三種典型POPs對紫貽貝不同組織DNA損傷的比較研究

周海龍, 張林寶, 曲 瑩, 邵立娜 刁曉平, 鄭繼平, 薛欽昭

（1. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003; 2. 海南大學 農(nóng)學院, 海南 ?？?570228; 3. 中國科學院 研究生院, 北京 100049）

三種典型POPs對紫貽貝不同組織DNA損傷的比較研究

周海龍1,2,3, 張林寶1,3, 曲 瑩1,3, 邵立娜1, 刁曉平2, 鄭繼平2, 薛欽昭1

（1. 中國科學院 煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003; 2. 海南大學 農(nóng)學院, 海南 海口 570228; 3. 中國科學院 研究生院, 北京 100049）

采用彗星電泳技術(shù), 比較研究了Aroclor 1254、BaP、DDT三種典型POPs對紫貽貝（Mytilus edulis）鰓、性腺、消化腺細胞的DNA損傷效應(yīng)的差異, 以期為進一步評價這三種典型POPs遺傳毒理機制及其預(yù)警監(jiān)測提供科學依據(jù)。結(jié)果表明, Tail DNA%是評價DNA損傷的理想指標, 另外, 在急性毒性試驗中, 這三種POPs對紫貽貝鰓、性腺、消化腺細胞的DNA損傷作用均存在顯著時間-劑量-效應(yīng)關(guān)系,其中, BaP的DNA損傷作用最大, 鰓和消化腺細胞對毒性作用較敏感。同時, 對不同組織細胞的敏感性差異原因及其在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用進行了探討。

POPs; 紫貽貝（Mytilus edulis）; 彗星電泳; DNA損傷

持久性有機污染物（Persistent Organic Pollutants,POPs）是指具有高毒性、持久性、生物蓄積性、半揮發(fā)性及長距離遷移性等特性的天然或人工合成的有機污染物[1]。可通過空氣、水、土壤、食物鏈傳播, 甚至還能經(jīng)母乳傳遞給嬰兒[2]。近年來我國海域環(huán)境污染日益嚴重, 據(jù)王泰等[3]報道: Aroclor 1254、苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene, BaP）、滴滴涕（Dichlorodiphenyltrichloroethane, DDT）在我國屬于三種典型POPs。這三種典型POPs同時還屬于環(huán)境雌激素[4], 具有較強的“三致效應(yīng)”, 對中樞神經(jīng)、血液、淋巴細胞等也具有損害作用[5]。而紫貽貝對POPs有極高的富集作用, 是一種重要的指示生物[6]。因此, 研究這三種典型POPs對紫貽貝不同組織的遺傳毒性作用, 對于理解POPs毒理機制具有重要意義。

彗星電泳（Comet assay）又稱單細胞凝膠電泳（Single-Cell Gel Electrophoresis, SCGE）, 最早由Singh等[7]于1988年建立的一種檢測DNA遺傳損傷的技術(shù);該技術(shù)靈敏、簡便、快速及樣品用量少、無放射性等優(yōu)點, 已廣泛應(yīng)用于DNA損傷、細胞凋亡、生態(tài)毒理等領(lǐng)域。本文探索改進彗星電泳條件, 研究三種典型POPs對紫貽貝不同組織的 DNA遺傳損傷作用, 為海洋動物保護、種群繁衍及預(yù)警檢測打下一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

DYY-6C型電泳儀（北京六一儀器廠）; Olympus IX81熒光倒置顯微鏡（Olympus公司）。

低熔點瓊脂糖凝膠、吖啶橙（Acridine orange, AO）為 Promega公司生產(chǎn); Tris、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide, DMSO）、曲拉通 X-100 （Triton X-100）、均為上海生工生物有限公司分裝, 美國 Amresco公司生產(chǎn); Aroclor 1254、BaP、DDT、臺盼蘭均為Sigma公司生產(chǎn), 上海生工生物有限公司分裝; 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 紫貽貝及其訓養(yǎng)

