結(jié)構(gòu)，可望解決包埋法固定化細(xì)胞常見的擴(kuò)散限制問題。

3.2.3 復(fù)合固定化方法

新興的復(fù)合固定化方法，因?yàn)槟軌蚱胶鈧鹘y(tǒng)單一固定化方法的優(yōu)缺點(diǎn)，使生物催化劑在保持原有活性的基礎(chǔ)上，穩(wěn)定性有所提高，還具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，因而在生物轉(zhuǎn)化、手性拆分和廢水處理等方面均有良好的應(yīng)用實(shí)例。目前非水相細(xì)胞催化中常見的復(fù)合固定化方法主要有耦合包埋法、吸附-包埋法，包埋-交聯(lián)法等。戴冕等[44]在石油醚/水兩相體系中，以 2%海藻酸鈉和10%聚乙烯醇為復(fù)合載體，利用固定化酵母細(xì)胞生物合成 L-麻黃素的重要中間體 L-苯基乙?；状迹↙-PAC）。研究發(fā)現(xiàn)，該耦合固定化方法與一般固定化細(xì)胞方法相比，既克服了營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的傳質(zhì)阻力，又保持了較好的機(jī)械強(qiáng)度，從而顯著提高L-PAC產(chǎn)量。雖然復(fù)合固定化方法已經(jīng)在非水相細(xì)胞催化中得到了重視，但是其研究大多數(shù)只是停留在實(shí)驗(yàn)室水平，可能是因?yàn)槟壳暗妮d體價(jià)格高，使用壽命短等問題。因此，耐用且廉價(jià)的新型復(fù)合微生物固定化載體的研究與開發(fā)，將是促進(jìn)復(fù)合固定化技術(shù)推廣應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)此方法工業(yè)化的關(guān)鍵問題。

3.3 其它輔助方法

3.3.1 添加人工電子受體

甾體的微生物轉(zhuǎn)化，如 C1，2脫氫、11α-羥化、11β-羥化反應(yīng)等都涉及輔助因子的反應(yīng)，需要輔助因子提供電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，但該電子轉(zhuǎn)移系統(tǒng)很容易受到外界因素影響而中斷，解決該問題的方法之一是添加人工電子受體來激活呼吸鏈，從而保持細(xì)胞持續(xù)的活性。維生素K因結(jié)構(gòu)和性能與天然電子受體相似，因此是非水相甾體轉(zhuǎn)化中常用的人工電子受體。Bie等[45]研究了兩相體系中維生素K對簡單節(jié)桿菌還原甲睪酮為甲睪酮的影響。研究表明：當(dāng)維生素K的濃度從0增加到0.6 mmol/L 時(shí)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率（體積比）從20%升到85%。

3.3.2 添加表面活性劑

兩相固定化細(xì)胞時(shí)，添加表面活性劑可強(qiáng)化相際傳質(zhì)（即從有機(jī)相到微生物細(xì)胞表面的傳質(zhì)），從而提高固定化細(xì)胞催化活性。在兩相固定化德氏假單胞菌R-8細(xì)胞油品脫硫中，Li等[46]研究了非離子表面活性劑對細(xì)胞活性的影響。研究表明：相比未添加表面活性劑，加入 0.5%非離子表面活性劑Span80，固定化細(xì)胞的脫硫活性提高了80%。

4 非水相細(xì)胞催化反應(yīng)應(yīng)用領(lǐng)域

4.1 香料生產(chǎn)

香料在食品、化妝品領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前，市場上的許多香料化合物仍然是通過化學(xué)合成或從植物中萃取生產(chǎn)的。隨著人們生活質(zhì)量的提高，消費(fèi)者對天然香料的需求日益增強(qiáng)。在美國或歐洲，能被標(biāo)記為“天然”的調(diào)味劑和芳香劑必須是采用物理方法從天然材料中提取、酶催化或微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的。但是，植物萃取因受季節(jié)和品種的影響，很難滿足市場上人們對天然香料的需求。因此，近年來香料的生產(chǎn)正迅速向微生物轉(zhuǎn)化制備方向轉(zhuǎn)變，例如微生物轉(zhuǎn)化合成香草醛和2-苯乙醇等。

香草醛像其它芳香化合物一樣，對微生物是有毒害的，因此，水相中微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)香草醛的產(chǎn)量很難提高。近幾年興起的非水相細(xì)胞催化香草醛合成過程，在發(fā)酵液中加入有機(jī)溶劑，在產(chǎn)物形成的同時(shí)將其萃取出來，從而大大提高了香草醛的產(chǎn)量[47]。Shimoni等[48]從土壤中分離到一株枯草芽孢桿菌，它轉(zhuǎn)化異丁香酚為香草醛的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到12.4%，產(chǎn)物濃度為0.61 g/L，其無細(xì)胞萃取液能提高轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)生0.90 g/L香草醛。趙麗青等[8]從土壤中篩選獲得一株能耐受高濃度異丁香酚，并高效轉(zhuǎn)化生成香草醛的紡錘芽孢桿菌菌株CGMCC1347，研究了微生物細(xì)胞在異丁香酚-水兩相體系中轉(zhuǎn)化異丁香酚制備香草醛的過程，在優(yōu)化條件下轉(zhuǎn)化，香草醛濃度高達(dá)46.10 g/L 。

4.2 藥物和藥物中間體生產(chǎn)

對于需要輔酶參與和多酶催化的反應(yīng)，細(xì)胞催化更易實(shí)現(xiàn)，例如甾體轉(zhuǎn)化和氧化還原反應(yīng)。非水相細(xì)胞催化制備手性藥物中間體和甾體藥物，因具有減少底物抑制或原位萃取產(chǎn)物，抑制副反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，有利于產(chǎn)物產(chǎn)量和選擇性的提高[36-37，49]。