紫貽貝采自煙臺四十里灣海域, 挑選健康、活力強的個體, 體長（7 cm±1.5 cm）。實驗前馴養(yǎng)7 d, 訓養(yǎng)期間飼喂小球藻（2次/d）。

1.3 實驗設(shè)計

實驗容器為20 L聚乙烯桶, 在桶中加入10 L過濾海水, 然后用保鮮膜封口減少水分揮發(fā), 維持POPs濃度。POPs用DMSO配制成一定濃度的儲備液。根據(jù)預(yù)實驗和參考資料[8,9], 三種POPs高、中、低濃度分別設(shè)置為: 10、50、200 μg/L。每個試驗組隨機挑取15只紫貽貝進行實驗, 另隨機選取15只做為溶劑對照組（DMSO濃度為0.01%）, 在整個試驗過程中, 每天在固定時間投餌、換水各 1次。這三種POPs只有在高濃度第7天發(fā)現(xiàn)1～2只紫貽貝死亡。在第3、5、7天, 每個試驗組分別取3只紫貽貝解剖,分離細胞, 為彗星電泳作準備。

1.4 彗星電泳

彗星電泳方法參照Singh等[7]的方法并略加改進,采用自制微型電泳槽, 單層凝膠的方法。制膠前用0.5%臺酚藍染色法檢測細胞活力（≥85%）。30 μL細胞懸液與 0.7%的 200 μL低熔點瓊脂糖（LMA）混合,取其中80 μL低熔點瓊脂糖凝膠-細胞懸浮液鋪于自制微型電泳槽中, 每個樣品重復3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用CASP1.2.2軟件[10]分析彗星圖像, Olive尾距（Olive tail moment, OTM）、尾部 DNA 含量（tail DNA%）是目前國際上普遍使用的評價指標, tail DNA%, 即尾部DNA熒光強度/（頭部DNA熒光強度＋尾部 DNA熒光強度）×100%。尾長反映了 DNA移動的距離, 尾距（TM）＝尾部重心至頭部重心距離×尾部DNA百分比。

用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行分析, 然后進行相關(guān)分析。最后采用用單因素方差和SNK-q法分析染毒組與溶劑對照組數(shù)據(jù)之間的差異。

2 結(jié)果

2.1 紫貽貝各組織細胞對POPs DNA損傷敏感性的分析

通過彗星電泳各指標間的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), tail DNA%、尾長、尾矩、Olive尾距4個指標間存在較高的相關(guān)性, 說明 CASP1.2.2軟件分析結(jié)果可靠。另外,tail DNA%是國際上普遍采用的評價指標, 不受單位影響, 因此本實驗利用它作為DNA損傷的評價標準。比較各劑量染毒組與溶劑對照組發(fā)現(xiàn)（見表1、2、3）: 除了第3天DDT低、中濃度組對性腺細胞和Aroclor 1254在低濃度組對消化腺細胞DNA損傷效果不顯著外, 其他試驗組對各組織細胞的DNA損傷均顯著（P＜0.01）。

2.2 不同POPs對紫貽貝各組織細胞DNA損傷的比較

不同POPs由于理化特性的差異, 毒性作用各不相同, 比較各劑量染毒組與溶劑對照組發(fā)現(xiàn)（表1、2、3）: 在 Aroclor 1254、BaP、DDT 這三種 POPs中, BaP各劑量組與對照組的DNA損傷均顯著; 而在第3天時, DDT低、中濃度對性腺細胞的 DNA損傷較小,Aroclor 1254對消化腺細胞DNA損傷較小, 未達顯著水平（P＜0.01）。因此, 可以看出這 3種 POPs中,BaP對紫貽貝各組織細胞 DNA損傷作用最強, 而Aroclor 1254、DDT對紫貽貝各組織的DNA損傷作用相對較?。▓D1）。

圖 1 三種 POPs暴露后第 5天分別對紫貽貝鰓細胞的DNA損傷作用（各POPs濃度均為10 μg/L（200×））Fig. 1 The DNA damage of blue mussel gill exposed to three POPs at the fifth day

3 討論

3.1 彗星電泳技術(shù)的改進

雖然彗星電泳具有很多優(yōu)點, 并在生態(tài)毒理學等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用, 但在高通量和標準化兩個方面仍需進一步改進: 前者可通過利用多孔彗星電泳載玻片來實現(xiàn)[11], 從而提高工作效率; 后者需要從彗星電泳的各個環(huán)節(jié)加以改進, 其中, 如何挑選具有代表性的彗星細胞, McAr等[12]指出應(yīng)采用系統(tǒng)隨機抽樣法（Systematic Random Sampling, SRS）, 所謂系統(tǒng)隨機法就是從某個點開始進行取樣, 沿著“Z”字形進行取樣。另外, 在分析具體某個彗星圖像時,Ritter等[11]指出應(yīng)對彗星各參數(shù)標準化, 包括彗星的寬度、形狀、頭部的位置等。目前, 國際上普遍采用tail DNA%、OTM 作為評價指標。本實驗通過對尾部DNA含量、尾長、尾矩、Olive尾距這四個指標進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)它們之間存在較高的相關(guān)性,

并且 Olive尾距與其他指標的相關(guān)系數(shù)最大, 與Kumaravel等[13]研究結(jié)果一致; 另外, 由于 Olive尾距有單位, 且不同圖像分析系統(tǒng)給出的值不同, 而tail DNA% 可以很好克服這一問題; 因此, 本實驗采用tail DNA%來指示DNA遺傳損傷, 取得了理想的效果。

表1 第3天三種POPs對紫貽貝各組織細胞DNA的損傷（n=100,±SD）Tab. 1 The DNA damage of three blue mussel tissues exposed to three POPs at the 3rd day （n=100,±SD）

表1 第3天三種POPs對紫貽貝各組織細胞DNA的損傷（n=100,±SD）Tab. 1 The DNA damage of three blue mussel tissues exposed to three POPs at the 3rd day （n=100,±SD）

注: A、B、D分別表示Aroclor 1254、BaP、DDT, SD表示標準差; *: 表示在0.01水平顯著, 下同

尾部DNA%（Tail DNA %）組別 POPs 鰓細胞 性腺細胞 消化腺細胞溶劑對照 1.54±0.40 1.44±0.55 1.81±0.77 A 3.75±1.30* 1.87±0.59* 2.16±0.73 B 8.04±1.91* 4.51±0.71* 6.54±1.10*低濃度D 2.81±0.62* 1.35±0.46 2.50±0.34*A 5.64±0.80* 2.86±0.57* 4.91±0.78*B 11.77±1.94* 5.72±2.03* 10.97±1.74*中濃度D 4.43±0.69* 1.73±0.87 3.95±1.00*A 12.54±1.40* 5.65±0.99* 9.44±1.62*B 22.88±2.33* 9.06±1.88* 19.15±1.43*高濃度D 10.40±1.63* 4.89±0.67* 8.30±1.14*

表2 第5天三種POPs對紫貽貝各組織細胞DNA的損傷（n=100,±SD）Tab. 2 The DNA damage of three blue mussel tissues exposed to three POPs at the 5th day （n=100,±SD）

表2 第5天三種POPs對紫貽貝各組織細胞DNA的損傷（n=100,±SD）Tab. 2 The DNA damage of three blue mussel tissues exposed to three POPs at the 5th day （n=100,±SD）

尾部DNA%（Tail DNA %）組別 POPs 鰓細胞 性腺細胞 消化腺細胞溶劑對照 3.86±0.57 2.80±0.47 3.89±0.72 A 15.37±1.23* 7.15±1.10* 10.37±1.83*B 17.93±2.65* 10.51±2.37* 14.33±2.50*低濃度D 14.19±1.53* 7.04±1.05* 13.43±2.07*A 18.09±1.61* 9.45±1.29* 13.85±1.26*B 24.92±3.17* 20.14±3.42* 22.70±3.31*中濃度D 19.70±1.46* 10.75±1.24* 18.98±1.35*A 19.43±2.31* 11.44±1.11* 16.61±1.28*B 39.05±1.96* 30.86±2.33* 36.35±2.56*高濃度D 25.19±1.10* 17.3±1.75* 23.39±1.99*