影響水相中甾體轉(zhuǎn)化產(chǎn)量提高的主要原因是底物和產(chǎn)物在水中溶解度很低，如甾體、甾醇化合物在水中溶解度通常低于0.1 mol/L 或1 μmol/L。而利用水-有機(jī)溶劑兩相體系可以有效解決這一問題，并可提高轉(zhuǎn)化率，簡化產(chǎn)物的分離過程。目前的研究主要集中于通過改進(jìn)疏水性底物和生物催化劑間的相互作用來提高生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)量。近幾年，在非水相體系生物轉(zhuǎn)化β-谷甾醇方面，Pinheiro研究組為提高產(chǎn)物雄烯二酮（AD）和 1,4-雄烯二酮（ADD）產(chǎn)量，在有機(jī)溶劑篩選[50]、生物反應(yīng)器操作條件優(yōu)化[51]、生物催化劑固定化[38]等方面做了大量研究。以休眠分枝桿菌選擇性降解β-谷甾醇支鏈為模型，Marques等[52]考察了非水相中完整細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化規(guī)模化的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)分別在0.5 mL微量滴定板、250 mL錐形瓶和300 mL磁力攪拌器上進(jìn)行，研究表明：在以上3種規(guī)模中，當(dāng)水-有機(jī)溶劑兩相保持恒定的體積功耗時(shí)，產(chǎn)物產(chǎn)量相似。因此，恒定的體積功耗是預(yù)測水-有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)規(guī)模化較合適的標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)從錐形瓶放大到攪拌器規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，細(xì)胞的催化活性保持不變。該研究首次為非水相完整細(xì)胞催化從錐形瓶放大到實(shí)驗(yàn)室規(guī)模生物反應(yīng)器提供了較合適的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

4.3 其它化合物生產(chǎn)

除了在香料和藥物中間體上的應(yīng)用，非水相細(xì)胞催化在環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域也有不少應(yīng)用[28-29，34]。例如石油污染物降解和生物脫硫等。兩相分批培養(yǎng)系統(tǒng)已用來克服高底物濃度對微生物細(xì)胞活性的抑制。Parameswarappa等[53]研究了正癸醇-水體系中游離和固定化熒光假單胞菌-CS2對乙苯的降解能力。結(jié)果表明：熒光假單胞菌-CS2在兩相中對乙苯的降解能力較純油相中提高了 5倍。海藻酸鈣凝膠和聚丙烯酰胺固定化熒光假單胞菌-CS2可有效提高菌體對乙苯的降解能力，分批培養(yǎng)可持續(xù)降解達(dá)42天。

5 展 望

非水相細(xì)胞催化有著誘人的應(yīng)用前景，其研究已經(jīng)從大宗化學(xué)品制備，如乙醇、丁醇等，擴(kuò)展到有較高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)，如香料、精細(xì)化學(xué)品等。但是，細(xì)胞在非水相介質(zhì)中的活性和穩(wěn)定性保持一直是非水相細(xì)胞催化需要解決的關(guān)鍵問題。除了非水相介質(zhì)的篩選技術(shù)，研究者在耐有機(jī)溶劑極端微生物的篩選和構(gòu)建、非水相固定化細(xì)胞技術(shù)等提高細(xì)胞催化活性的方法方面做了大量有益的嘗試，提高了非水相中細(xì)胞活性和穩(wěn)定性。然而，非水相細(xì)胞催化研究還停留在實(shí)驗(yàn)室探索階段，幾乎沒有工業(yè)上成功的應(yīng)用例子。從生物學(xué)角度來看，新型耐有機(jī)溶劑極端微生物的篩選仍將是今后生物學(xué)家關(guān)注的方向。隨著基因工程技術(shù)、組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，人們對微生物細(xì)胞溶劑耐受機(jī)制認(rèn)識程度的提高，耐有機(jī)溶劑微生物的構(gòu)建將是更具有實(shí)際意義的工作。從工程學(xué)角度來看，細(xì)胞固定化技術(shù)仍是一個(gè)有效的手段，但固定化載體對細(xì)胞的保護(hù)作用與滿足細(xì)胞生長代謝所需的物質(zhì)傳遞之間的平衡問題是個(gè)不小的挑戰(zhàn)。通過選擇或者合成生物相容的固定化材料、建立溫和簡單的固定化方法、調(diào)控固定化載體結(jié)構(gòu)、設(shè)計(jì)新型生物反應(yīng)器結(jié)構(gòu)和操作方式，以及結(jié)合產(chǎn)物原位分離技術(shù)、實(shí)現(xiàn)非水相細(xì)胞催化的生產(chǎn)與多種分離過程的耦合，將有助于推動非水相細(xì)胞催化技術(shù)走向工業(yè)應(yīng)用，生產(chǎn)香料、手性藥物或藥物中間體等高附加值產(chǎn)品。

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Progress of whole cell-based biocatalysis in nonaqueous media

HOU Dandan1，YU Weiting2，DAI Xiaomin1，LIU Xiudong1，MA Xiaojun2
（1School of Environment and Chemical Engineering，Dalian University，Dalian 116622，Liaoning，China；
2Dalian Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Dalian 116023，Liaoning，China）

Q 814

A

1000–6613（2011）04–0830–08

2010-10-12；修改稿日期：2010-11-11。

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（2007CB714305）、國家自然科學(xué)基金（20736006，20806080）、“十一五”國家科技支撐計(jì)劃（2006BAD27B04）及大連市青年科技人才基金（2007J23J H036）項(xiàng)目。

侯丹丹（1986—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：劉袖洞，教授；馬小軍，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail liuxd@dicp.ac.cn；maxj@dicp.ac.cn。