表3 第7天三種POPs對紫貽貝各組織細胞DNA的損傷（n=100,±SD）Tab. 3 The DNA damage of three blue mussel tissues exposed to three POPs at the 7th day （n=100,±SD）

表3 第7天三種POPs對紫貽貝各組織細胞DNA的損傷（n=100,±SD）Tab. 3 The DNA damage of three blue mussel tissues exposed to three POPs at the 7th day （n=100,±SD）

尾部DNA%（Tail DNA %）組別 POPs 鰓細胞 性腺細胞 消化腺細胞溶劑對照 7.23±1.80 6.24±1.01 7.42±1.30 A 21.32±1.95* 11.42±1.21* 16.94±1.66*B 27.29±1.75* 18.04±1.74* 24.65±1.24*低濃度D 19.21±1.37* 13.38±2.54* 16.26±2.82*A 28.45±2.23* 24.84±3.01* 25.12±2.98*B 30.03±3.47* 31.38±3.06* 31.74±2.47*中濃度D 29.22±1.64* 26.12±3.08* 28.17±2.59*A 39.56±2.11* 32.32±2.51* 37.47±2.83*B 44.43±2.43* 34.89±1.58* 40.12±2.61*高濃度D 38.83±1.81* 30.83±2.80* 36.83±3.23*

3.2 紫貽貝各組織細胞 DNA損傷敏感性的分析

POPs可通過接觸、呼吸、消化等多種途徑進入海洋動物體內(nèi), 從而對各組織產(chǎn)生毒性效應(yīng)。大量研究表明, 海洋動物不同組織對同種或不同 POPs的 DNA損傷的敏感性不同, Rigonato等[9]利用彗星電泳研究甲磺酸甲酯（Methylmethane Sulfonate,MMS）對河蜆（Corbicula fluminea）血淋巴細胞、鰓細胞、消化腺細胞DNA損傷作用, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)血淋巴細胞、消化腺細胞較敏感, 而鰓細胞DNA損傷具有較高的背景值。但在本實驗中, 鰓細胞DNA損傷也很敏感, 這可能是因為鰓直接暴露于環(huán)境中, 不同環(huán)境影響了敏感性。各組織的敏感性差異原因主要有:①POPs進入海洋動物體內(nèi)可通過接觸、呼吸、食物等途徑, 而鰓直接與海水接觸, 最早受到海水中POP的毒性作用, 因此鰓對 POPs的毒性作用較敏感[14]; ②不同組織細胞, 其細胞膜結(jié)構(gòu)以及 POPs代謝機制不同。其中消化腺是 POPs代謝和生物轉(zhuǎn)化酶的主要場所[15]; ③分子水平上, POPs毒理機制主要通過 AhR通道來進行調(diào)控[16], 研究表明 AhR通道基因在海洋動物不同組織的表達調(diào)控同樣具有差異性[17-18]。

另外, 從表1、2、3可以看出, POPs各試驗組與對照組差異顯著, 且隨著染毒濃度增大和染毒時間延長, DNA損傷作用顯著加劇。因此, 不同POPs對三種組織的DNA損傷作用存在顯著的時間-劑量-效應(yīng)關(guān)系, 與Ching等[19]報道結(jié)果一致。

目前, 關(guān)于海洋雙殼類動物性腺細胞DNA損傷研究較少, Ganguly等[20]研究了煙草提取物對翡翠貽貝（Perna viridis）雄性性腺細胞 DNA損傷作用,Jing-jing 等[21]研究了 BaP （0.5, 3, 10μg/L）對櫛孔扇貝（Chlamys farreri）性腺的遺傳毒性作用, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其暴露12 h后DNA斷鏈明顯增加。由于受精是在海水中完成的, 因此, 這將對海洋低等動物繁殖造成嚴重影響[22], 如 Bacchetta等[23]研究表明 DDT影響斑馬貽貝（Dreissena polymorpha）的繁殖性能, 導致雌性個體大量增加。因此, 開展相關(guān)研究對海洋動物種群保護及其繁衍具有重要價值。

3.3 紫貽貝組織敏感性在 POPs污染預(yù)警監(jiān)測方面的應(yīng)用

海洋雙殼類動物（紫貽貝、翡翠貽貝、牡蠣等）具有固著、底棲, 分布廣泛的特性; 另外, 彗星電泳條件簡單, 樣品量少, 周期短, 敏感性高。因此, 海洋雙殼類動物鰓、消化腺、血淋巴細胞已被廣泛應(yīng)用于評價DNA損傷及海洋環(huán)境監(jiān)測。Large, Shaw[24]和 Hamoutene等[25]利用紫貽貝鰓和消化腺細胞評價了BaP和石油烴的遺傳毒性作用。Rank等[26]利用紫貽貝鰓和血淋巴細胞進行了遺傳損傷研究; Siu Cao等[27]利用翡翠貽貝血淋巴細胞研究了BaP的遺傳毒性作用。這些研究表明, 海洋雙殼類動物鰓、消化腺和血淋巴細胞是理想的靶細胞, 本實驗結(jié)果進一步證實了這一點。

此外, 血淋巴細胞操作方便, 因此, 評價 POPs的遺傳毒性作用具有獨特優(yōu)勢[28-29]。但同時具有溫度依賴性[30], 檢測結(jié)果易受溫度影響, 因此, 在溫度變化較大的情況下, 鰓和消化腺比血淋巴細胞檢測效果更好。雖然彗星電泳在檢測DNA損傷和預(yù)警監(jiān)測環(huán)境污染方面具有靈敏、快速及樣品量少等特點, 但該方法缺乏特異性, 即無法知曉 DNA損傷效應(yīng)由何種POPs導致的, 因此, 為了更好地指示特種POPs污染, 需要借助于基因差異表達譜、微陣列等技術(shù)深入研究[31-32], 篩選特異分子標志物, 從而為海洋環(huán)境POPs預(yù)警監(jiān)測提供科學依據(jù)。

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Received: Mar., 29, 2010

Key words:POPs; Blue mussel（Mytilus edulis）; Comet assay; DNA damage

Abstract:In this article, we compared the DNA damage in blue mussel gill, gonad and digestive gland cells that were exposed to Aroclor1254、BaP and DDT by comet assay. The results show that tail DNA% was a perfect parameter for DNA damage. In addition, there were significant time- and dose-dependent damage to the gill, gonad and digestive gland cells of blue mussel. Furthermore, the toxic effect of BaP was much more than the other two POPs; and gill and digestive gland cells were much more sensitive than gonad cells for the POPs toxicity. We also discussed the reason underlining the toxic sensitivity of different tissues and the significance of monitoring POPs in marine ecosystem. The results are helpful for assessing the toxic effects and exploring the toxicological mechanism of POPs.

（本文編輯:康亦兼）

Comparative study of the DNA damage in three tissues of blue mussel （Mytilus edulis） after exposure to three typical POPs

ZHOU Hai-long1,2,3, ZHANG Lin-bao1,3, QU Ying1,3, SHAO Li-na1, DIAO Xiao-ping2,ZHEN Ji-ping2, XUE Qin-zhao1
（1. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China;2. Department of Biotechnology, College of Agriculture, Hainan University, Haikou 570228, China; 3.Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

X171.5

A

1000-3096（2011）02-0032-06

2010-03-29;

2010-09-10

中國科學院重大項目（KZCX2-YW-Q07-05, KZCX2-YWQ07-04）

周海龍（1977-）, 重慶人, 博士, 講師, 研究方向為海洋環(huán)境毒理學, 電話: 0898-66180255, E-mail: hlongzhou@gmail.com; 薛欽昭,通信作者, 0535-2109020; E-mail: qzxue@yic.ac.cn